孫慧偉，柴燕濤，趙爽，王志杰，謝輝，洪志賢，馮帆，侯俊

解放軍第三〇二醫(yī)院 a.臨床研究管理中心；b.介入科；c.肝膽外科一中心；北京 100039

一種新型肝細(xì)胞癌分子靶向治療臨床藥敏檢測方法的建立

孫慧偉a，柴燕濤a，趙爽a，王志杰a，謝輝b，洪志賢c，馮帆a，侯俊a

解放軍第三〇二醫(yī)院 a.臨床研究管理中心；b.介入科；c.肝膽外科一中心；北京 100039

目的：建立分子靶向藥物索拉菲尼（Sorafenib）臨床治療肝細(xì)胞癌（HCC）敏感性的新型預(yù)測方法。方法：將HCC手術(shù)切除癌癥標(biāo)本外圍組織性狀較好的部分處理成1 mm3，原位接種于免疫缺陷的BALB/c小鼠肝臟，4～6周后B超檢測其生長狀況；當(dāng)腫瘤長至2～3 mm3時，用生理鹽水配置Sorafenib溶液，以2 mg/kg用量對小鼠進(jìn)行隔日口服灌胃給藥，共給藥10次。最后收集動物，觀察肝臟原位腫瘤的大小，同時進(jìn)行病理檢測，考察Sorafenib的抗腫瘤治療效果。結(jié)果：實驗動物肝臟拍照和病理結(jié)果均顯示，與溶劑對照組相比，Sorafenib治療組小鼠肝臟原位HCC病灶明顯縮小或消除。結(jié)論：建立了HCC分子靶向治療臨床藥敏檢測方法，為臨床有效且個體化治療HCC提供了新途徑。

肝細(xì)胞癌；分子靶向治療；免疫缺陷動物；原位腫瘤模型；藥敏檢測

我國逾8000萬人攜帶乙型肝炎病毒（HBV）或罹患乙肝，隨著疾病的進(jìn)展，有相當(dāng)比例的患者最終發(fā)展為肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）[1]。由于大部分HCC患者初診即為進(jìn)展期，失去肝移植或外科手術(shù)等根治性治療的機(jī)會，因此抗腫瘤藥物治療對于HCC臨床診療具有重要意義[2]。但HCC具有對細(xì)胞毒性化療藥多藥耐藥（multi-drug resistance，MDR）的特性，目前進(jìn)展期HCC患者惟一的一線治療藥物是口服多靶點小分子蛋白激酶抑制劑（分子靶向藥物）索拉菲尼（Sorafenib）。盡管Sorafenib治療組HCC患者總體生存期（over survival，OS）或疾病進(jìn)展時間（time to progression，TTP）均較安慰劑組明顯延長[3-8]，但Sorafenib總體有效率仍較低，僅為26%～43%[9-10]。這表明進(jìn)展期HCC患者對Sorafenib的敏感性存在明顯的個體差異，且Sorafenib治療過程中也有可能出現(xiàn)藥物耐受。因此，建立Sorafenib治療HCC的敏感性預(yù)測方法具有重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

HCC手術(shù)切除標(biāo)本由解放軍第三〇二醫(yī)院肝膽外科一中心一科提供，患者接受降階梯治療（射波刀）行為評分提高后接受外科手術(shù)切除治療。病人手術(shù)切除標(biāo)本后立即放入含20%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基的50 mL無菌離心管中，盡快送入實驗室進(jìn)行后續(xù)實驗。

BALB/c免疫缺陷小鼠由北京斯貝福公司提供；HepG2細(xì)胞為本實驗室保存，以高糖DMEM培養(yǎng)基（Hyclone公司）添加10%FBS（Hyclone公司）培養(yǎng)；Sorafenib為Selleck公司產(chǎn)品；H&E染色試劑盒為北京中杉金橋公司產(chǎn)品；小鼠手術(shù)器械與縫合針線、吸入麻醉劑異氟烷等為本實驗室保存。

