于芳，金蕊，黃君健

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850

核糖核酸酶A在端粒免疫熒光原位雜交實驗中的應(yīng)用

于芳，金蕊，黃君健

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850

目的：在端粒免疫熒光原位雜交實驗中，降低核仁著色對端粒圖像清晰度的影響。方法：分別將0.1、0.2、0.4 mg/mL的核糖核酸酶（RNase）A與待檢標(biāo)本于37℃消化過夜，然后進(jìn)行端粒原位雜交實驗。結(jié)果：0.4 mg/mL RNase A可以消除HepG2細(xì)胞端粒原位雜交時的非特異結(jié)合，使用HeLa、293T和U2OS細(xì)胞也有同樣效果。結(jié)論：在進(jìn)行端粒原位雜交實驗時，用0.4 mg/mL RNase A消化核仁可減少探針的非特異結(jié)合，提高端粒圖像的清晰度。

核糖核酸酶A；免疫熒光原位雜交（IF-FISH）；端粒

端粒是真核細(xì)胞線性染色體末端DNA重復(fù)序列（TTAGGG），在維護(hù)基因組穩(wěn)定性和細(xì)胞生理內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起重要作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)端粒功能調(diào)控與各種疾病的發(fā)生密切相關(guān)，因此研究端粒DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的功能至關(guān)重要[2]。在敲低端粒相關(guān)蛋白后需要檢測該蛋白的端粒定位情況，實驗中最常用到熒光原位雜交技術(shù)（fluores?cencein situhybridization，F(xiàn)ISH）。該技術(shù)是20世紀(jì)80年代末在放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性分子細(xì)胞遺傳技術(shù)[3-4]，基本原理是先把DNA（或RNA）探針用特殊的熒光染料標(biāo)記，然后將探針直接雜交到染色體上，通過熒光染料發(fā)出的熒光進(jìn)行DNA序列在染色體上的定位、定性、相對定量分析。我們使用該技術(shù)標(biāo)記細(xì)胞中的端粒，在操作過程中，所用探針較短，長度一般為15 bp，且具有良好的穿透性，可用于標(biāo)記端粒；但同時探針在雜交過程中特異性較弱，會與核仁發(fā)生非特異性結(jié)合，即除端粒結(jié)合外還有核仁的著色，影響實驗結(jié)果。為了消除這種非特異性雜交，我們使用核糖核酸酶（RNase）A消化核仁，減小核仁對探針的影響，得到了較清晰的端粒圖像，為下一步端粒的生物學(xué)研究提供了較好的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

HepG2、HeLa、293T和U2OS細(xì)胞為本實驗室保存；RNase A購于Sigma公司；抗端粒結(jié)合蛋白2（TRF2）抗體為Abcam公司產(chǎn)品；紅色熒光標(biāo)記抗體購自Invitrogen公司；Tel-CAF488FISH探針為BSI公司產(chǎn)品；4%多聚甲醛PBS和其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品；E-80i熒光正置顯微鏡為Nikon公司產(chǎn)品；雜交儀Thermo Brite為Leica公司產(chǎn)品。

1.2 免疫熒光（immunofluorescence，IF）

1.2.1 細(xì)胞接種 將消化好的待檢測細(xì)胞HepG2用含10%胎牛血清的DMEM混勻后接種到事先放入蓋玻片的12孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24或48 h后觀察細(xì)胞密度，達(dá)到70%～80%匯合后取出12孔板，棄DMEM培養(yǎng)液，用1×PBS涮洗1次。

1.2.2 固定 每孔加入600 μL 4%多聚甲醛（PFA），室溫固定10 min，棄固定液，用1×PBS在水平搖床上洗3次，每次5 min。

1.2.3 封閉透化 每孔加入600 μL封閉液，室溫?fù)u床上透化30 min。

1.2.4 一抗結(jié)合 按照抗體說明書的要求用封閉液稀釋抗TRF2抗體（一抗），每片蓋玻片加25～30 μL，于37℃恒溫孵育箱中結(jié)合1 h或在4℃冰箱中過夜，避光條件下用1×PBS洗片3次，每次5 min。

1.2.5 二抗結(jié)合 按照抗體說明書的要求用封閉液稀釋二抗，每片蓋玻片孵25～30 μL稀釋抗體，于37℃恒溫孵育箱中結(jié)合1～2 h，避光條件下用1×PBS洗片3次，每次5 min。

1.2.6 染核 用1×PBS按一定比例稀釋DAPI，每孔加入600 μL染核液，避光染核5 min，熒光顯微鏡下觀察染色情況，并拍照保存。

1.3 熒光原位雜交

1.3.1 RNase A消化核仁 將附著細(xì)胞的玻片放在分別含有 0.1、0.2、0.4 mg/mL RNase A 的 PBS液體中，37℃孵育過夜。

1.3.2 再固定 用4%PFA固定10 min，避光條件下用1×PBS洗蓋玻片3次，每次5 min。

1.3.3 脫水處理 依次用75%、95%的乙醇和無水乙醇避光脫水處理5 min，室溫避光干燥15 min，使其充分干燥。

1.3.4 雜交液配制 用商品化TELEAF488綠色熒光探針，稀釋液含2%BSA、10 mmol/L Tris-Cl（pH7.2）、70%甲酰胺，探針按1∶100稀釋使用。每個蓋玻片孵育15～20 μL含100 nmol/L探針的雜交液，再用膠水將蓋玻片的四周封閉保濕。

