朱林靜，姚俊，魏欽俊，魯雅潔，曹新

南京醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院生物技術(shù)系，江蘇 南京 211166

研究報告

催乳素處理的乳腺癌T-47D細胞lncRNA和mRNA表達譜差異分析

朱林靜，姚俊，魏欽俊，魯雅潔，曹新

南京醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院生物技術(shù)系，江蘇 南京 211166

目的：觀察催乳素處理引起乳腺癌T-47D細胞中長鏈非編碼RNA（lncRNA）和mRNA表達譜的變化。方法：利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)檢測催乳素處理前后乳腺癌T-47D細胞中l(wèi)ncRNA和mRNA的表達譜；通過數(shù)據(jù)庫KEGG、GO富集對有差異表達且具有統(tǒng)計學意義的mRNA進行通路分析，得到mRNA參與的生物學途徑；運用熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)對部分差異表達的 lncRNA（lnc-AK4-2、XLOC_075541、XLOC_093371、XLOC_081110、XLOC_047068、XLOC_006637、XLOC_064063、XLOC_086865、XLOC_099517、XLOC_106798、lnc-ZNF639-1）進行驗證，并利用生物信息學方法預測其靶基因，通過數(shù)據(jù)庫KEGG、GO富集對差異lncRNA的靶基因進行通路分析。結(jié)果：分析得到3564個差異lncRNA和477個差異mRNA（差異倍數(shù)＞2，P＜0.05），差異表達的mRNA主要富集在134條不同的信號通路，其中包括催乳素/催乳素受體信號通路相關(guān)的MAPK信號通路、p53信號通路和JAK-STAT信號通路；選取的11條lncRNA的變化趨勢（XLOC_093371、XLOC_006637、XLOC_064063、XLOC_086865、lnc-ZNF639-1表達上調(diào)，lnc-AK4-2、XLOC_075541、XLOC_081110、XLOC_047068、XLOC_099517、XLOC_106798表達下調(diào)）經(jīng)qRT-PCR技術(shù)得到驗證；lncRNA靶基因富集的信號通路同樣包括MAPK信號通路。結(jié)論：催乳素處理前后T-47D細胞中l(wèi)ncRNA的表達存在明顯差異，為進一步研究與乳腺癌發(fā)病機制相關(guān)的關(guān)鍵lncRNA分子提供了基礎，并為尋找乳腺癌潛在的診療方法提供理論支持。

長鏈非編碼RNA；表達譜；乳腺癌；催乳素；T-47D細胞

乳腺癌是當今困擾女性健康的最普遍的癌癥之一，且其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，由于乳腺癌起病隱匿，部分乳腺癌患者檢出或確診時已屬中晚期，治療效果不甚理想，因此早期診斷、早期治療是提高生存率的關(guān)鍵[1]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種因素與乳腺癌有著密切關(guān)系。人催乳素（prolactin，PRL）是由腦垂體前葉分泌的由199個氨基酸殘基構(gòu)成的一種重要的多肽類生長激素，參與正常乳腺上皮的增生和分化[2]。有實驗報道PRL在乳腺癌變過程中發(fā)揮重要作用[3]。PRL以內(nèi)分泌、旁分泌及自分泌的方式與靶細胞膜表面的催乳素受體（PRL receptor，PRLR）結(jié)合并啟動相應的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導過程（如MAPK信號通路、p53信號通路和JAK-STAT信號通路等），從而發(fā)揮非常廣泛的生物學作用[4]。

近年來，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在腫瘤發(fā)生、遷移及抗藥性中作為調(diào)控因子和潛在治療因子被廣泛關(guān)注[5]。lncRNA由于缺少開放讀框而不具有編碼能力，因此一直以來被認為是轉(zhuǎn)錄噪音或克隆產(chǎn)物而很少受到關(guān)注[6]。但是，越來越多的實驗證據(jù)表明lncRNA在人體內(nèi)的異常表達與包括乳腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[7]。

本研究利用Illumina測序平臺檢測了催乳素處理前后T-47D細胞RNA的表達譜，并結(jié)合生物信息學分析了處理組與對照組lncRNA和mRNA的表達變化，得到一系列差異明顯且具有統(tǒng)計學意義（差異倍數(shù)＞2，P＜0.05）的 lncRNA和mRNA。從這些差異明顯的lncRNA中選擇了11個，利用熒光定量PCR對其表達差異情況進行驗證。同時，利用生物信息學方法對這11個lncRNA進行了靶基因預測，并對這些靶基因進行了生物功能分析，結(jié)果顯示催乳素處理前后T-47D細胞ln?cRNA和mRNA的表達變化可能與乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中催乳素受體信號通路相關(guān)。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng)與催乳素處理

