曹健力 張 偉 夏寧邵 鄭子崢

(廈門大學(xué)國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，廈門大學(xué)分子疫苗學(xué)與分子診斷學(xué)國家重點實驗室，廈門 361102)

呼吸道合胞病毒融合蛋白(F蛋白)結(jié)構(gòu)及中和表位的研究進展①

曹健力 張 偉 夏寧邵 鄭子崢

(廈門大學(xué)國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，廈門大學(xué)分子疫苗學(xué)與分子診斷學(xué)國家重點實驗室，廈門 361102)

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)，是造成全世界范圍內(nèi)嬰幼兒下呼吸道感染的主要原因之一，2歲前的幼兒幾乎全部感染過RSV[1]，造成肺炎及毛細支氣管炎等呼吸道疾病[2]。 0～2個月的嬰兒在感染RSV后易出現(xiàn)嚴重的病癥[3]。而在最新的全球疾病死亡率分析中，1月到1周歲的兒童死亡中約有6.7%是由RSV感染造成的[4]。青壯年人群感染后病癥較輕，但在老年人群中會出現(xiàn)嚴重病癥及死亡病例[5]。人體被RSV感染后會激發(fā)出中和抗體并引發(fā)T細胞應(yīng)答，但免疫能力會隨著時間衰退，進而造成終身的反復(fù)感染[6]。至今沒有安全有效的疫苗上市，唯一獲準上市的RSV特異性藥物是中和單抗Palivizumab(Synagis?)，但由于其價格高昂，中和效價不足致免疫劑量大等原因，目前僅用于降低免疫缺陷和先心病等高危新生兒的患病風(fēng)險。結(jié)構(gòu)生物學(xué)解析顯示Palivizumab能夠與一種穩(wěn)定構(gòu)象的F蛋白結(jié)合，提示F蛋白作為中和抗體靶向蛋白的重要性。

呼吸道合胞病毒屬于副黏病毒科(Paramyxov-iridae)成員，根據(jù)表面抗原的差異可分為RSV-A和RSV-B兩個亞型[7，8]。包含10個基因，編碼11種蛋白[9]。其中G蛋白和F蛋白是病毒表面的主要保護性抗原，能激起機體產(chǎn)生中和抗體[10]。G蛋白在亞型間差異性較大，故針對G蛋白的抗體大多是型特異性抗體[11,12]，而F蛋白在亞型間高度保守,由F蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體可同時抑制A/B型RSV病毒的感染，而且F蛋白也是激發(fā)機體產(chǎn)生保護性抗體的主要靶向蛋白[13,14]。因此，目前疫苗研究的重要目的是激起靶向RSV F的高中和抗體。

近期，研究者在RSV F蛋白的蛋白結(jié)構(gòu)，表位及其免疫原性等方面均取得了顯著進展，其中包括通過抗原抗體復(fù)合物晶體解析出融合前構(gòu)象(Prefusion)和融合后構(gòu)象(Postfusion)的結(jié)構(gòu)，并發(fā)現(xiàn)了新的中和抗體表位。本文旨在總結(jié)近年來RSV F蛋白的研究進展，包括Post/Prefusion結(jié)構(gòu)的解析、代表性表位及其抗體的發(fā)現(xiàn)，以期對疫苗發(fā)展做出貢獻。

1 呼吸道合胞病毒融合蛋白的結(jié)構(gòu)研究

呼吸道合胞病毒F蛋白(Fusion glycoprotein，融合蛋白)是N-糖基化的Ⅰ型跨膜蛋白，全長為574個氨基酸，包含信號肽(aa 2-20)、信號肽切割位點(aa 21-25)、F2區(qū)(aa 26-109)、多肽裂解區(qū)(aa 110-136)以及F1區(qū)(aa 137-574)[15]。RSV感染細胞后，會先合成一個70 kD的非活性F0前體，組裝成同源三聚體，之后轉(zhuǎn)移到高爾基體，109和136位點經(jīng)弗林蛋白酶切割后，F(xiàn)1和F2通過二硫共價鍵連接成具有活性的F蛋白[16,17]。F2亞單位含有2個N連接糖基化位點，決定RSV感染的宿主特異性[18]。F1亞單位則包含了膜融合的重要因素：F1-N端融合膜肽段(FP，aa 137-155)，引發(fā)細胞膜融合，以及F1-C端穿膜肽段(TM，aa 488-516)。F1核心包括HR1(aa 149-206)和HR2(aa 474-523)，兩者都是亮氨酸基序形成的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，其中HR1可以介導(dǎo)融合肽段插入靶細胞膜。在F結(jié)構(gòu)并未明確解析的早期，研究者猜測RSV F蛋白與其他副黏病毒科病毒類似，在病毒粒子表面存在亞穩(wěn)定態(tài)的融合前構(gòu)象(Prefusion F)[19]。