1.2 利用HepG2細(xì)胞系建立HCC肝臟原位腫瘤

HepG2細(xì)胞培養(yǎng)至指數(shù)增長期，待其狀態(tài)良好后接種于免疫缺陷動物皮下（腋下接種，每個接種點為1×106細(xì)胞），生長6～8周形成明顯的皮下腫瘤，解剖動物獲得腫瘤，剝?nèi)∧[瘤組織實表面/邊緣性狀較好的部分（包括腫瘤組織色澤較好并伴有豐富血管的部分），切碎形成組織微塊（直徑0.5～1 mm），保存于含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基中。BALB/c免疫缺陷小鼠用異氟烷進(jìn)行持續(xù)吸入麻醉，將小鼠固定并行開腹手術(shù)，在其肝右葉用眼科鑷制造孔洞，將前述腫瘤組織微塊種植于肝右葉孔洞中，摁壓止血后將肝葉小心推回小鼠腹腔，小心縫合肌肉與皮膚，避免傷及內(nèi)臟。生長6～8周后B超探查病灶（直徑2～3 mm），解剖動物，比較B超探查結(jié)果與實際大小的差異。

1.3 病理學(xué)檢測

前述獲得的免疫缺陷動物剝離肝右葉，切取腫瘤，用4%多聚甲醛固定24 h后進(jìn)行病理石蠟包埋、切片等常規(guī)操作。HE染色切片石蠟切片依次處理脫蠟復(fù)水后，蘇木精液染色約1 min，用1%鹽酸乙醇分化30 s，最后用伊紅液染色。切片脫水后用中性樹膠封片。顯微鏡下觀察腫瘤組織的特性并拍照。

1.4 免疫缺陷小鼠HCC原位腫瘤種植

選取HCC患者手術(shù)切除標(biāo)本外圍性狀較好的部分分解為腫瘤組織微塊（直徑約0.5 mm），保存于含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，準(zhǔn)備裸鼠的肝臟原位移植。隨后將BALB/c免疫缺陷小鼠用異氟烷進(jìn)行持續(xù)吸入麻醉，將小鼠四肢固定并行開腹手術(shù)，在其肝右葉用眼科鑷制造孔洞，將處理好的腫瘤組織微塊種植于肝右葉孔洞中，摁壓止血后將肝葉小心推回小鼠腹腔，小心縫合肌肉與皮膚，避免傷及內(nèi)臟。

1.5 B超檢測免疫缺陷小鼠HCC原位腫瘤模型

種植腫瘤組織微塊的裸鼠生長4～6周后，B超探查其肝臟原位腫瘤的生長情況。當(dāng)B超顯示有1～2 mm直徑低回聲病灶時，可認(rèn)為形成了明確的肝臟原位腫瘤。

1.6 小鼠分子靶向治療

用生理鹽水配置Sorafenib溶液，按2 mg/kg對小鼠隔日口服灌胃給藥（生理鹽水口服灌胃為對照），共給藥10次（18 d）。末次口服灌胃給藥后2～3 d收集動物，觀察肝臟原位病灶的大小并進(jìn)行HE染色，評價Sorafenib的抗腫瘤治療效果。

2 結(jié)果

2.1 HepG2細(xì)胞免疫缺陷小鼠肝臟原位模型構(gòu)建

用B超探查與病理學(xué)方法（HE染色）檢測HepG2細(xì)胞免疫缺陷小鼠肝臟原位模型。接種了HepG2皮下腫瘤組織微塊的免疫缺陷小鼠，6～8周后B超探查發(fā)現(xiàn)其肝臟有明確的病灶信號（圖1）；解剖動物后，其肝臟原位病灶清晰可見（圖2A），HE染色進(jìn)一步驗證了腫瘤的特異性（圖2B）。表明建立了HepG2細(xì)胞免疫缺陷小鼠肝臟原位模型。

2.2 HCC手術(shù)切除標(biāo)本免疫缺陷小鼠肝臟原位模型構(gòu)建

在前述基礎(chǔ)上，對8只免疫缺陷小鼠進(jìn)行源于同一患者的HCC肝臟原位種植手術(shù)，術(shù)后飼養(yǎng)4周，隨機(jī)挑選其中1只進(jìn)行B超檢查，處死后進(jìn)行病理分析確證，檢測。結(jié)果如圖3所示，B超探查顯示小鼠肝臟有明顯低回聲的病灶（圖3A中白色圓圈標(biāo)識的陰影），直徑1～1.5 mm，與將裸鼠處死后解剖的癌組織大小一致，HE染色結(jié)果也驗證了肝臟原位腫瘤B超檢測的特異性（圖3B），表明可以用B超初步判斷腫瘤組織在體內(nèi)的生長。上述實驗結(jié)果表明，我們成功地利用HCC患者手術(shù)切除標(biāo)本種植免疫缺陷動物肝臟，建立了肝臟原位模型。

