李啟蒙 朱貝貝 方 皓 劉金玉 郭志明 王雪鵬*

一起菲律賓蛤仔出血病病原的鑒定

李啟蒙①朱貝貝①方 皓①劉金玉①郭志明①王雪鵬①*

（①山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 山東 泰安 271018 ②山東省即墨市海洋與漁業(yè)局）

本文從山東某菲律賓蛤仔養(yǎng)殖區(qū)發(fā)病菲律賓蛤仔和養(yǎng)殖水體中分離到一株優(yōu)勢(shì)菌，人工感染試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌能引起供試菲律賓蛤仔發(fā)病，死亡率為66.7%，且發(fā)病癥狀與原發(fā)病癥狀相同，提示該菌是引起菲律賓蛤仔死亡的主要致病菌。本研究對(duì)該菌形態(tài)、生理生化特征、16SrDNA及致病性進(jìn)行了初步分析。結(jié)果顯示，該菌株為溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)。因此，該例菲律賓蛤仔出血病是由溶藻弧菌感染引起的。

菲律賓蛤仔 溶藻弧菌 生理生化 致病性

菲律賓蛤仔是我國(guó)沿海常見的一種重要經(jīng)濟(jì)貝類，因其肉質(zhì)細(xì)嫩、營(yíng)養(yǎng)豐富，深受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者歡迎，是出口創(chuàng)匯的重要水產(chǎn)品之一。但是近十幾年來，隨著菲律賓蛤仔養(yǎng)殖規(guī)模的逐年擴(kuò)大，養(yǎng)殖環(huán)境惡化導(dǎo)致微生物疾病的流行而引發(fā)的養(yǎng)殖菲律賓蛤仔的大規(guī)模死亡屢屢發(fā)生，已造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而弧菌(Vibrios)是導(dǎo)致菲律賓蛤仔發(fā)病的主要致病菌。本研究對(duì)發(fā)病菲律賓蛤仔優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行分離、鑒定，并進(jìn)行人工感染試驗(yàn)和藥物敏感性分析，探討分析導(dǎo)致山東菲律賓蛤仔大規(guī)模死亡的病原，旨在為菲律賓蛤仔疾病研究提供理論依據(jù)，為菲律賓蛤仔健康養(yǎng)殖提供一些參考資料。

1 材料與方法

1.1 發(fā)病菲律賓蛤仔 于2017年8月份山東菲律賓蛤仔發(fā)

病高峰期，采集瀕臨死亡、病狀特征明顯的菲律賓蛤仔?；疾》坡少e蛤仔，表面粘液較少、表皮部分脫落，解剖發(fā)現(xiàn)外套膜萎縮，閉殼肌松弛、開合無力，有些發(fā)爛發(fā)白，軟體部消瘦，顏色淡紅，血管無色，部分病蛤腮黏液明顯增多。

1.2 分離方法 無菌鹽水洗凈，用70%的酒精棉球?qū)w表擦拭消毒，無菌手術(shù)刀開啟，取肝胰臟等部位無菌勻漿器中勻漿處理，zobell 2216E平板和TCBS平板劃線接種，28℃培養(yǎng)24h后，選取優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行重復(fù)劃線純化，純培養(yǎng)物于4℃冰箱中保存。

1.3 人工感染試驗(yàn) 人工感染試驗(yàn)在20L水族箱中進(jìn)行，條件為溫度28℃，鹽度26.4，pH8.2，連續(xù)充氣，每組放16只2cm大小的菲律賓蛤仔。換水1次/d，試驗(yàn)組調(diào)節(jié)水體中細(xì)菌濃度為108cfu/ml，每日投單胞藻1次；對(duì)照組不加入菌體，按上述方法飼養(yǎng)；連續(xù)觀察12d，紀(jì)錄死亡狀況，并進(jìn)行解剖和病原的再分離以確定是否死于攻毒活菌引起的感染。

1.4 細(xì)菌生化鑒定 按一般細(xì)菌常用鑒定方法[6]進(jìn)行分離菌的生物學(xué)性狀測(cè)定，包括革蘭氏染色、形態(tài)觀察、生理生化特性測(cè)定(所用試劑購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司)。