乳腺癌T-47D細胞購于中國科學院上海細胞庫，由本實驗室保存，細胞在含10%胎牛血清（Hyclone公司）的RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司）中，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。催乳素處理T-47D細胞過程參照本實驗室之前的工作[8]，將生長密度為70%～80%的細胞分為對照組與處理組，對照組僅加完全培養(yǎng)基，處理組加入含150 μg/mL PRL的培養(yǎng)液，每組均設3個平行復孔，于37℃、5%CO2飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)24～48 h，提取細胞總RNA。

1.2 總RNA提取與cDNA合成

用TRIzol（Invitrogen公司）分別提取催乳素處理組與對照組T-47D細胞中的總RNA，紫外分光光度計測定D260nm和D280nm值，對總RNA進行定量；計算D260nm/D280nm值，結(jié)合甲醛變性凝膠電泳，分析RNA質(zhì)量。樣品中提取RNA的D260nm/D280nm值為1.8～2.0，經(jīng)甲醛變性膠電泳檢測有清晰的28S、18S條帶，無降解，且28S條帶亮度約是18S的1～2倍，則認為這些樣本的RNA可用于后續(xù)實驗。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測序

分別提取催乳素處理組與對照組T-47D細胞總RNA并用DNaseⅠ消化DNA后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA；加入打斷試劑在Thermo?mixer中將mRNA打斷成短片段，以打斷后的mRNA為模板合成單鏈cDNA，然后配制雙鏈合成反應體系合成雙鏈cDNA，用試劑盒純化回收、粘性末端修復、cDNA的3'端加上堿基“A”并連接接頭，然后進行片段大小選擇，最后進行PCR擴增；構(gòu)建的文庫經(jīng)Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System質(zhì)檢合格后，用Illumina HiSeq 2000測序儀測序。

1.4 實時熒光定量PCR

從變化倍數(shù)在2倍以上并有顯著差異（P＜0.05）的lncRNA分子中挑選11個進行Real-time PCR驗證。分別以催乳素處理組和對照組T-47D細胞的cDNA為模板，每條lncRNA引物由在線軟件 Primer 5（http://sourceforge.net/projects/primer5/）合成，并在NCBI中經(jīng)BLAST驗證，采用StepOneplus熒光定量PCR儀，SYBR Green熒光染料（Ta?KaRa公司）摻入法相對定量。以內(nèi)參GAPDH為參照，計算差異表達的倍數(shù)。

1.5 差異lncRNA與mRNA的生物信息學分析

為了尋找與lncRNA相互作用的mRNA，用2種不同的算法進行l(wèi)ncRNA靶基因預測。第一種算法是搜尋lncRNA順式作用基因，通過在線軟件UCSC（http://genome.ucsc.edu/）直接查找到的位于lncRNA位點上游或下游10 kb范圍內(nèi)轉(zhuǎn)錄的基因被認為是此lncRNA的順式作用基因[9]。第二種算法是尋找lncRNA反式作用基因，首先用BLAST比對找到在序列上有一定同源性的mRNA和lncRNA，然后利用mRNA和lncRNA的相關(guān)性對結(jié)果進行過濾，最后用RNAplex（一個用來尋找2條長鏈RNA之間短的相互作用的軟件）預測反義lncRNA與mRNA之間的互補結(jié)合[10]。

分別對預測得到的靶基因以及具有統(tǒng)計學意義的差異表達mRNA做進一步生物信息學分析，包括GO富集和KEGG通路分析。GO富集包括生物學過程、細胞組分、分子功能[11]。KEGG通路及GO富集分析由在線軟件DAVID（Database for Annotation，Visualization and Integrated Discov?ery，https://david.ncifcrf.gov/）完成。錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）用來表示P值的有效性。FDR＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義[12]。

