馬宏達(dá)+崔亞玲+吳瓊

[摘要] 目的 通過(guò)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效面優(yōu)化法，考察肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏中主藥最佳配比。方法 選用預(yù)防凍傷小鼠足腫脹實(shí)驗(yàn)和預(yù)防凍傷大鼠局部激光多普勒血流灌注量實(shí)驗(yàn)作為藥效篩選模型，以肝素鈉、肌醇煙酸酯和促透劑氮酮為考察因素，以足腫脹抑制率和血流灌注量為藥效評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)（Design-Expert 7.0軟件）對(duì)肝素鈉、肌醇煙酸酯和促透劑氮酮進(jìn)行多因素多水平配伍實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)，根據(jù)二項(xiàng)式擬合方程繪制出的因素對(duì)指標(biāo)影響趨勢(shì)的二維等高線和三維效應(yīng)面圖，選擇最佳配伍比例組合。 結(jié)果 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法結(jié)果表明，肝素鈉、肌醇煙酸酯和氮酮均有一定的協(xié)同作用，試驗(yàn)優(yōu)選處方藥物的配比為：肝素鈉8000 U、肌醇煙酸酯200 mg和氮酮600 mg。 結(jié)論 此方法簡(jiǎn)便易行，預(yù)測(cè)性良好，提高了試驗(yàn)精度，為提高組合藥物的臨床有效性提供科學(xué)方法和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏；最優(yōu)配比；星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法

[中圖分類(lèi)號(hào)] R943 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）09（a）-0008-05

[Abstract] Objective To optimize formulation of Heparin and Inositol Nicotinate Cream by central composite design-response surface method. Methods The model of paw edema of mice and the blood flow of rats measured by laser Doppler flowmetry （LDF） were chosen as the pharmacodynamic screening index. With the amount of Heparin， Inositol Nicotinate and penetration enhancers azone were as independent variables， the swelling inhibition rate and the blood perfusion were as the comprehensive pharmacodynamic index. Design-Expert 7.0 software was used for the experimental value， and response surface methodology was used to optimize the Heparin， Inositol Nicotinate and azone using central composite design-response surface method. The prediction was carried out through comparing the observed and predicted with the two-dimension overlaying contour and the three-dimension response surfaces. Results Heparin， Inositol Nicotinate and Azone were proved to have synergistic effectsby central composite design-response surface method. Optimal formulaiton was as following： Heparin 8000 U， Inositol Nicotinate 200 mg and Azone 600 mg. Conclusion Central composite design-response surface methodology is convenient and highly predictive in optimizing formulation of Heparin and Inositol Nicotinate Cream， which can be offered in the scientific methods and experimentation.

[Key words] Heparin and Inositol Nicotinate Cream； Optimization； Central composite design-response surface method

近年來(lái)，大量研究表明肝素鈉和肌醇煙酸酯能通過(guò)不同機(jī)制緩解血管痙攣，改善末端血管微循環(huán)，具有提高機(jī)體對(duì)冷刺激耐受的新活性[1-5]。目前，肝素鈉和肌醇煙酸酯已有市售軟膏，用于防治凍傷，但兩者長(zhǎng)期過(guò)量單獨(dú)使用，均有潛在的副作用。通過(guò)前期工作發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)合用藥提高機(jī)體冷刺激耐受力具有協(xié)同作用，能有效降低毒副作用，提高藥效，且使用方法簡(jiǎn)便，易于全軍配發(fā)。故本研究從部隊(duì)實(shí)際需求出發(fā)，通過(guò)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化處方配比，擬開(kāi)發(fā)一種高效、低毒、便于部隊(duì)配發(fā)的復(fù)方抗寒乳膏，針對(duì)高寒地區(qū)衛(wèi)生勤務(wù)需求，具有很強(qiáng)的適用性，在一定程度上降低高寒地區(qū)指戰(zhàn)員因寒冷造成非戰(zhàn)斗減員，提高我軍高寒地域的作戰(zhàn)能力[6-7]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

冰柜（海爾電冰柜，BC/BD-272SE）；自制小鼠足體積測(cè)量?jī)x；激光多普勒儀（Perimed，PF5002，Periflux system 5000）；電子分析天平（120D型，北京島津公司）。