隨著冰凍電鏡技術(shù)的發(fā)展，研究者在病毒粒子表面同時觀測到Prefusion和Postfusion結(jié)構(gòu)[20]，該發(fā)現(xiàn)也同時證明了Prefusion是亞穩(wěn)定狀態(tài)，最終會轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定態(tài)的Postfusion形態(tài)。研究也證明了高溫以及低滲透壓會引發(fā)Prefusion的變構(gòu)[21,22]。但是目前對自然環(huán)境下變構(gòu)的觸發(fā)機制仍不明確。有研究者提出是宿主細胞表面的受體與F蛋白結(jié)合而觸發(fā)了融合機制，比如最近發(fā)現(xiàn)的核仁素[23,24]。

由于Postfusion結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，通過重組表達系統(tǒng)獲得的F蛋白可以穩(wěn)定保持在Postfusion狀態(tài)。Melero團隊在2011年首次通過重組痘病毒載體表達系統(tǒng)在HEp2細胞上表達出可溶性的Postfusion蛋白[25]，通過電鏡及蔗糖密度梯度分析，該蛋白能聚集呈玫瑰花狀。同年，McLellan團隊利用哺乳動物細胞懸浮表達純化，得到了缺失融合膜肽段(FP)前10個疏水性氨基酸及穿膜(TM)區(qū)的F蛋白，隨后通過X射線晶體學(xué)衍射對其結(jié)構(gòu)進行解析[26，27]。該蛋白的結(jié)構(gòu)(圖1B)揭示Postfusion是1個類似錐形的三聚體分子，頭部類似球狀，尾部呈柄狀，頭部包含F(xiàn)1和F2亞單位且兩者緊密地結(jié)合在一起，形成了數(shù)個α螺旋和β折疊。尾部包含6HB結(jié)構(gòu)，幾乎全由α螺旋構(gòu)成，與其他Ⅰ型融合蛋白的Post結(jié)構(gòu)類似。

由于Prefusion蛋白結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定，存在多種中間體，在前期實驗中，McLellan團隊利用已知結(jié)構(gòu)的HPIV5 prefusion蛋白對RSV prefusion蛋白的結(jié)構(gòu)進行模擬和預(yù)測[28]，提出RSV F蛋白極可能存在類似的Prefusion結(jié)構(gòu)。接下來，為了解析Prefusion的準確結(jié)構(gòu)，McLellan團隊在F蛋白基因上分別進行一系列的基因突變以穩(wěn)固Prefusion狀態(tài)，選取其中的優(yōu)勢突變質(zhì)粒(敲除C端的穿膜區(qū)肽段，C端引入了三聚體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定肽，凝血酶切割位點，6個His標簽以及Streptag標簽)與針對Prefusion的單克隆抗體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)[29]。該復(fù)合物制備并純化后進行晶體結(jié)構(gòu)解析，從結(jié)構(gòu)上看，Prefusion是一個致密的橢圓形三聚體結(jié)構(gòu)，其中部有一個空腔(圖1A)。RSV F蛋白胞外域部分約有470個氨基酸，其中約300個在Prefusion和Postfusion間是相對保守的，差異部分基本都位于F1的C端和N端(圖1C、D)。pre-F蛋白的近膜端包含F(xiàn)2-N端和F1-C端，其由1個三層β折疊及3個螺旋(α8、α9和α10)組成的，其中α10螺旋延伸到病毒膜中。而遠膜端包含F(xiàn)1-N端和F2-C端，由7個螺旋(α1-α7)形成的三股反向平行折疊組和β折疊發(fā)夾(β3+β4)組成(圖1C)。3個原聚體(Protomer)相互接觸從而穩(wěn)固三聚體的結(jié)構(gòu)(圖1A)。在Prefusion轉(zhuǎn)變?yōu)镻ostfusion的過程中，F(xiàn)1 N端的變化最為明顯，有5個二級結(jié)構(gòu)會重排為更延展的α螺旋，這5個二級結(jié)構(gòu)分別是α2、α3、α4、β3和β4(圖1C、D)。大部分特異性靶向Prefusion的抗體結(jié)合在F1的C端或者N端，而與Prefusion和Postfusion均有反應(yīng)的抗體，它們的結(jié)合位點基本位于變構(gòu)前后的保守性區(qū)域。

