侯娟娟 張志峰 張吉平 席維岳 鄭紅軍 趙海燕 李 娟

(慶陽(yáng)市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，慶陽(yáng) 745000)

PCR-熒光探針?lè)z測(cè)慶陽(yáng)地區(qū)丙型肝炎病毒基因型①

侯娟娟 張志峰 張吉平 席維岳 鄭紅軍 趙海燕 李 娟

(慶陽(yáng)市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，慶陽(yáng) 745000)

目的應(yīng)用PCR-熒光探針?lè)ǚ治鰬c陽(yáng)地區(qū)丙型肝炎患者基因型，并對(duì)PCR-熒光探針?lè)ǖ母鞣N性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法收集慶陽(yáng)地區(qū)289例各種丙型肝炎患者的臨床資料和外周靜脈血，采用PCR-熒光探針?lè)z測(cè)其基因型，并和PCR-反向點(diǎn)雜交法、測(cè)序法進(jìn)行比較。結(jié)果289份HCV RNA 陽(yáng)性血清標(biāo)本中，PCR-熒光探針?lè)ɑ蛐图皝喰蜋z出率為99.3%(287/289),其中1b型139例(48.1%)，2a型136例(47.1%)，3a型7例(2.4%),3b型5例(1.7%),未分出型2例(0.7%)。PCR-熒光探針?lè)ǖ奶禺惗群蜏?zhǔn)確度為100%，重復(fù)性良好，并與PCR-反向點(diǎn)雜交法、巢式PCR測(cè)序法分型結(jié)果均一致，三種方法的一致率為98.2%(56/57)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。1b基因型患者ALT、AST、PLT和HCVRNA(lg)水平均高于2a基因型患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論慶陽(yáng)地區(qū)HCV 基因型呈現(xiàn)多基因型分布特點(diǎn)，主要為1b 型和2a 型，且2a型和1b型的比例相當(dāng)，呈現(xiàn)出2a 型比例升高，1b型下降的趨勢(shì)；PCR-熒光探針?lè)℉CV基因分型敏感度和特異度高，方法簡(jiǎn)單,適合臨床實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用。

PCR-熒光探針?lè)?；慶陽(yáng)；丙肝；基因型

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)慢性感染可導(dǎo)致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化，部分患者可發(fā)展為肝硬化甚至肝細(xì)胞癌，對(duì)患者的健康和生命危害極大[1]。HCV基因分型在疾病的感染、傳播、診斷、診療、預(yù)防等方面均有重要意義。雖然基因測(cè)序是HCV分型的金標(biāo)準(zhǔn)，但其操作繁瑣、程序復(fù)雜、成本過(guò)高，難以對(duì)較大樣本進(jìn)行分析，因此在臨床工作中不可行。近年，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的HCV基因分型方法有很多，但是均存在操作復(fù)雜、結(jié)果鑒定開(kāi)放式或分管多步等缺陷[2]。本研究使用PCR-熒光探針?lè)ǚ治鰬c陽(yáng)地區(qū)的丙型肝炎患者基因型，并對(duì)此方法的各種性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，以評(píng)估PCR-熒光探針?lè)℉CV基因分型在臨床應(yīng)用中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1資料 按照中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)、中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)制定的《丙型肝炎防治指南(2015更新版)》[3]，收集慶陽(yáng)地區(qū)市醫(yī)院和中醫(yī)院傳染科住院及門(mén)診各種丙型肝炎患者289例(抗-HCV陽(yáng)性，HCV RNA ≥ 5×103IU/ml),其中,男166例,女123例,年齡20～70歲,平均為(47.73 ± 16.54)歲。在治療之前按照設(shè)計(jì)方案采取患者血液后分離血清，-70℃保存，用于后續(xù)檢測(cè)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)抗-HCV陽(yáng)性、HCV RNA<5×103IU/ml；(2)合并其他病毒感染：HAV、HBV、HEV、CMV、EB；(3)合并免疫性、藥物性、酒精性、中毒性疾病及肝損害者。

1.2方法

1.2.1血液學(xué)指標(biāo)的采集與檢測(cè) 抽取靜脈血，用日本AU2700全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)；用mindray BC-5800血球分析儀測(cè)定白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(Hb)、血小板(PLT)。

1.2.2HCVRNA檢測(cè) 試劑為中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供，方法為 RT-PCR-熒光探針?lè)?，儀器為 ABI 7500 熒光PCR 擴(kuò)增儀。

1.2.3PCR-熒光探針?lè)中头?采用廈門(mén)泰普生物科學(xué)有限公司生產(chǎn)的HCV基因分型檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。選取HCV五種亞型的保守區(qū)域，設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異性引物和探針，運(yùn)用一步法RT-PCR技術(shù)和Taqman熒光探針技術(shù)，實(shí)時(shí)檢測(cè)五種HCV亞型(1b、2a、3a、3b和6a)特異性探針的熒光信號(hào)。所用儀器為ABI 7500熒光PCR擴(kuò)增儀。

1.2.3.1RNA提取 采用泰普生物HCV分型試劑盒所配套的核酸提取試劑提取病毒核酸，嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.3.2PCR 擴(kuò)增 往40 μl各組反應(yīng)體系中(1b亞型組、2a/6a亞型組、3a/3b亞型組 HCV RT-PCR 反應(yīng)液38 μl和酶系2 μl)分別加入樣本或質(zhì)控品的RNA提取產(chǎn)物各10 μl，混勻，總反應(yīng)體積50 μl；然后將待測(cè)PCR反應(yīng)管小心置于PCR擴(kuò)增檢測(cè)儀中。按下列程序條件擴(kuò)增：42℃ 30 min；95℃ 3 min；94℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 30 s，10個(gè)循環(huán)；94℃ 15 s，60℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)。熒光探針參數(shù)設(shè)置：所有檢測(cè)孔均設(shè)置為FAM-TAMAR 和JOE-TAMAR，在60℃ 45 s 階段收集熒光信號(hào)。

