張勇， 卜春曉， 程敬亮， 李顏良

·實(shí)驗(yàn)研究·

丁苯酞對(duì)缺血腦組織RGMa表達(dá)及軸索損傷的影響

張勇， 卜春曉， 程敬亮， 李顏良

目的探討丁苯酞對(duì)缺血性腦損傷后缺血腦組織排斥導(dǎo)向分子(RGMa)表達(dá)的影響。方法120只成年雄性SD大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組，大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型組，生理鹽水組，丁苯酞干預(yù)組。選取缺血后1h、3h、6h、12h、24h，進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，免疫組織化學(xué)觀(guān)察RGMa的表達(dá)情況。結(jié)果MCAO模型組、生理鹽水組、丁苯酞組的改良的神經(jīng)功能評(píng)分(mNSS)均高于假手術(shù)組，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，mNSS評(píng)分越高；在缺血后3h、6h、12h、24h時(shí)，丁苯酞組的mNSS評(píng)分較MCAO模型組降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MCAO模型組、生理鹽水組大鼠缺血后，不同時(shí)間點(diǎn)缺血區(qū)的RGMa蛋白陽(yáng)性表達(dá)均有所增加，呈棕黃色染色。局灶性腦缺血后RGMa蛋白表達(dá)逐漸增多，在12h表達(dá)量最多；丁苯酞組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的RGMa蛋白的表達(dá)較MCAO模型組有所降低，在6h、12h、24h時(shí)間點(diǎn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論丁苯酞可減少缺血性腦損傷大鼠的缺血腦組織的RGMa的表達(dá)，從而發(fā)揮神經(jīng)功能保護(hù)作用。

丁苯酞； 腦缺血； 軸索損傷； 模型，動(dòng)物

丁苯酞是我國(guó)自主研發(fā)的化學(xué)藥物，其通過(guò)改善缺血區(qū)微循環(huán)降低缺血再灌注損傷，改善缺血腦組織的能量代謝、保護(hù)線(xiàn)粒體功能、抑制氧自由基等而發(fā)揮腦保護(hù)作用[1-3]，但其保護(hù)機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。排斥導(dǎo)向分子A(RGMa)是近年發(fā)現(xiàn)神經(jīng)再生的排斥導(dǎo)向分子，中樞神經(jīng)受損后，其生長(zhǎng)錐塌陷，軸突結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞，將導(dǎo)致神經(jīng)突起間聯(lián)系的中斷，細(xì)胞間信息的傳遞受損，從而導(dǎo)致神經(jīng)功能的損傷[4，5]。本研究觀(guān)察丁苯酞干預(yù)后局灶性缺血大鼠RGMa表達(dá)以及軸索損傷的影響，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)分組

挑選清潔級(jí)健康成年的SD雄性大鼠120只，體重為280～300 g，平均(293.4±5.8) g，實(shí)驗(yàn)所用SD大鼠均由河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(豫)2010-0002]。動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組、MCAO模型組、生理鹽水組和丁苯酞組，每組分1h、3h、6h、12h、24h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg體重)麻醉，MCAO模型組參照Longa等[6]報(bào)道使用線(xiàn)栓法制作大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血模型；假手術(shù)組大鼠不插入線(xiàn)栓，其余步驟同MCAO模型組；丁苯酞干預(yù)組，Tween80溶液稀釋丁苯酞膠囊(由石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)09110611)，MCAO模型制作后腹腔注射給藥，大鼠給藥劑量按80 mg/kg計(jì)算；生理鹽水組，MCAO模型制作后腹腔注射給予相同體積的生理鹽水。

圖1 大鼠缺血后不同時(shí)間點(diǎn)mNSS。* 代表與MCAO模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(α =0.05，P<0.05)。 圖2 大鼠缺血后不同時(shí)間點(diǎn)缺血側(cè)腦組織RGMa蛋白的表達(dá)水平。* 代表與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(α=0.05，P<0.05)。# 代表與MCAO模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(α=0.05，P<0.05)。

2.大鼠神經(jīng)功能評(píng)分

采用文獻(xiàn)報(bào)道[7]的改良的大鼠神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(Modified neurological severity scores，mNSS)，在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。嚴(yán)重?fù)p傷13～18，中度損傷7～12，輕度損傷1～6。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1。

