茹廣欣，周霜晴，朱秀紅，劉小囡，王鋆瑞

(河南農(nóng)業(yè)大學林學院，河南 鄭州 450002)

白花泡桐莖和葉差異表達的cDNA-SRAP分析

茹廣欣，周霜晴，朱秀紅，劉小囡，王鋆瑞

(河南農(nóng)業(yè)大學林學院，河南 鄭州 450002)

以白花泡桐莖和葉為材料，利用cDNA-SRAP分子標記技術，對其進行基因表達的差異分析。從64對引物中篩選出25對擴增效果較好的引物對進行擴增，檢測得到36個差異片段，2次PCR擴增重復率為66.8%。經(jīng)挑選回收、克隆和測序，最終測得23條差異片段序列，長度主要在400～1 700bp之間。經(jīng)BLASTX進行比對和功能分析，16條與已知功能基因有較高同源性，包含能量與代謝(34.78%)、蛋白質(zhì)合成(8.70%)、細胞壁相關(4.35%)、信號傳導與脅迫響應(8.70%)及復合影響(13.04%)等多個方面；7條與未知功能基因序列有較高同源性。

cDNA-SRAP；白花泡桐；差異片段；功能分析

泡桐是一種重要的速生經(jīng)濟林木，原產(chǎn)于中國，在林業(yè)經(jīng)濟中占有重要地位。研究其木材形成過程中的各項生長機制、生理變化、以及基因分子層面探索等，可以為泡桐林木生長發(fā)育探索提供有效數(shù)據(jù)。張云嶺等[1]通過在不同種源泡桐試材中對全干密度進行測定、對比及分析，得到其差異顯著的結果。茹廣欣等[2]對泡桐不同無性系木材的木材干縮性、纖維長、纖維寬、木材顏色等性狀進行了研究，表明其間也存在顯著差異。鄧敏捷等[3]在不同鹽濃度下研究不同泡桐間生理生態(tài)的響應特征，并比較其耐鹽性。此外，近年來，也有學者以轉(zhuǎn)錄組測序方式對泡桐進行比對研究[4-5]。但這些研究多偏重于不同泡桐間生理或分子的表達情況，對泡桐器官組織間基因表達量差異的研究尚未見報導，探究植物器官組織間差異表達基因，可以更有效地探索植物在生長發(fā)育過程中器官生長發(fā)育調(diào)控作用基因及特異表達的機理。cDNA-SRAP分子標記技術是一種以cDNA為模板條件下，進行SRAP擴增的轉(zhuǎn)錄基因組學的研究方法。自此方法出現(xiàn)以來，已多次應用在植物上。喬燕春等[6]按照其在枇杷屬植物上建立的SRAP反應體系，對山楂的果肉、種核和種子進行基因表達差異分析，獲得了較為清晰的差異條帶。劉娟等[7]對不同類型大黃進行差異分析，得到這些差異基因主要與植物信號轉(zhuǎn)導、物質(zhì)轉(zhuǎn)運及抗逆性有關。郭丹丹等[8]用60對引物篩選出與紅花苞葉刺相關的基因片段，證實其可能參與了紅花刺性狀的形成，為紅花無刺品種的選育工作提供了重要方向。近期在動物研究上也證實此分子標記行之有效[9-10]。作為一個研究差異表達基因的重要手段，其簡便、重復性好、試驗成本低，已被廣泛應用[11]。但該技術在泡桐基因差異表達上尚未見實施，本試驗采用cDNA-SRAP技術嘗試對白花泡桐莖和葉進行差異分析，以期在分子層面上了解泡桐組織器官生長發(fā)育過程中的基因表達情況，為泡桐分子機理研究提供參數(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料取自河南農(nóng)業(yè)大學三區(qū)試驗田，所選材料為白花泡桐幼莖和幼葉，于液氮條件下取材速凍，并帶回實驗室保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

將組織樣品分別在液氮中充分研磨后，按照Total RNA Exractor(Trizol)試劑盒SK1312(生工生物工程(上海)股份有限公司)說明書步驟進行RNA抽提，利用分光光度計分析所提取的RNA濃度，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進行質(zhì)量檢測，觀察28S rRNA和18S rRNA的比值及RNA的完整性。采用AMV反轉(zhuǎn)錄酶，Oligo dT和隨機引物(生工生物工程(上海)股份有限公司)混合反轉(zhuǎn)錄引物，按照SK2445試劑盒操作說明進行cDNA第一鏈的合成。