2 融合蛋白的表位研究

隨著呼吸道合胞病毒融合蛋白結(jié)構(gòu)的解析，新的中和表位也被逐步發(fā)現(xiàn)，目前確認的代表性表位及其對應(yīng)抗體有：SiteⅠ：131-2a[30]；SiteⅡ：1129[31]、Palivizumab[32]、Motavizumab[33]；SiteⅢ：MPE8[34]；SiteⅣ：101F[35]；SiteⅤ：7.936；SiteⅥ：7.916和9.432[36]；SiteⅦ：hRSV90[37]；Site ?： D25、5C4、AM22[29](表1、圖2)。此外，還發(fā)現(xiàn)一株特異性結(jié)合Prefusion三聚體表位的抗體AM14[38]。由于F蛋白存在變構(gòu)現(xiàn)象，部分表位會由于結(jié)構(gòu)的扭曲或延展而消失。其中，SiteⅠ、SiteⅡ、SiteⅣ～Ⅵ在Prefusion及Postfusion結(jié)構(gòu)均存在，而其中代表性的中和表位是SiteⅡ和SiteⅣ。針對這兩個表位的抗體雖不能阻斷病毒吸附，但是可以通過阻斷病毒粒子與宿主細胞膜的融合來中和感染[39]。

圖1 RSV Prefusion蛋白及Postfusion蛋白的二級結(jié)構(gòu)比較[29]Fig.1 Comparision of Pre- and Postfusion secondary structure[29]

表1 RSV F蛋白表位情況

圖2 RSV Prefusion現(xiàn)有的中和表位情況[54]Fig.2 Current neutralizing epitopes on RSV prefusion[54]

2.1SiteⅡ SiteⅡ的代表性抗體是鼠源抗體1129[31]、人源化的Palivizumab[40]與其二代抗體Motavizumab[33]。F蛋白對這些抗體的逃逸突變位于F1的Asn262、Asn268和Lys272，結(jié)合表位橫跨了aa 255-276。從Motavizumab與RSV-F復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)可以看到，該表位形成了一個螺旋-環(huán)-螺旋(Helix-loop-helix)結(jié)構(gòu)，Motavizumab識別的是這兩個螺旋[41]。雖然這個表位是由不連續(xù)的殘基組成，但仍然聚合成一個20氨基酸的線性肽段，使SiteⅡ可以成為免疫及疫苗發(fā)展的潛力靶標。

Lopez團隊曾用該表位的肽段免疫，但并沒有激起中和抗體[31]，其實從結(jié)構(gòu)上可以發(fā)現(xiàn)，保持螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)對抗體識別是至關(guān)重要的，所以一旦破壞了該空間結(jié)構(gòu)，就無法有效激起抗體。McLellan團隊為了穩(wěn)固該結(jié)構(gòu)，曾嘗試將表位放置于一個含有逆平行α螺旋的支架蛋白上，但該重組蛋白免疫后并不能顯著提高小鼠體內(nèi)的中和抗體滴度[42]。Schief團隊則通過計算機設(shè)計和納米粒子展示的方法，生產(chǎn)出了Motavizumab表位支架，該蛋白能在恒河猴體內(nèi)激起類似Motavizumab的中和抗體[43]。雖然激起的體內(nèi)抗體滴度較低，但這個設(shè)計理念提出了一個精確研究免疫反應(yīng)的方法。

2.2Site Ⅳ 另一個在Prefusion和Postfusion均存在的重要表位是SiteⅣ，該表位的代表性抗體是101F，該抗體的逃逸突變是F1的Arg429、Ile432、Lys433和Val447。101F和RSV-F復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)可見，結(jié)合位置橫跨了aa 422-438，這是一段線性結(jié)構(gòu)[28]。在RSV的Prefusion和Postfusion結(jié)構(gòu)上，這段肽段位于半胱氨酸富集區(qū)的7*beta鏈中最外側(cè)的β18上。對101F與RSV F胞外結(jié)合區(qū)域建模，發(fā)現(xiàn)Site Ⅳ區(qū)域在空間結(jié)構(gòu)上比這段線性肽段更大且更復(fù)雜，還包括了額外的beta折疊。這個發(fā)現(xiàn)也解釋了101F與線性肽段的反應(yīng)性比與RSV F的反應(yīng)性弱10 000倍的原因[28]。最近，Schuster團隊從人體內(nèi)分離出了一株可中和包含RSV在內(nèi)的四種副黏病毒的抗體，研究者預(yù)測該抗體識別RSV F上的Site Ⅳ位點[44]。綜上可知，SiteⅣ是廣譜中和抗體的靶標，有望用于被動性預(yù)防免疫。