表1 相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

3.免疫組織化學(xué)檢測(cè)RGMa及軸突神經(jīng)絲蛋白-200(NF-200)表達(dá)

大鼠麻醉、灌注后取腦，放入4% PFA中固定，24 h后做石蠟包埋，制作石蠟切片( 片厚4 μm) 。用二甲苯和梯度酒精脫蠟，3% H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min，枸櫞酸緩沖液熱修復(fù)抗原6 min×4 次，1% TritonX 細(xì)胞通透20 min，山羊血清封閉30 min，RGMa兔多克隆抗體(1:50，英國(guó)Abcam公司) 及小鼠抗NF-200 一抗(1:100，武漢博士德生物技術(shù)有限公司)孵育并于4℃過(guò)夜。再用生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG/山羊抗小鼠IgG孵育，辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素孵育30 min，二抗試劑盒( 北京中杉生物技術(shù)有限公司) 。最后二氨基聯(lián)苯胺(DAB) 顯色、梯度脫水及封片。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

1.各組不同時(shí)間點(diǎn)大鼠神經(jīng)功能評(píng)分

按mNSS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)4組大鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，假手術(shù)組大鼠未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀，MCAO模型組、生理鹽水組及丁苯酞組大鼠的mNSS評(píng)分差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)方差分析，F(xiàn)=64.39，P=0.00)。進(jìn)一步采用LSD法兩兩比較，缺血后第3h、6h、12h、24h時(shí)，丁苯酞組與MCAO模型組(P<0.05)、丁苯酞組與生理鹽水組(P<0.05) 大鼠的mNSS評(píng)分差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；生理鹽水組和MCAO模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

2.各組不同時(shí)間點(diǎn)大鼠腦皮質(zhì)及海馬RGMa 蛋白表達(dá)

假手術(shù)組大鼠腦皮質(zhì)及海馬區(qū)可見(jiàn)少量RGMa蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，著色較弱。缺血性腦梗死第1h，MCAO模型組、生理鹽水組及丁苯酞組大鼠RGMa 蛋白陽(yáng)性細(xì)胞增多，對(duì)RGMa蛋白表達(dá)半定量分析可得，4組間RGMa蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=421.50，P=0.00)。給予丁苯酞治療后，在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)同MCAO模型組相比，丁苯酞組大鼠腦皮質(zhì)RGMa蛋白的表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2、3)。進(jìn)一步采用Western blot法檢測(cè)RGMa蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)同免疫組化相似的趨勢(shì)，假手術(shù)組大鼠缺血腦梗死灶周?chē)X皮質(zhì)僅有少量RGMa蛋白表達(dá)。同假手術(shù)組相比，MCAO模型組大鼠RGMa蛋白表達(dá)顯著增高(P<0.05)，給予丁苯酞治療后，在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)同MCAO模型組相比，丁苯酞干預(yù)組大鼠腦皮質(zhì)RGMa蛋白的表達(dá)水平明顯下降(P<0.05，圖4)。

圖3 不同組大鼠缺血后不同時(shí)間點(diǎn)缺血腦組織的RGMa的表達(dá)。A0代表假手術(shù)組；A1-A5分別為MCAO模型組1h、3h、6h、12h、24h缺血區(qū)腦組織RGMa蛋白表達(dá)。隨著腦梗死時(shí)間的延長(zhǎng)，RGMa蛋白表達(dá)逐漸增加，12h達(dá)到最高值，在24h稍降低；B1-B5分別為生理鹽水組1h、3h、6h、12h、24h缺血區(qū)腦組織RGMa蛋白表達(dá)，RGMa蛋白表達(dá)與MCAO模型組無(wú)明顯差異；C1-C5分別為丁苯酞組1h、3h、6h、12h、24h缺血區(qū)腦組織RGMa蛋白表達(dá)，RGMa蛋白表達(dá)較MCAO模型組降低。