1.3.5 雜交儀工作設(shè)置 80℃變性處理10 min，37℃雜交2 h，再4℃過夜處理。

1.3.6 洗片 避光條件下用1×PBS洗片3次，每次5 min。

1.3.7 細(xì)胞核染色 用1×PBS按照一定比例稀釋DAPI，每孔加入600 μL染核液，避光染核5 min，熒光顯微鏡下觀察染色定位情況，并拍照保存。

1.4 對比實驗

在做FISH之前將玻片分別泡在含0.1、0.2、0.4 mg/mL RNase A的PBS溶液中，于37℃充分消化過夜，之后用4%多聚甲醛固定，脫水雜交處理，與不加RNase A的樣品對比，觀察樣品經(jīng)RNase A消化后對端粒雜交效果的影響，核仁有無雜交信號。

同時對HeLa、293T和U2OS細(xì)胞系經(jīng)0.4 mg/mL RNase A處理后的端粒FISH結(jié)果進(jìn)行分析，觀察端粒雜交效果。

2 結(jié)果

端粒蛋白復(fù)合體（shelterin）在維持基因組穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用，我們用HepG2細(xì)胞研究復(fù)合體蛋白TRF2在端粒中的定位時，發(fā)現(xiàn)IF-FISH實驗結(jié)果中端粒的圖像總是受核仁染色的影響，甚至影響了端粒foci的形成，干擾實驗結(jié)果分析。核仁的主要成分是細(xì)胞核RNA，因此我們試想用RNase A對核仁進(jìn)行消化，以減少核仁對實驗的影響。我們選取了3個濃度的RNase A，在IF反應(yīng)結(jié)束后將細(xì)胞放在含RNase A的PBS中于37℃過夜，然后再進(jìn)行FISH，之后分別檢測端粒染色情況和待測蛋白的定位情況。在不加RNase A的端粒免疫熒光圖片中（圖1），細(xì)胞核內(nèi)的核仁非常明顯，加了0.1和0.2 mg/mL RNase A的細(xì)胞核內(nèi)的核仁有所減弱，但還不能完全消除；在使用0.4 mg/mL RNase A消化后，核仁基本沒有著色。初步說明IF后加入0.4 mg/mL RNase A可有效降低細(xì)胞核中RNA的干擾，獲得較清晰的端粒圖像，為下一步實驗提供可靠的數(shù)據(jù)。

為了證實這種方法的可行性，我們同時選取了另外3種細(xì)胞系來研究RNase A對端粒FISH的影響，結(jié)果見圖2，可見不同細(xì)胞系經(jīng)0.4 mg/mL RNase A處理后均能得到較清晰的端粒圖像，證明此方法是可行的。

圖1 HepG2細(xì)胞經(jīng)RNase A消化前后熒光原位雜交效果對比

圖2 不同細(xì)胞系端粒原位雜交結(jié)果

3 討論

相關(guān)研究表明端粒的主要生物學(xué)功能是保護(hù)染色體末端，避免染色體末端的降解和端-端融合，對維持基因組結(jié)構(gòu)的完整性和穩(wěn)定性也起到至關(guān)重要的作用。免疫熒光及熒光原位雜交技術(shù)在實驗室多項研究中廣泛應(yīng)用[5]，是研究核蛋白定位的手段。我們在探討端粒相關(guān)蛋白的功能時需要檢測端粒蛋白的定位情況，但實驗結(jié)果總會受核仁的影響，不能得到清晰的端粒原位雜交位點圖像。在腫瘤細(xì)胞中，蛋白質(zhì)合成旺盛，核仁較大，而核仁是真核細(xì)胞間期核中最明顯的結(jié)構(gòu)，所有真核生物的核糖體RNA（rRNA）的轉(zhuǎn)錄都是在核仁中完成的。又由于端粒探針的長度較短，在做端粒原位雜交實驗時，端粒探針在對端粒進(jìn)行雜交的同時會與核仁中的RNA有不同程度的結(jié)合，進(jìn)而干擾細(xì)胞端粒染色效率。由于待檢測目標(biāo)蛋白表達(dá)較強(qiáng)，不會受探針雜交影響，因此我們在目標(biāo)蛋白免疫熒光反應(yīng)之后、雜交之前用0.4 mg/mL的RNase A于37℃對不同細(xì)胞系進(jìn)行消化過夜，然后再進(jìn)行雜交，有效地解決了核仁對實驗結(jié)果的影響，同時并不影響目標(biāo)蛋白的結(jié)合。在正常細(xì)胞中此方法也得到了驗證。綜上，在端粒FISH實驗中加入一定濃度的RNase A可以提高端粒免疫熒光的特異性，得到清晰的端粒FISH圖像。

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Application of RNase A in Telomere IF-FISH Experiment

YU Fang,JIN Rui,HUANG Jun-Jian*
Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100850,China

Objective:To decrease nucleolus coloring in immunofluorescence-fluorescencein situhybridization（IF-FISH） of telomere.Methods:The cells were digested overnight at 37℃ with RNase A at concentration of 0.1,0.2 and 0.4 mg/mL and subjected to telomerein situhybridization.Results:The use of 0.4 mg/mL RNase A eliminates nonspecific binding of HepG2 telomerein situhybridization and ensure the accuracy of the experimen?tal results.The same results were also got in HeLa,293T and U2OS cells.Conclusion:In situhybridization of telomere,digesting nucleoli with RNase A can provide a clearer immunofluorescence imaging and specificity.

RNase A;immunofluorescence-fluorescencein situhybridization（IF-FISH）;telomere

Q78

A

1009-0002（2017）05-0681-04

10.3969/j.issn.1009-

*Corresponding author,E-mail:junjianhuangbit@163.com

2017-05-03

于芳（1972- ），女，碩士，實驗師，（E-mail）yuf_2013@126.com

黃君健，（E-mail）junjianhuangbit@163.com