圖1 HepG2免疫缺陷動物肝臟原位腫瘤模型的B超探查

圖2 HepG2免疫缺陷動物肝臟原位腫瘤與病理學(xué)檢測

圖3 HCC免疫缺陷動物肝臟原位腫瘤模型的B超檢測結(jié)果

2.3 Sorafenib治療敏感性檢測

將B超掃描確認(rèn)的6只具有肝臟原位腫瘤的小鼠分成2組（每組3只），分別進(jìn)行Sorafenib和生理鹽水口服灌胃給藥。經(jīng)過18 d治療，最終獲得5只動物的實驗結(jié)果（對照組1只小鼠因過于衰弱死亡）。由于最終只剩2只對照組小鼠，因此顯示2 v.s.2的結(jié)果照片。結(jié)果顯示（圖4），2只對照組小鼠肝臟均有明確的HCC病灶（圖4A、B）。在剝?nèi)「谓M織過程中也發(fā)現(xiàn)，2只小鼠肝葉上HCC病灶的惡性程度均較高，其生長造成了不同肝葉之間的黏連和侵襲，而Sorafenib治療組動物肝臟表面病灶明確縮小或消失。由此表明Sorafenib治療該例病人的HCC有效，Sorafenib具有明確的抗腫瘤活性，幾乎能夠消融腫瘤病灶（圖4C、D）。進(jìn)一步進(jìn)行病理學(xué)確證，HE染色結(jié)果顯示HCC患者切除標(biāo)本在免疫缺陷動物肝臟右葉形成明確病灶，造成嚴(yán)重的肝損傷（圖5A、B），接受Sorafenib治療的動物肝臟無明顯病灶（圖5C、D），證實了Sorafenib的抗腫瘤活性。

圖4 Sorafenib對HCC原位腫瘤的抑制活性檢測

圖5 Sorafenib對HCC原位腫瘤的抑制活性檢測的病理檢測確認(rèn)

3 討論

HCC具有對傳統(tǒng)細(xì)胞毒性化療藥物的MDR特性，因此在臨床診療中患者無法從常規(guī)化學(xué)藥物治療（口服或靜脈滴注化療藥物）中獲益[11]。盡管射波刀（Cyber knife）等物理性治療策略能夠在一定程度上局部消融HCC病灶[12]，以及動脈化療栓塞（transarterial chemoembolization，TACE）能夠利用奧沙利鉑（Oxaliplatin）、表柔比星（Epirubicin）或雷替曲塞（Raltitrexed）等化療藥物進(jìn)行降階梯治療[13]，減輕患者腫瘤負(fù)荷，提高患者行為評分，但這些治療策略也存在造成HCC復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，因此研究和建立HCC新的診療策略具有重要意義。目前治療HCC的惟一一線藥物Sorafenib總體有效率為25%～40%，如何確定Sorafenib治療有效的個體，減輕病人的治療負(fù)擔(dān)，從而達(dá)到藥物的精準(zhǔn)治療，是醫(yī)務(wù)人員常常思考的問題。因此，建立HCC分子靶向治療敏感性檢測方法具有特殊的臨床意義。

本研究目的為建立HCC相關(guān)藥物敏感性檢測方法。在前期實驗中，我們用HepG2肝癌細(xì)胞注射裸鼠皮下，長出細(xì)胞系癌塊后用組織塊肝臟原位移植手術(shù)將其從裸鼠皮下取出，切碎后重新植入裸鼠肝臟，建立了組織塊肝臟原位移植技術(shù)。我們利用該技術(shù)，將患者手術(shù)切除的肝癌組織經(jīng)切碎處理后直接植入裸鼠肝臟，從而構(gòu)建了癌癥組織肝臟原位移植的動物模型。隨后，對裸鼠進(jìn)行Sorafenib分子靶向藥灌胃治療，實驗結(jié)果表明該患者標(biāo)本中的HCC細(xì)胞對Sorafenib敏感，表明該患者可能對Sorafenib敏感，術(shù)后有可能通過服用Sorafenib預(yù)防復(fù)發(fā)與疾病進(jìn)展。通過對其行為評分和診療過程進(jìn)行追蹤分析，發(fā)現(xiàn)該患者入院確診時行為評分較差，因此先行射波刀和TACE降階梯后方接受外科手術(shù)切除。現(xiàn)已有明確報道，射頻消融、TACE或射波刀等局部消融策略結(jié)合Sorafenib治療能夠顯著延長患者生存期，提高患者生存質(zhì)量[9-10,14]。本研究結(jié)果與這些報道一致，這提示局部消融的物理性治療策略有可能改變患者HCC細(xì)胞的生物學(xué)行為或特性，增加其對Sorafenib的敏感性。但另一方面，射波刀和TACE等也有可能改變HCC病灶的生物學(xué)行為，使其對Sorafenib敏感或易于復(fù)發(fā)，而HCC降階梯治療后的復(fù)發(fā)風(fēng)險也值得警惕[11,15]。