1.3 PCR擴增及反應檢測

PCR反應體系為10×Buffer(含Mg2+)2.5 μL，cDNA模板0.5 μL，dNTP 2.5 mmol·L-11 μL，Taq DNA polymerase 5 U·μL-10.2 μL，F(xiàn)orward primer 10 nmol·L-10.5 μL，Reverse primer 10 nmol·L-10.5 μL，加雙蒸H2O至25 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，36 ℃復性45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃修復延伸10 min，4 ℃終止反應保存。將PCR產(chǎn)物(10 μL)加在2%瓊脂糖凝膠點樣孔，在110 V電壓、196 mA電流下進行電泳約1.5 h。電泳液為TAE緩沖液。

1.4 差異片斷的回收、克隆、測序

在瓊脂糖凝膠上找到兩次PCR擴增重復性、特異性較好的差異條帶，參照SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)進行切膠回收，以此回收片斷為模板，使用相同的SRAP引物，在相同體系程序條件下進行2次PCR擴增，并將此次所得PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測回收片斷是否為目的條帶，進而將回收產(chǎn)物與pMD18-T載體(寶生物工程(大連)有限公司)連接，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞中，經(jīng)過藍白斑篩選，挑選陽性克隆測序。

1.5 測序結果同源性比對分析

測序結果序列通過NCBI網(wǎng)站進行BLAST比對分析。

2 結果與分析

2.1 白花泡桐莖和葉RNA的提取

提取的RNA經(jīng)分光光度計檢測，OD260/OD280的值為1.9～2.0。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳圖(圖1)顯示，28S rRNA和18S rRNA兩條條帶清晰完整，無拖尾現(xiàn)象，且28S rRNA條帶亮度約為18S rRNA條帶亮度的2倍，說明提取的RNA可以進行后續(xù)試驗。

M:DNA marker;1，莖;2，葉。M:DNA marker;1，Stems;2，Leaves.

2.2 白花泡桐莖和葉的cDNA-SRAP差異顯示

通過對預試驗64對引物的檢驗，篩選出25對擴增效果較好、條帶清晰的引物進行后續(xù)試驗(表1)。以白花泡桐莖和葉不同組織類型的逆轉(zhuǎn)錄第一條鏈為模板，通過進行2次SRAP擴增分析，從中篩選出23條有明顯差異表達的條帶，擴增長度主要在400～1 700 bp(圖2)，2次PCR擴增重復率為66.8%。得到的差異片段有只在其中1個模板上單獨表達的片段，也有兩模板之間較為明顯表達量差異條帶，其中葉特異表達序列6個，莖特異表達2個，2者之間表達量差異序列15個，推測其可能與莖和葉生長發(fā)育調(diào)控基因相關。

M:DNA marker; 1～7分別表示引物組合:F1R3、F1R4、F3R1、F3R2、F3R3、F4R3、F4R4。M:DNA marker; 1～7 show the primer combinations :F1R3、F1R4、F3R1、F3R2、F3R3、F4R3、F4R4.

編號Primercode正向引物(5’-3’)Forwardprimers(5’-3’)反向引物(5’-3’)Reverseprimers(5’-3’)F1R3TGAGTCCAAACCGGAGCGACTGCGTACGAATTGGTF1R4TGAGTCCAAACCGGAGCGACTGCGTACGAATTGTGF2R1TGAGTCCAAACCGGACGGACTGCGTACGAATTGCAF2R2TGAGTCCAAACCGGACGGACTGCGTACGAATTGACF2R3TGAGTCCAAACCGGACGGACTGCGTACGAATTGGTF3R1TGAGTCCAAACCGGATAGACTGCGTACGAATTGCAF3R2TGAGTCCAAACCGGATAGACTGCGTACGAATTGACF3R3TGAGTCCAAACCGGATAGACTGCGTACGAATTGGTF4R3TGAGTCCAAACCGGAATGACTGCGTACGAATTGGTF4R4TGAGTCCAAACCGGAATGACTGCGTACGAATTGTGF5R2TGAGTCCAAACCGGGAGGACTGCGTACGAATTGACF6R2TGAGTCCAAACCGGGGAGACTGCGTACGAATTGACF6R3TGAGTCCAAACCGGGGAGACTGCGTACGAATTGGTF7R2TGAGTCCAAACCGGGCTGACTGCGTACGAATTGACF7R3TGAGTCCAAACCGGGCTGACTGCGTACGAATTGGTF7R4TGAGTCCAAACCGGGCTGACTGCGTACGAATTGTGF8R3TGAGTCCAAACCGGGTCGACTGCGTACGAATTGGTF9R2TGAGTCCAAACCGGTACGACTGCGTACGAATTGACF10R3TGAGTCCAAACCGGTCAGACTGCGTACGAATTGGTF11R4TGAGTCCAAACCGGTGTGACTGCGTACGAATTGTGF12R3TGAGTCCAAACCGGTTGGACTGCGTACGAATTGGTF13R3TGAGTCCAAACCGGCGGGACTGCGTACGAATTGGTF13R4TGAGTCCAAACCGGCGGGACTGCGTACGAATTGTGF15R4TGAGTCCAAACCGGCAAGACTGCGTACGAATTGTGF16R1TGAGTCCAAACCGGCTTGACTGCGTACGAATTGCA