2 結(jié)果

2.1 催乳素處理組與對照組lncRNA和mRNA表達模式

對轉(zhuǎn)錄組測序得到的原始數(shù)據(jù)進行清理，去除低表達量、無意義及未比對上的數(shù)據(jù)，再對數(shù)據(jù)進行標化，得到對照組樣品lncRNA和基因表達量整體的比較（圖1A），以及催乳素處理后樣品lncRNA和基因表達量整體的比較（圖1B），結(jié)果顯示該轉(zhuǎn)錄組測序檢測到的RNA信息基本全面，2組數(shù)據(jù)具有可比性。散點圖表示催乳素處理組與對照組之間RNA表達差異情況，紅色代表明顯上調(diào)的標簽，綠色代表明顯下調(diào)的標簽，中間藍色為差異不明顯的標簽（圖1C）。

此次轉(zhuǎn)錄本測序檢測到的2組樣品間差異明顯且具有統(tǒng)計學意義的lncRNA有3564條，其中586條為已知lncRNA，它們的信息可以從http://ln?cipedia.org/db/search獲得。為了進一步分析這些差異lncRNA，分別對它們的染色體位置和長度信息進行了整理，結(jié)果見圖1D和1E。

2.2 差異mRNA的GO和KEGG分析

對所有差異明顯且具有統(tǒng)計學意義的mRNA進行GO分析，篩選標準為q值＜0.05，得到這些差異表達mRNA分別在基因本體論三個功能方面的富集表達譜。圖2A、B和C為催乳素處理組和對照組比較所得差異mRNA的GO分析。結(jié)果顯示在生物學進程方面，差異mRNA顯著富集于16條通路（圖2A）；在細胞組件方面，差異mRNA顯著富集于9條通路（圖2B）；在分子功能方面，差異mRNA顯著富集于8條通路（圖2C）。

催乳素處理組與對照組差異mRNA的KEGG分析結(jié)果顯示，這些mRNA顯著富集于p53、JAKSTAT、MAPK等信號通路（圖2D），而這些信號通路與PRL/PRLR信號通路明顯相關(guān)。

2.3 差異lncRNA的定量驗證及其靶基因的功能富集分析

從催乳素處理T-47D細胞前后差異明顯且具有統(tǒng)計學意義的全部lncRNA分子中選取11條（5條上調(diào)，6條下調(diào)）（表1）進行實驗驗證，熒光定量結(jié)果顯示這11條差異lncRNA的表達變化與測序結(jié)果一致（圖3A）。對所選差異表達的lncRNA相關(guān)基因進行GO分析，結(jié)果顯示在生物學進程方面，相關(guān)基因顯著富集于8條通路（圖3B）；在細胞組件方面，相關(guān)基因顯著富集于2條通路（圖3C）；在分子功能方面，相關(guān)基因顯著富集于6條通路（圖3D）。對所選差異表達的lncRNA相關(guān)基因應用DAVID數(shù)據(jù)庫進行KEGG分析，發(fā)現(xiàn)其在PRL/PRLR相關(guān)的一條信號通路，即MAPK信號通路中顯著富集（圖3E）。

圖1 催乳素處理組與對照組lncRNA和mRNA表達譜差異分析

3 討論

轉(zhuǎn)錄組測序是指用新一代高通量測序技術(shù)對物種或組織的轉(zhuǎn)錄本進行測序并得到相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本信息，它的研究對象為特定細胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，包括mRNA和非編碼RNA[13]。本實驗采用的基于Illu?mina高通量測序平臺的轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)能夠在單核苷酸水平對任意物種的整體轉(zhuǎn)錄活動進行檢測。在分析轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)和表達水平的同時，還能發(fā)現(xiàn)未知轉(zhuǎn)錄本和稀有轉(zhuǎn)錄本，精確地識別可變剪切位點及SNP（編碼序列單核苷酸多態(tài)性），提供最全面的轉(zhuǎn)錄組信息[14]。另外，通過熒光定量PCR對轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進行隨機驗證，結(jié)果也證實了該測序手段的可靠性。在本實驗中，分別發(fā)現(xiàn)了3564和477個顯著差異的lncRNA和mRNA，這為后續(xù)探討乳腺癌發(fā)病機制及發(fā)病過程中的關(guān)鍵分子提供了寶貴的數(shù)據(jù)。