1.2 試藥

肌醇煙酸酯（天津中瑞藥業(yè)有限公司，批號(hào)：130702）；肝素鈉（河北常山生化藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：01130509，效價(jià)：199.4 U/mg）；輕質(zhì)液狀石蠟（湖南爾康制藥股份有限公司）；羊毛脂（上海洲輝羊毛脂有限公司）；白凡士林（包頭昆侖石化有限公司）；單硬脂酸甘油脂（湖南爾康制藥股份有限公司）；十六醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；司盤(pán)80（南京威爾化工有限公司）；氮酮（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；羥苯乙酯（臺(tái)山市新寧制藥有限公司）；聚山梨酯80（湖南爾康制藥股份有限公司）；以上試劑均為藥用標(biāo)準(zhǔn)或分析純；肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏（沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)藥藥劑科自制，每支20 g，批號(hào)：20140820、20140925、20141018）；水為純化水；其他試劑均為分析純。endprint

1.3 動(dòng)物

昆明種小鼠：雄性，6～8周，體重25～27 g，由沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科提供[合格證號(hào)：SCXK（京）2012-0001]；SD大鼠：雄性，45～60 d，體重180～200 g，由沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科提供[合格證號(hào)：SCXK（遼）2010-0001]；飼養(yǎng)環(huán)境：室溫20～25℃，濕度40%～60%，自由飲食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后用于實(shí)驗(yàn)。

2 方法與結(jié)果

本研究選用預(yù)防凍傷小鼠足腫脹實(shí)驗(yàn)和預(yù)防凍傷大鼠局部激光多普勒血流灌注量實(shí)驗(yàn)作為藥效篩選模型，以肝素鈉、肌醇煙酸酯和促透劑氮酮為考察因素，以足腫脹抑制率和血流灌注量為藥效評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用Design-Expert軟件中的星點(diǎn)設(shè)計(jì)法對(duì)各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行效果驗(yàn)證。

2.1 預(yù)防凍傷小鼠足腫脹實(shí)驗(yàn)

取健康昆明種小鼠170只，雌雄各半，按體重隨機(jī)分成17組，每組10只，分別為：模型組和16個(gè)不同配比給藥組。造模前1.5 h，除模型組外，其余各給藥組使用第1～16組乳膏均勻涂抹小鼠的四肢，1.5 h內(nèi)均勻涂抹2次。將小鼠放入-18℃冰柜中冷凍25 min，取出，造模完成。于給藥前和造模后4 h測(cè)量每只小鼠左、右后肢體積，記錄小鼠足腫脹程度并計(jì)算左、右后足腫脹之和的腫脹抑制率。

2.2 預(yù)防凍傷大鼠激光多普勒血流灌注量實(shí)驗(yàn)

取健康SD大鼠102只，雌雄各半，按體重隨機(jī)分成17組，每組6只，分別為：模型組和16個(gè)不同配比給藥組。造模前1.5 h，除模型組外，其余各給藥組使用第1～16組乳膏均勻涂抹大鼠的四肢，1.5 h內(nèi)平均涂抹2次。將大鼠放入-18℃冰柜中冷凍80 min，取出，造模完成。各組于給藥前和造模后4 h均采用激光多普勒灌注測(cè)量?jī)x測(cè)定右后足的血流灌注量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化方法

根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)的原理[8-10]，本試驗(yàn)對(duì)肝素鈉、肌醇煙酸酯和氮酮三個(gè)因素進(jìn)行考察，每個(gè)因素設(shè)五水平，用代碼值-α，-1，0，1，α（α=1.68）表示，因素水平詳見(jiàn)表1，試驗(yàn)安排如表2中1～16中肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏（20 g）各處方組成所示，結(jié)果詳見(jiàn)表2。

2.4 模型的預(yù)測(cè)、擬合與最優(yōu)處方配比

本研究分別以足腫脹抑制率Y1和血流灌注量Y2，肝素鈉X1、肌醇煙酸酯X2、氮酮X3為自變量，對(duì)各因素進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合[11-13]，多元線性回歸相關(guān)系數(shù)r約為0.6，其相關(guān)性較差，擬合度不佳，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的預(yù)測(cè)性較差，而二項(xiàng)式擬合的相關(guān)系數(shù)均大于0.98，擬合度較佳，得二項(xiàng)式方程為：