本研究建立了一種新型Sorafenib治療HCC的臨床藥敏檢測方法，利用免疫缺陷小鼠建立HCC肝臟原位腫瘤模型，行口服灌胃給藥治療后能夠明確觀察到Sorafenib對HCC原位病灶的抗腫瘤活性。該方法具有自身獨特的優(yōu)勢：①在建立細(xì)胞系過程中，HCC細(xì)胞的性狀或生物學(xué)行為會發(fā)生變化，可能難以反映HCC臨床治療的實際情況。在研究中我們也發(fā)現(xiàn)，利用HCC較為常見的細(xì)胞系HepG2先建立皮下腫瘤模型，再將腫瘤組織微塊接種于免疫缺陷小鼠肝臟獲得的HCC模型與HCC手術(shù)切除標(biāo)本建立的HCC原位腫瘤模型相比，其B超檢測結(jié)果差異明顯：用HepG2細(xì)胞系建立的HCC原位腫瘤模型為B超探查復(fù)雜回聲的HCC病灶（圖1），而利用手術(shù)切除標(biāo)本建立的HCC原位腫瘤為典型的低回聲病灶（圖3A）。HCC臨床影像探查已明確證實，HCC以B超探查低回聲病灶最為常見，而混雜回升和高回升病灶較為少見，這也從一個方面證實了本研究方法的優(yōu)勢。②惡性程度較高的HCC標(biāo)本獲得的腫瘤病灶具有明確的侵襲特性，能夠造成不同肝葉的黏連和侵襲。本研究利用HCC患者手術(shù)切除標(biāo)本建立免疫缺陷小鼠肝臟原位腫瘤模型，這一模型不僅可用于預(yù)測HCC相關(guān)抗腫瘤藥物的敏感性，也可能對判別HCC的惡性程度和預(yù)后預(yù)測提供參考。本研究不僅具有重要的科研價值，也有助于為HCC臨床分子靶向治療提供有價值的藥物敏感性預(yù)測信息。

綜上，我們獲得了相關(guān)研究模型，在未來研究中將對方法進(jìn)行優(yōu)化：①HCC腫瘤自身特性較為疏松，臨床HCC手術(shù)切除標(biāo)本質(zhì)地較軟，這給原位腫瘤建模帶來一定影響；②受限于各種原因，能夠獲得的腫瘤標(biāo)本受限，難以獲得很大量標(biāo)本，同時標(biāo)本中僅極少部分性狀較好，因此難以接種更多實驗動物；③與HCC臨床診療不同（現(xiàn)已發(fā)展出系統(tǒng)的HCC患者對癥支持治療策略），研究過程中實驗動物易因虛弱而死亡，因此開發(fā)和建立相關(guān)支持療法或手段亦有重要意義。

[1]Wang F S,Fan J G,Zhang Z,et al.The global bur?den of liver disease:the major impact of China[J].Hepatology,2014,60(6):2099-2108.

[2]Jia H,Yang Q,Wang T,et al.Rhamnetin induces sensitization of hepatocellular carcinoma cells to a small molecular kinase inhibitor or chemotherapeutic agents[J].Biochim BiophysActa,2016,1860(7):1417-1430.

[3]Abou-Alfa G K,Puig O,Daniele B,et al.Random?ized phaseⅡplacebo controlled study of codrituzumab in previously treated patients with advanced hepatocel?lular carcinoma[J].J Hepatol,2016,65(2):289-295.

[4]Cheng A L,Thongprasert S,Lim H Y,et al.Random?ized,open-labelphase 2 study comparing frontline dovitinib versus sorafenib in patients with advanced hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2016,64(3):774-784.