2.3Site ? Melero團隊在人血清中發(fā)現(xiàn)大部分的中和活性并不是由Postfusion引起的，從而確定了特異性靶向Prefusion結(jié)構(gòu)抗體的存在[13]，Graham團隊同樣也發(fā)現(xiàn)人血清中的中和活性大部分來源于Prefusion特異性抗體[45]。RSV F上的其余表位SiteⅢ、SiteⅧ、Site ?就是Prefusion的特異性表位。D25、5C4、AM22是第一批被發(fā)現(xiàn)的Prefusion特異性的抗體，其中和效價比Palivizumab高5倍以上，其中D25和AM22是通過將志愿者提供的B細胞進行永生化后使用AIMM療法后分離得到的[46]，5C4是廈門大學(xué)夏寧邵團隊用質(zhì)粒免疫小鼠后通過雜交瘤腹水純化獲得的鼠源抗體[29]。這三株抗體均有高中和活性且檢測不到與Postfusion RSV F的反應(yīng)性。綜合X射線晶體學(xué)和電子顯微鏡的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)三株抗體均特異性結(jié)合在Prefusion RSV F三聚體的遠膜端頂部，該位點被命名為Site ?。該表位包括了F1的α4螺旋(aa 196-209)和F2的部分區(qū)域(aa 62-69)。這兩個區(qū)域在由Prefusion變構(gòu)為Postfusion的過程中均發(fā)生了巨大的變化，α4螺旋甚至翻轉(zhuǎn)了180°。這些結(jié)構(gòu)間的巨大變化正好印證了抗體的Prefusion特異性，也間接說明了Fusion抑制劑的機理。其中Prefusion特異性抗體D25可以與單體F(Monomeric F)結(jié)合[47]，說明單體與三聚體Prefusion構(gòu)象有類似結(jié)構(gòu)域。

2.4SiteⅧ 近期，Crowe團隊從一位8歲兒童外周血單核細胞分離得到能與Prefusion(SC-TM)[48]特異性反應(yīng)的B細胞，處理為雜交瘤細胞株[49]后進行表達鑒定，發(fā)現(xiàn)hRSV90這株抗體對A/B亞型均有很好的中和活性，且有Prefusion特異性。為了確定新抗體的結(jié)合位置情況，研究者將各表位的代表性抗體與hRSV90進行競爭實驗，發(fā)現(xiàn)hRSV90能完全阻斷SiteⅡ和Site ?，就此將hRSV90的結(jié)合區(qū)域定義為表位SiteⅧ。為了進一步了解新表位的情況，研究者將RSV A2 SC-TM與hRSV90-Fab復(fù)合物進行了X射線晶體結(jié)構(gòu)建模分析，觀察到Fab位于SiteⅡ和Site ?間的界面，每個Fab僅結(jié)合一個原聚體(Protomer)。分析hRSV90的結(jié)合界面可知，SiteⅧ主要區(qū)域是靠近螺旋-環(huán)-螺旋的aa 163-181并部分覆蓋SiteⅡ和Site ?。該表位的抗體易受周邊表位抗體的空間位阻影響，當hRSV90與D25，Motavizumab、AM14共結(jié)合時，會發(fā)生近90°的偏轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)移到RSV F的垂線。Site Ⅷ覆蓋了部分SiteⅡ和Site ?表位且能激發(fā)出高效中和抗體，其特殊位置可以為未來的疫苗設(shè)計提供新思路。