Y1 = 68.03+8.84X1+1.82X2+2.44X3+2.27X1X2+5.00X1X3+2.28X2X3-6.86X12-4.11X22-6.42X32（P < 0.01，r = 0.98）。

Y2 = 53.15+5.55X1+1.97X2+1.26X3+1.70X1X2+3.27X1X3+2.45X2X3-5.89X12-3.01X22-4.68X32（P < 0.01，r = 0.97）。

2.5 效應(yīng)面分析

根據(jù)優(yōu)化后的二項(xiàng)式擬合方程，把因變量與兩個(gè)因素?cái)M合為三維曲面圖，應(yīng)用Design-Expert 7.0軟件做出三維效應(yīng)圖，從而在效應(yīng)面最佳區(qū)域上選取相應(yīng)因素的較佳水平作為試驗(yàn)條件[14-15]，三維效應(yīng)面圖和等高線圖詳見(jiàn)圖1～6。

從足腫脹實(shí)驗(yàn)輸出結(jié)果可知，肝素鈉、肌醇煙酸酯和氮酮均P < 0.05，說(shuō)明三者對(duì)冷凍后足腫脹均有良好的抑制作用，且肝素鈉P < 0.01，說(shuō)明肝素鈉作用更顯著。從響應(yīng)面和等高線圖可以看出，肝素鈉和肌醇煙酸酯有一定的藥物協(xié)同作用，量效存在平臺(tái)現(xiàn)象；肝素鈉濃度低時(shí)，藥效隨氮酮濃度先升后降。肝素鈉濃度高時(shí)，藥效隨氮酮濃度升高，也具有一定的協(xié)同作用。

從大鼠足部血流灌注量實(shí)驗(yàn)輸出結(jié)果可知，肝素鈉、肌醇煙酸酯和氮酮均P < 0.01，說(shuō)明三者對(duì)冷凍后足部血流均有顯著的促進(jìn)作用，AB、AC和BC均P < 0.05，三者之間均有一定的協(xié)同作用。從響應(yīng)面和等高線圖可以看出，肝素鈉和肌醇煙酸酯有較強(qiáng)的藥物協(xié)同作用，藥效隨藥物濃度的增加均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。

通過(guò)足腫脹和血流量實(shí)驗(yàn)的等高線圖，選取肝素鈉、肌醇煙酸酯和氮酮藥效較佳范圍為6500～8500 U、肌醇煙酸酯200～300 mg、氮酮500～650 mg，考慮到肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏制劑的穩(wěn)定性、有效性和安全性等因素，及結(jié)合生產(chǎn)成本和可操作性等實(shí)際條件，最終試驗(yàn)選取處方（20 g）藥物的較佳配比為：肝素鈉8000 U，肌醇煙酸酯200 mg和氮酮600 mg。

3 討論

在乳膏劑的處方中，氮酮為目前使用較多的促透劑，用量小，無(wú)毒且對(duì)皮膚的刺激性很低，對(duì)親水性或疏水性化合物均有較強(qiáng)的透皮吸收促進(jìn)作用，通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)氮酮對(duì)不同藥物的透皮吸收影響不同、其用量并非越高越好，故本實(shí)驗(yàn)除了篩選主藥的最優(yōu)配比外，也考察了促透劑氮酮對(duì)試驗(yàn)藥物的最佳用量[16-20]。

本實(shí)驗(yàn)在處方篩選過(guò)程中，考慮過(guò)現(xiàn)在使用比較成熟的均勻設(shè)計(jì)和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，但這兩種實(shí)驗(yàn)的精度不夠，選擇的試驗(yàn)取值僅僅是接近最佳取值，無(wú)法精確找到最佳點(diǎn)；條件優(yōu)選憑經(jīng)驗(yàn)，不能靈敏地考察各因素間的交互作用等等。鑒于以上問(wèn)題，最后選擇了國(guó)內(nèi)外近半年來(lái)常用集數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法于一體的星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)優(yōu)面法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)[21-24]，它具有試驗(yàn)次數(shù)小，試驗(yàn)精度高等特點(diǎn)，它通過(guò)描繪效應(yīng)考察因素的效應(yīng)面，從效應(yīng)面上選擇較佳的效應(yīng)區(qū)，從而回推出自變量取值范圍，即最佳實(shí)驗(yàn)條件，適用于本實(shí)驗(yàn)。

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（收稿日期：2017-04-27 本文編輯：蘇 暢）endprint