圖4 大鼠缺血后不同時(shí)間點(diǎn)缺血腦組織NF-200蛋白的表達(dá)水平。*代表與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(α=0.05，P<0.05)。# 代表與MCAO模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(α=0.05，P<0.05)。

3.各組不同時(shí)間點(diǎn)大鼠腦皮質(zhì)及海馬NF-200蛋白表達(dá)

假手術(shù)組大鼠的免疫組化染色顯示缺血性腦梗死灶周?chē)X皮質(zhì)有大量 NF-200反應(yīng)陽(yáng)性的細(xì)胞；MCAO模型組大鼠在缺血3h時(shí)NF-200反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞顯著減少，陽(yáng)性纖維結(jié)構(gòu)紊亂，突起中斷，長(zhǎng)度明顯縮短，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)這種現(xiàn)象越明顯。對(duì)NF-200蛋白表達(dá)半定量分析可得，4組間NF-200蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=310.82，P=0.00)。丁苯酞組同MCAO模型組相比，大鼠腦皮質(zhì)及海馬NF-200蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目有所增加，在1h和3h這種差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在6h、12h及24h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4、5)。

討 論

RGMa已被證實(shí)是一類(lèi)具有抑制軸突再生的排斥性分子，排斥導(dǎo)向分子(repulsive guidance molecule，RGM)最初被認(rèn)為是連接視網(wǎng)膜和中腦頂蓋神經(jīng)纖維系統(tǒng)誘導(dǎo)生長(zhǎng)錐塌陷的一種膜結(jié)合蛋白，其通過(guò)糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定于細(xì)胞膜，控制神經(jīng)元的增殖和分化等[8]。使用Rho激酶特異性抑制劑阻止了RGMa所誘導(dǎo)的神經(jīng)元生長(zhǎng)錐塌陷，說(shuō)明RGMa通過(guò)RhoA-Rho 激酶通路，抑制神經(jīng)軸突再生。也有體外實(shí)驗(yàn)[9]證實(shí)RGMa可以引起正常皮質(zhì)神經(jīng)元的軸突回縮，并伴有細(xì)胞內(nèi)pCRMP-2表達(dá)的增多，說(shuō)明RGMa可以誘導(dǎo)pCRMP-2磷酸化而發(fā)揮抑制軸突生長(zhǎng)的作用。

Hata等[10]報(bào)導(dǎo)RGMa抑制脊髓損傷后神經(jīng)元軸突再生，使用RGMa抗體干預(yù)，脊髓神經(jīng)功能恢復(fù)得以改善，而Yshida等[11]在體外進(jìn)一步證實(shí)了RGMa抑制皮質(zhì)神經(jīng)元的軸突再生。Yamashita等[12]研究表明局灶性腦缺血后RGMa免疫陽(yáng)性細(xì)胞在病變區(qū)和病變周?chē)奂?，并在缺血?.5～2.5d達(dá)到峰值。本研究選擇RGMa作為觀(guān)察指標(biāo)，檢測(cè)其在腦梗死組織及小腦半球的表達(dá)情況。

腦組織在發(fā)生局灶性腦缺血后，RGMa免疫陽(yáng)性細(xì)胞會(huì)聚集在病灶中心及周?chē)鷧^(qū)域[12]，隨著大鼠的腦皮質(zhì)內(nèi)RGMa表達(dá)的增多，軸突損傷逐漸加重，神經(jīng)功能缺損也相應(yīng)嚴(yán)重。Chung等[13]的研究證實(shí)其不利于軸突缺血性損傷后的修復(fù)劑在再生。本研究建立了穩(wěn)定的MCAO模型，與假手術(shù)組相比較，MCAO模型組RGMa陽(yáng)性表達(dá)顯著增加，死亡的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量增多，而神經(jīng)功能評(píng)分升高，說(shuō)明神經(jīng)功能損傷嚴(yán)重，與前期的研究結(jié)果相一致。