2.5SiteⅢ 其他的Prefusion特異性抗體，比如MPE8，同樣是分離自捐贈者的IgG+記憶B細胞，可以交叉中和四種副黏病毒。在MPE8發(fā)現(xiàn)初期，研究者預(yù)測其表位位于β2/β7附近，結(jié)合位點有Thr50、Asp305、Gly307、Ile309、Asp310,在結(jié)構(gòu)上位于SiteⅡ螺旋-環(huán)-螺旋的下方并包含了部分F2的區(qū)域[34]，研究者將其定義為SiteⅢ表位。近期Jardetzky團隊解析了MPE8與Prefusion RSV F(Ds-Cav1)[50]的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)MPE8橫跨了Prefusion三聚體相鄰的兩個亞基，是僅在Prefusion結(jié)構(gòu)存在的亞基間表位；MPE8結(jié)合七肽重復(fù)序列A(Heptad reaped A，HRA)上的β(aa 178，180,184-187)[51]，該區(qū)域在Postfusion狀態(tài)時會重排為一段長螺旋并遠離MPE8原結(jié)合位置[29,52]，使該表位在Postfusion狀態(tài)時喪失；該區(qū)域在HRSV、BRSV、hMPV(人類偏肺病毒)、PMV(鼠肺炎病毒)間高度保守，基于此結(jié)構(gòu)MPE8才具有交叉中和活性。

類似的三聚體識別抗體AM14則是識別另一個聚體表位，并同樣橫跨兩個原聚體(Protomer F)，包括在Pre/Post轉(zhuǎn)變后顯著變化的區(qū)域。對AM14的逃逸突變位點Leu160、Asn183、Asn426、Arg429，從晶體結(jié)構(gòu)解析可知，該三聚體表位位于α2/α3、β3/β4的Loop環(huán)和另一個Protomer的β17/β18 Loop環(huán)。通過反應(yīng)性分析發(fā)現(xiàn)AM14是特異性結(jié)合弗林蛋白酶切割后的Prefusion F三聚體，這是存在于病毒粒子表面的F成熟形態(tài)[38]。這些結(jié)果說明Prefusion F三聚體包含有單體F不具備的高中和表位，這更有助于設(shè)計RSV F疫苗抗原。

Prefusion新表位的發(fā)現(xiàn)對有效預(yù)防RSV感染的研究有著深遠影響。這些表位激發(fā)的抗體中和效價比Palivizumab強10倍以上，促進了針對F蛋白三聚體和Prefusion的抗體藥物的研發(fā)[13]。此外，由于Prefusion特異性抗體可以穩(wěn)固F蛋白的Pre結(jié)構(gòu)，有研究者便參考抗原抗體復(fù)合物結(jié)構(gòu)對F蛋白進行改造，其中，Graham團隊利用D25與Site ?的結(jié)合界面對F進行突變來穩(wěn)固Prefusion結(jié)構(gòu)[50]，其中最好的突變體DS-Cav1，能在小鼠和恒河猴的體內(nèi)免疫出高滴度中和抗體。而且Prefusion上有所有已知的中和表位[47]，這個特性更易于在體內(nèi)激起高效價抗體。目前，以Prefusion為研究基礎(chǔ)的亞單位疫苗作為RSV候選疫苗也正在研發(fā)中[53]。

3 結(jié)語

綜上所述，近期關(guān)于RSV融合蛋白F結(jié)構(gòu)、表位的研究，包括分離出新的F特異性抗體并由此發(fā)現(xiàn)新的高中和表位，都對RSV疫苗的發(fā)展起到了推動作用。目前對RSV F的Prefusion和Postfusion的結(jié)構(gòu)以及中和表位結(jié)構(gòu)的解析，讓研究者意識到特定的結(jié)構(gòu)即可激起高效價的中和抗體，尤其是Prefusion構(gòu)象上的表位。那么如何維持融合蛋白的Prefusion狀態(tài)或者設(shè)計出與高中和抗體表位類似結(jié)構(gòu)就成為疫苗設(shè)計的關(guān)鍵。此外，疫苗可以通過這些抗體的結(jié)合表位結(jié)構(gòu)為依托進行優(yōu)化。在疫苗免疫后如何才能在體內(nèi)激起高中和抗體且避免產(chǎn)生無用抗體則是目前研究者的主要探究方向。

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[收稿2017-03-17 修回2017-04-03]

(編輯 倪 鵬)

①本文為國家自然科學(xué)基金(No.81401668、No.81361120408)項目和國家自然科學(xué)基金委員會(NSFC)與美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)合作研究項目(No.81161120419)。

R373.1

A

1000-484X(2017)10-1568-06

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.10.028

曹健力(1992年-)，女，在讀碩士，主要從事呼吸道合胞病毒抗體改造及真核表達系統(tǒng)方面的研究，E-mail：jenny_cao422@163.com。

及指導(dǎo)教師：鄭子崢(1982年-)，男，博士，副教授，主要從事戊型肝炎病毒及呼吸道合胞病毒感染機制方面研究，E-mail:zhengzizheng@xmu.edu.cn。