1977年，首次有報道指出催乳素對乳腺癌的發(fā)病機制和發(fā)展進程具有顯著作用[15]。許多研究報道指出催乳素是乳腺癌上皮細胞主要的分化因素[16-18]。LncRNA是一類缺乏編碼蛋白能力，位于細胞核或胞質(zhì)內(nèi)的非編碼RNA分子，已有大量研究表明[19-21]，lncRNA表達失調(diào)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。但是，至今仍未有關(guān)于催乳素介導的乳腺癌細胞中l(wèi)ncRNA異常表達的研究報道。在此，本文較深入地分析了催乳素處理前后T-47D細胞中l(wèi)ncRNA的表達情況，從而探討催乳素介導的通過催乳素受體信號通路對乳腺癌細胞中l(wèi)ncRNA表達的調(diào)控。通過對差異mRNA和差異lncRNA相關(guān)基因的KEGG分析，結(jié)果提示這些差異基因主要富集在催乳素/催乳素受體信號通路相關(guān)信號通路上，這可能歸因于催乳素的誘導表達。

圖2 催乳素處理組與對照組差異mRNA的GO和KEGG分析

表1 長鏈非編碼RNA的靶基因預測

總之，本文首次報道了催乳素處理乳腺癌T-47D細胞后RNA的差異表達譜，而這些差異RNA在乳腺癌中的生物功能及分子機制仍有待更深入的研究。同時，本實驗為進一步闡明由催乳素誘導表達引起的乳腺癌的發(fā)病機制，通過調(diào)控關(guān)鍵lncRNA尋找其新的藥物靶點提供了新的依據(jù)。

圖3 差異lncRNA的熒光定量PCR驗證及其靶基因的GO和KEGG分析

[1]范雅文,張旭.三陰乳腺癌的異質(zhì)性及靶向治療[J].生物技術(shù)通訊,2015,26(3):442-444.

[2]Carver K C,Arendt L M,Schuler L A.Complex pro?lactin crosstalk in breast cancer:new therapeutic im?plications[J].Mol Cell Endocrinol,2009,307(1):1-7.

[3]Tworoger S S，Hankinson S E．Prolactin and breast cancer risk[J].Cancer Lett,2006,243(2):160-169.

[4]譚敦勇,彭湘萍.催乳素受體研究[J].生理科學進展,2012,43(1):17-23.

[5]馮維熙,曹新.基于目標基因芯片數(shù)據(jù)預測lncRNAs調(diào)控腦缺血再灌注損傷后的作用效應[J].生命科學研究，2016,20(3):235-242.

[6]Chen J,Fu Z Y,Ji C,et al.Systematic gene microar?ray analysis of the lncRNA expression profiles in hu?man uterine cervix carcinoma[J].Biomed Pharmacoth?er,2015,72:83-90.

[7]Brunner A L,Beck A H,Edris B,et al.Transcription?al profiling of long non-coding RNAs and novel tran?scribed regions across a diverse panel of archived hu?man cancers[J].Genome Biol,2012,13(8):1-13.

[8]Wei Q J,He W,Yao J,et al.Identification and char?acterization of microRNAs expressed in human breast cancer T-47D cells in response to prolactin treatment by Solexa deep-sequencing technology[J].Biochem Bio?phys Res Commun,2013,432(3):480-487.

[9]Han L,Zhang K,Shi Z,et al.LncRNA profile of glio?blastoma reveals the potential role of lncRNAs in con?tributing to glioblastoma pathogenesis[J].Int J Oncol,2012,40(6):2004-2012.

[10]Tafer H,Hofacker I L.RNAplex:a fast tool for RNARNA interaction search[J].Bioinformatics,2008,24(22):2657-2663.

[11]Lin X C,Zhu Y,Chen W B,et al.Integrated analy?sis of long non-coding RNAs and mRNA expression profiles reveals the potential role of lncRNAs in gas?tric cancer pathogenesis[J].Int J Oncol,2014,45(2):619-628.

[12]Kanehisa M,Goto S.KEGG:kyoto encyclopedia of genes and genomes[J].Nucleic Acids Res,2000,28(1):27-30.

[13]Zhu L,Mok S,Imwong M,et al.New insights into the Plasmodium vivax transcriptome using RNA-Seq[J].Sci Rep,2016,6:20498.

[14]Huang X,Jing Y,Liu D J,et al.Whole-transcrip?tome sequencing of Pinellia ternata using the Illumina platform[J].Genet Mol Res,2016,15(2):gmr.15028062.