圖5 不同組大鼠缺血后不同時(shí)間點(diǎn)小腦半球的RGMa蛋白的表達(dá)。A0代表假手術(shù)組；A1-A5分別為MCAO模型組1h、3h、6h、12h、24h小腦半球RGMa蛋白表達(dá)，隨著腦梗死時(shí)間的延長(zhǎng)，RGMa蛋白的表達(dá)逐漸增加，12h達(dá)到最大值，24h稍降低；B1-B5分別為生理鹽水組1h、3h、6h、12h、24h小腦半球RGMa蛋白表達(dá)，RGMa蛋白表達(dá)與MCAO模型組無(wú)明顯差異；C1-C5分別為丁苯酞組1h、3h、6h、12h、24h小腦半球RGMa蛋白表達(dá)，RGMa蛋白表達(dá)較MCAO模型組降低。

丁苯酞通過(guò)作用于缺血腦組織病理生理過(guò)程中的多個(gè)靶點(diǎn)而發(fā)揮腦保護(hù)作用，本研究通過(guò)與模型組比較發(fā)現(xiàn)丁苯酞組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的RGMa陽(yáng)性表達(dá)減少，相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的NF-200蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目有所增加，說(shuō)明丁苯酞能抑制缺血性腦損傷中RGMa的陽(yáng)性表達(dá)，改善神經(jīng)功能損傷。我們推測(cè)在神經(jīng)損傷中丁苯酞可以減少RGMa表達(dá)，減少生長(zhǎng)錐塌陷，保護(hù)軸突的結(jié)構(gòu)，維持神經(jīng)突起間聯(lián)系，保障細(xì)胞間信息的傳遞，最終減輕神經(jīng)功能的損傷。

綜上所述，本研究提示丁基苯酞可減少缺血性腦損傷后大鼠腦組織RGMa表達(dá)，從而減輕神經(jīng)功能的損害。由此可以推測(cè)，NBP通過(guò)缺血性腦損傷后腦組織內(nèi)RGMa生成，起到神經(jīng)保護(hù)作用，但丁基苯酞引起表達(dá)變化的具體機(jī)制又是什么，以及二者之間的具體關(guān)系，這值得我們進(jìn)一步研究，以便為臨床腦梗死患者提供新的治療思路。

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EffectsofbutylphthalideonRGMaexpressionandaxonalinjuryinischemicbrain

ZHANG Yong,BU Chun-xiao,CHENG Jing-liang,LI Yan-liang.

Department of Magnetic Resonance,the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China

Objective：To investigate the effect of butylphthalide on the expression of RGMa in ischemic brain.MethodsOne hundred and twenty healthy male SD rats were randomly divided into following four groups:sham operation group,middle cerebral artery occlusion (MCAO) model group,saline group and the experimental group.Each group would be further divided into 5 subgroups (1h,3h,6h,12h and 24h).The modified neurological severity scores and Western blot assay RGMa expression of ischemia side were performed at 1h,3h,6h,12h,24h after successful MCAO model.ResultsThe Modified Neurological Severity Score (mNSS) of MCAO model group,saline group,butylphthalide group were higher than those of sham group,mNSS were more higher as time went on;at 3h,6h,12h,at 24h after ischemia,mNSS of NBP group compared with MCAO model group,the difference was statistically significant (P<0.05).After ischemia,RGMa protein expression of MCAO model group and saline group in ischemic area had increased,which were staining with brownish yellow.RGMa expression gradually increased as time went on,up to maximum at 12h;RGMa protein expression of NBP group decreased,the difference between NBP group and MCAO group had statistically significant at 6h,12h,24h;RGMa protein expression changes between cerebellum and ischemic area were similar,RGMa protein expression of NBP group were reduced, difference was statistically significant at 1h,3h,6h,12h (P<0.05).ConclusionButylphthalide can reduce the expression of RGMa in ischemic brain tissue of rats with ischemic brain,and thus has a neuroprotective role.

Butylphthalide; Brain ischemia; Axonal injury; Models,animal

R743.31; R651.15

A

1000-0313(2017)10-1018-04

2017-01-20

2017-05-15)

450002 鄭州，鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院磁共振科

張勇(1977-)，男，河南焦作人，副主任醫(yī)師，主要從事中樞神經(jīng)系統(tǒng)影像學(xué)診斷工作。

程敬亮，E-mail: cjr.chj@vip163.com

2014年國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(U1404823)

10.13609/j.cnki.1000-0313.2017.10.005