1.5 16SrDNA克隆、測(cè)序 采用細(xì)菌16SrDNA序列擴(kuò)增的通用引物對(duì)純培養(yǎng)的細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。正向引物為5'- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，反向引物為5' AAGGAGGTGWTCCAR CC-3'。所得PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送上海生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離及其形態(tài)特征 經(jīng)分離純化后，從病蛤中分離到1株優(yōu)勢(shì)菌，分離到的菌株均為革蘭氏陰性直桿菌(圖1)，菌體直或稍彎，無莢膜，靠鞭毛運(yùn)動(dòng)。在TCBS(硫代硫酸鈉-檸檬酸鹽-膽鹽)瓊脂平板上培養(yǎng)18h后，該分離菌株形成黃色扁平的大菌落(圖1-2)。

圖1 革蘭氏染色顯微鏡觀察(1000x)

圖2 分離菌在TCBS上的生長(zhǎng)特性

2.2 人工感染試驗(yàn) 人工感染7d后，菲律賓蛤仔開始出現(xiàn)死亡，9d后全部死亡，病死率為100%。于是初步判定2015年8月山東某養(yǎng)殖區(qū)菲律賓蛤仔大批死亡主要是以該分離菌為主要病原體的傳染病所造成。

2.3 分離菌株生化特性 細(xì)菌分離株在40℃以上和4℃以下不生長(zhǎng)，無鹽不生長(zhǎng)，其生活特性見表1，根據(jù)表1可以可以看出，這些特性與相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)溶藻弧菌的描述基本一致，認(rèn)為該分離菌為溶藻弧菌，命名為Crazy-1。

表1 分離菌生化特征及其與標(biāo)準(zhǔn)溶藻弧菌的比較

2.4 16SrDNA克隆、測(cè)序 對(duì)Crazy-1株16S rDNA序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析PCR擴(kuò)增，所得結(jié)果見圖3，進(jìn)一步證實(shí)該菌為溶藻弧菌。

圖3 Crazy-1進(jìn)化樹

3 討論

（1）溶藻弧菌感染海水養(yǎng)殖動(dòng)物的報(bào)道比較多，但導(dǎo)致貝類病害發(fā)生的報(bào)道卻很少。本次樣品采集是在高水溫期，表明溶藻弧菌是容易高溫環(huán)境下生長(zhǎng)并導(dǎo)致海水養(yǎng)殖動(dòng)物的弧菌病，對(duì)分離出的菌株做了人工感染實(shí)驗(yàn)，通過人工感染實(shí)驗(yàn)可知，感染后的試驗(yàn)菲律賓蛤仔出現(xiàn)明顯的病癥：表皮部分脫落、表面粘液較少，解剖發(fā)現(xiàn)外套膜萎縮，閉殼肌松弛、開合無力，有些發(fā)爛發(fā)白，軟體部消瘦，顏色淡紅，血管無色，部分病蛤腮黏液明顯增多，死亡率高達(dá)70%，從浸泡感染方式發(fā)病菲律賓蛤仔處分離到與自然發(fā)病相同的細(xì)菌，因此可以確定該分離株是菲律賓蛤仔發(fā)病的病原體。（2）菲律賓蛤仔主要養(yǎng)殖模式有淺海增殖、蝦貝混養(yǎng)等養(yǎng)殖模式，對(duì)于淺海增殖養(yǎng)殖模式，可以通過改善養(yǎng)殖環(huán)境、減小苗種密度等方式來預(yù)防該病的發(fā)生，對(duì)于蝦貝混養(yǎng)、池塘養(yǎng)殖等模式，可以在高溫季節(jié)投放二氧化氯、過硫酸氫鉀、腐植酸顆粒等消毒、改底的水環(huán)境改良劑來預(yù)防。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，二氧化氯、過硫酸氫鉀、腐植酸顆粒等水環(huán)境改良劑可以降低水體中溶藻弧菌的含量，明細(xì)降低病害的發(fā)生。

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S944.4+7

A

1007-1733(2017)10-0006-02

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系貝類創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（SDAIT-14-07）

*通訊作者

2017–05–21）