[5]Bitzer M,Horger M,Giannini E G,et al.Resminostat plus sorafenib as second-line therapy of advanced hepatocel?lular carcinoma[J].J The SHELTER study Hepatol,2016,65(2):280-288.

[6]Koeberle D,Dufour J F,Demeter G,et al.Sorafenib with or without everolimus in patients with advanced hepatocellular carcinoma(HCC):a randomized multi?center,multinational phaseⅡ trial(SAKK 77/08 and SASL 29)[J].Ann Oncol,2016,27(5):856-861.

[7]Ciuleanu T,Bazin I,Lungulescu D,et al.A random?ized,double-blind,placebo-controlled phaseⅡ study to assessthe efficacy and safety of mapatumumab with sorafenib in patients with advanced hepatocellu?lar carcinoma[J].Ann Oncol,2016,27(4):680-687.

[8]Cheng A L,Kang Y K,Chen Z,et al.Efficacy and safety of sorafenib in patients in the Asia-Pacific re?gion with advanced hepatocellular carcinoma:a phase III randomised,double-blind,placebo-controlled trial[J].Lancet Oncol,2009,10(1):25-34.

[9]Wang C,Lu Y,Wang H,et al.Transarterial chemoem?bolization with/without cryotherapy is associated with improved clinical outcomes of sorafenib for the treat?ment of advanced hepatocellular carcinoma[J].Exp Ther Med,2012,4(2):188-196.

[10]Yang Y,Lu Y,Wang C,et al.Cryotherapy is associat?ed with improved clinical outcomes of sorafenib for the treatment of advanced hepatocellular carcinoma[J].Exp Ther Med,2012,3(2):171-180.

[11]Zeng Z,Ren J,O'Neil M,et al.Impact of stem cell marker expression on recurrence of TACE-treated he?patocellular carcinoma post liver transplantation[J].BMC Cancer,2012,12:584.

[12]Wang C,Wang H,Yang W,et al.Multicenter random?ized controlled trial of percutaneous cryoablation ver?sus radiofrequency ablation in hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2015,1(5):1579-1590.

[13]Shi Y,Zhai B.A recent advance in image-guided lo?coregional therapy for hepatocellular carcinoma[J].Gas?trointest Tumors,2016,3(2):90-102.

[14]顏芳,黃成成,路富民,等.癌痛的分子機(jī)理研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊,2016,27(5):711-715.

[15]樓敏,白文林,常秀娟,等.上皮細(xì)胞黏附分子在肝動脈化療栓塞中的表達(dá)改變及其功能[J].傳染病信息,2016,29(4):209-212.

Establishment of a Novelin vivoSensitivity-Testing Model for HCC Molecular Targeted Therapy

SUN Hui-Wei1,CHAI Yan-Tao1,ZHAO Shuang1,WANG Zhi-Jie1,XIE Hui2,HONG Zhi-Xian3,FENG Fan1*,HOU Jun1*
a.Research Center for Clinical and Translational Medicine;b.Center of Interventional Radiology for Oncology;c.Department of Hepatobiliary Surgery;the 302nd Hospital of Chinese PLA,Beijing 100039,China

Objective:To establish a novelin vivosensitivity-testing model for hepatocellular carcinoma（HCC）molecular targeted therapy.Methods:The clinical specimens from HCC patients were seeded in the liver tissues of BALB/c nude mice.After 4～6 weeks,thein situcancer nests were confirmed by a B-mode ultrasonography test.Sorafenib were given via oral gavage administration（2 mg/kg per two days）,and physiological saline was used as the solvent control.After 18 days treatment,the results were shown by anatomic or pathological analysis.Re?sults:Sorafenib significantly inhibited thein situgrowth of HCC in nude mice.Conclusion:This work successful?ly establishes a novelin vivosensitivity-testing model for HCC molecular targeted therapy.

hepatocellular carcinoma;molecular targeted therapy;immunodeficient animal;in situtumor growth;drug-sensitivity test

R730.5

A

1009-0002（2017）05-0671-05

10.3969/j.issn.1009-

*Co-corresponding authors,FENG Fan,E-mail:fengfanbio@126.com;HOU Jun,E-mail:houj302@163.com

2017-03-08

解放軍第三〇二醫(yī)院院長創(chuàng)新基金（YNKT2014039）

孫慧偉（1988- ），學(xué)士，實驗師，（E-mail）mugoutaiji@163.com

馮帆，（E-mail）fengfanbio@126.com；侯俊，（E-mail）houj302@163.com