2.3 差異條帶的回收、測序及序列分析

將重復性穩(wěn)定性好的差異條帶進行切膠回收，進行2次PCR擴增后，結果顯示所回收條帶為目的差異片斷(圖3)，通過產(chǎn)物與載體連接轉(zhuǎn)化之后，挑選陽性克隆測序，所得測序結果通過BLAST比對分析序列(表2)，結果顯示23條片段序列分為6類：蛋白質(zhì)合成相關基因、細胞壁生物合成與修飾相關基因、信號傳導與脅迫響應相關基因、能量與代謝相關基因、部分多重功能相關基因及未知功能基因[12-17](表3)。其中，1個是雙組分系統(tǒng)(F3R1J1000)，在植物應對外界環(huán)境刺激和生長調(diào)節(jié)的信號轉(zhuǎn)導過程中起重要作用；2個是關于細胞壁水解酶(F3R3Y700、F6R3Y1100)；1個是鈣離子依賴的蛋白激酶(F5R2Y400)調(diào)控信號通路；1個是氨酰tRNA合成酶(F6R3J600)；1個是光系統(tǒng)反應中心Ⅱ D2蛋白(F3R3Y1100)；1個是葉綠體AtpA(F7R4Y800)；1個是光反應中心A1脫輔基蛋白(F8R3Y600)；1個是半胱氨酸脫硫酶(F15R4Y1700)可能參與植物莖和葉的衰老過程。

M:DNA marker;A、B、C、D分別代表引物F1R3、F3R1、F3R3擴增出的部分差異片斷。M:DNA marker; A、B、C、D repectively represent partial differential fragments amplified by primers F1R3, F3R1, and F3R3.

編號Code序列長度/bpLengthofsequencesGenBank登錄號GenBank accessionNO. 相似序列 Similarsequence 物種 Species E值 Evalue F1R3Y11001196AAU10479.1PsbC,partial(chloroplast)Ipomopsisaggregata1e-49F3R1J10001038SDW06046.1Two-componentsystem,OmpRfamily,phosphateregulonsensorhistidinekinasePhoRHydrobacterpenzbergensis2e-133F3R3Y700752AGV54820.1Cellwall-associatedhydrolasePhaseolusvulgaris7e-77F3R3Y11001204ALN96514.1photosystemIIproteinD2(chloroplast)Castanopsisconcinna0.0F4R4J600684XP_013442963.1Senescence-associatedprotein,putativeMedicagotruncatula1e-110F5R2Y400397AHA61365.1Calcium-dependentproteinkinaseArachishypogaea7e-22F6R3J600628SDW23636.1Tryptophanyl-tRNAsynthetaseHydrobacterpenzbergensis9e-107F6R3Y11001253SDW74997.1AlphagalactosidaseAHydrobacterpenzbergensis0.0F7R2Y1000963YP_173415.1HypotheticalproteinNitaMp073Nicotianatabacum2e-36F7R2J550539XP_013442963.1Senescence-associatedprotein,putativeMedicagotruncatula1e-102F7R3Y11001211AAU10479.1PsbC,partial(chloroplast)Ipomopsisaggregata1e-49F7R4Y800780YP_009270897.1AtpA(chloroplast)Perillasetoyensis2e-163F8R3J800791AGC78890.1Hypotheticalprotein(mitochondrion)Viciafaba1e-103F8R3Y600593CCQ48570.2PhotosystemIP700chlorophyllaapoproteinA1Dicentraeximia1e-124F2R2J800773SDX40875.1RibonucleaseBN,tRNAprocessingenzymeHydrobacterpenzbergensis0.0F2R2J10001010WP_026769529.1HypotheticalproteinAsinibacteriumsp.OR530.0F2R3Y12001196AAU10479.1PsbC,partial(chloroplast)Ipomopsisaggregata1e-49F9R2J10001014WP_026769529.1HypotheticalproteinAsinibacteriumsp.OR530.0F10R3Y700678YP_001109497.1HypotheticalproteinPoptr_cp018Populustrichocarpa2e-40F12R3Y12001210AAU10479.1PsbC,partial(chloroplast)Ipomopsisaggregata1e-49F13R3J700694XP_013442971.1Senescence-associatedprotein,putative,partialMedicagotruncatula2e-104F13R4J800830XP_017630340.1UncharacterizedproteinGossypiumarboreum4e-153F15R4Y17001167SDX53024.1CysteinedesulfuraseHydrobacterpenzbergensis6e-148