[15]Welsch C W,Nagasawa H.Prolactin and murine mam?mary tumorigenesis:a review[J].Cancer Res,1977,37(4):951-963.

[16]Liu F,Pawliwec A,Feng Z,et al.Prolactin/Jak2 di?rects apical/basal polarization and luminal linage matu?ration of mammary epithelial cells through regulation of the Erk1/2 pathway[J].Stem Cell Res,2015,15(2):376-383.

[17]Kobayashi K,Tsugami Y,Matsunaga K,et al.Prolac?tin and glucocorticoid signaling induces lactation-spe?cific tight junctions concurrent with beta-casein ex?pression in mammary epithelial cells[J].Biochim Bio?phys Acta,2016,1863(8):2006-2016.

[18]Medina-Estrada I,Alva-Murillo N,Lopez-Meza,et al.Non-classical effects of prolactin on the innate im?mune response of bovine mammary epithelial cells:Im?plications during Staphylococcus aureus internalization[J].Microb Pathog,2015,89:43-53.

[19]Jiang J F,Sun A J,Xue W,et al.Aberrantly ex?pressed long noncoding RNAs in the eutopic endome?tria of patients with uterine adenomyosis[J].Eur J Ob?stet Gynecol Reprod Biol,2016,199:32-37.

[20]Chen Y,Wu J J,Lin X B,et al.Differential lncRNA expression profiles in recurrent gliomas compared with primary gliomas identified by microarray analysis[J].Int J Clin Exp Med,2015,8(4):5033-5043.

[21]Zhan Y,Lin J,Liu Y,et al.Up-regulation of long non-coding RNA PANDAR is associated with poor prognosis and promotes tumorigenesis in bladder cancer[J].J Exp Clin Cancer Res,2016,35(1):83.

Comprehensive Investigation on the Expression Profiles of Long Noncoding RNAs and mRNAs in Breast Cancer T-47D Cells Treated with Prolactin

ZHU Lin-Jing,YAO Jun,WEI Qin-Jun,LU Ya-Jie,CAO Xin*
Department of Biotechnology,School of Basic Medical Science,Nanjing Medical University,Nanjing 211166,China

Objective:To analyze the variation of long non-coding RNA（lncRNA） and mRNA expression pro?files in breast cancer T-47D cells after they were treated with prolactin（PRL）.Methods:RNA-seq was used to detect the lncRNA and mRNA expression profile in T-47D cells before and after PRL treatment.The statistically differential expressed mRNA were selected for Gene ontology（GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）pathway.Quantitative real-time PCR（qRT-PCR）was used to validate the 11 differentially expressed ln?cRNA,and their target genes were predicted by bioinformatcs,and biological pathways those genes involved in were analyzed by GO and KEGG.Results:3564 lncRNA and 477 mRNA were detected with varied expression（fold＜0.5 or ＞2.0,P＜0.05） in T-47D cells.GO and KEGG analysis indicated that these differentially expressed mRNA were mainly implicated in 134 pathways,of which the MAPK signaling pathway,p53 signaling pathway and JAK-STAT signaling pathway were included in the PRL/PRL receptor（PRLR） signaling pathway.The qRTPCR analysis of 11 selected lncRNA（XLOC_093371,XLOC_006637,XLOC_064063,XLOC_086865,lnc-ZNF639-1 up-regulated;lnc-AK4-2,XLOC_075541,XLOC_081110,XLOC_047068,XLOC_099517,XLOC_106798 downregulated）confirmed the results of RNA-seq,and their targets are also enriched in the MAPK signaling pathway.Conclusion:Significant variation of lncRNA expression in T-47D cells was detected before and after PRL treat?ment,which may provide a useful database for further investigation on lncRNA' function and mechanism in breast cancer,and contribute to find potential diagnostic and therapeutic targets for breast carcinoma.

long non-coding RNA;expression profile;breast cancer;prolactin;T-47D cells

Q78;Q811.4

A

1009-0002（2017）05-0577-07

10.3969/j.issn.1009-

*Corresponding author,E-mail:caoxin@njmu.edu.cn

2017-03-01

國家自然科學基金（81172142）；國家自然科學基金青年基金（51403103）

朱林靜（1991- ），女，碩士研究生，（E-mail）1115020628@qq.com；姚俊（1979- ），男，講師；二者為并列第一作者

曹新，（E-mail）caoxin@njmu.edu.cn