表3 泡桐莖和葉差異表達基因的功能分類Table 3 Functional classification of genes expression in stems and leaves of Paulownia

3 結論與討論

對于他類可用于差異基因篩選的分子技術而言，cDNA-SRAP分子標記技術在同樣保持穩(wěn)定性好、條帶豐富的前提下，操作程序更為簡便，相對來說對儀器設施等要求亦不高，試驗成本更少；且試驗操作不僅適用于同種之間差異表達分析，同樣適用于不同種之間或者同一植株、不同組織之間等多個樣本同時差異分析，近年來已廣泛應用于基因差異表達研究上[18-20]。在本試驗過程中，為避免假陽性結果的過多出現(xiàn)，在嚴謹操作步驟、操作手法的同時，采取重復操作試驗措施，另外，由于試驗采用瓊脂糖凝膠電泳成像系統(tǒng)，以肉眼觀測來評判和篩選所得到的差異結果，存在一定主觀性，不能完整完善地獲取所有有效信息，這些皆是分子試驗中可能存在的弊端，在試驗操作中，可以與其他分子標記技術相結合的方式進行生物學信息探索。

本試驗以白花泡桐幼莖和幼葉為研究材料，采用cDNA-SRAP分子技術方法，來探究泡桐生長初期組織器官間的差異表達，最終獲得在白花泡桐莖和葉間的差異表達片段中16條與已知功能基因同源性比較高的序列和7條未知功能基因的序列，包含能量與代謝、蛋白質(zhì)合成、細胞壁相關、信號傳導與脅迫響應及復合影響等多個方面，推測這些基因可能參與泡桐莖和葉生長發(fā)育及調(diào)控過程，且部分基因在莖和葉組織器官間有明顯表達量差異，表明了cDNA-SRAP技術在對白花泡桐差異分析試驗上的可行性，從中獲得的生長調(diào)控相關基因可進一步用于生長機制分子機理研究，同時可擴大差異分析體系以檢測更多有效片段序列，為確定所得差異表達基因的準確相關性，使用Quantitative Real-time PCR或其他功能驗證進一步檢測確定結果。

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DifferentialexpressionanalysisofstemandleafinPaulowniafortuneibycDNA-SRAP

RU Guangxin，ZHOU Shuangqing，ZHU Xiuhong，LIU Xiaonan，WANG Yunrui

(College of Forestry，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China)

The stem and leaf ofPaulowniafortuneito analyze the differential gene expression with the method of cDNA-SRAP. Among the 64 pairs of primers, 25 pairs of primers were screened with good amplification effect, and 36 differential fragments were detected. The repetition rate of the two times PCR amplification was about 66.8%. After being selected, cloned, and sequenced, 23 fragments of the differential sequence were measured, and the length was between 400 and 1 700bp.According to the genomic database, sequence analysis showed that 16 fragments have significant homologous nucleotide sequence and 7 fragments with unknown function gene sequence has high homology.

cDNA-SRAP;Paulowniafortunei; differential fragments; functional analysis

2017-03-13

國家科技支撐計劃專題(2013BAD01B06)；大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃(1402103020)

茹廣欣(1963-)，男，河南洛陽人，教授，博士，主要從事為林木遺傳育種方面的研究。

朱秀紅(1966-)，女，河南信陽人，教授。

1000-2340(2017)04-0481-06

S 722

A

(責任編輯：李 瑩)