1.2.3.3結(jié)果判斷 反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline 的Start 值、End 值以及Threshold 值。點(diǎn)擊Analysis 自動(dòng)獲得分析結(jié)果，在Report界面察看結(jié)果。

1.2.4PCR-反向點(diǎn)雜交法 采用RT-PCR 體外擴(kuò)增法結(jié)合反向點(diǎn)雜交技術(shù)，由中山達(dá)安基因公司生產(chǎn)的HCV基因分型試劑盒檢測(cè)(具體操作詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū))。

1.2.5測(cè)序分型 采用巢式PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物采用2%瓊脂糖電泳進(jìn)行確認(rèn)有預(yù)期目的條帶后送上海生工公司進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1PCR-熒光探針?lè)ɑ蚍中徒Y(jié)果 289份HCV RNA 陽(yáng)性血清標(biāo)本中，PCR-熒光探針?lè)ɑ蛐图盎騺喰蜋z出率為99.3%(287/289)，2例HCV 基因分型不確定。287份基因分型明確標(biāo)本中，其中1b型139例(48.1%)，2a型136例(47.1%)，3a型7例(2.4%),3b型5例(1.7%)。具體結(jié)果判斷如下。見(jiàn)圖1。

2.2PCR-熒光探針?lè)ǖ拿舾卸?、特異度、?zhǔn)確度和重復(fù)性 289 份標(biāo)本中除2例HCV 基因分型不確定外，其余均被PCR-熒光探針?lè)z出，最低檢出量為 5×103IU/ml。 30 份HBV DNA陽(yáng)性、HCV RNA 陰性血清標(biāo)本分型均為陰性，特異度為100%。以測(cè)序結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，PCR-熒光探針?lè)鞔_分型的55份標(biāo)本與測(cè)序分型完全一致，準(zhǔn)確度為100%(55/55)。對(duì)其中30份已分出型(1b型17例，2a型13例)的丙型肝炎患者血清標(biāo)本進(jìn)行PCR-熒光探針?lè)ㄖ貜?fù)分型檢測(cè)，兩次檢測(cè)結(jié)果一致，并且其CV值<10%。

2.3PCR-熒光探針?lè)ㄅcPCR-反向點(diǎn)雜交法、測(cè)序結(jié)果的對(duì)比 對(duì)PCR-熒光探針?lè)鞔_分型的55份標(biāo)本和2例基因分型不確定的標(biāo)本，進(jìn)行PCR-反向點(diǎn)雜交法、巢式PCR測(cè)序法檢測(cè)。三種結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，PCR-熒光探針?lè)鞔_分型的55份標(biāo)本，PCR-反向點(diǎn)雜交法、巢式PCR測(cè)序法分型結(jié)果與其均一致。2例基因分型不確定的標(biāo)本，PCR-反向點(diǎn)雜交法也未能分型，測(cè)序法分型其中1例3a型，另外1例也未分出型。三種分型方法的一致率為98.2%(56/57)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

圖1 PCR-熒光探針?lè)℉CV基因分型結(jié)果Fig.1 Genotype for hepatitis C by PCR-fluorescent probe Note: A. FAM channel positive curve; B. JOE channel positive curve.

表2 不同基因型的丙型肝炎患者部分臨床指標(biāo)比較

表1 PCR-熒光探針?lè)ㄅcPCR-反向點(diǎn)雜交法、測(cè)序法分型結(jié)果的比較(例)

2.4不同基因型的丙型肝炎患者治療前部分臨床指標(biāo)比較 289 例慢性丙型肝炎患者中，1b 基因型患者 ALT、AST、PLT 和 HCVRNA(lg)水平均高于 2a 基因型患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。1b 基因型和2a 基因型患者的 WBC 和 Hb 水平比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。3a有8例，3b有5例，不參與比較。見(jiàn)表2。

3 討論

HCV呈全球性流行，不同性別、年齡、種族人群均對(duì)HCV易感[4]。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全球HCV的感染率約為3%，估計(jì)約1.85億人感染，每年因HCV感染導(dǎo)致的死亡病例約35萬(wàn)例[5,6]。HCV基因組呈現(xiàn)高度異質(zhì)性,根據(jù)HCV基因組核苷酸序列的差異程度,可將HCV分為6個(gè)基因型和70多種亞型[7,8]。

我國(guó)HCV感染者不同地區(qū)、不同人群的基因型及亞型分布有很大差異。蘇迎盈[9]、聶紅明等[10]最新研究表明，中國(guó)流行最廣泛的HCV基因亞型為1b及2a，以1b型為主，基因2a型的比例由南向北逐漸增高；北方地區(qū)基因型較單一，以1b和2a型為主；南方地區(qū)以1b型為主，2a、3a、3b及6a型各自占較大比例；隨著時(shí)間推移，全國(guó)各地亞型類(lèi)型逐年增多。本研究發(fā)現(xiàn)，甘肅省慶陽(yáng)地區(qū)HCV基因型呈現(xiàn)多基因型分布特點(diǎn)，和我國(guó)北方大部分地區(qū)略有不同，以1b型和2a型為主，但2a型和1b型的比例相當(dāng)，其中1b型139例(48.1%)，2a型136例(47.1%)，呈現(xiàn)出2a 型比例升高，1b型下降的趨勢(shì)，這和彭雪彬等[11]報(bào)道有部分一致性。其他亞型相對(duì)較少，3a型為2.8%(PCR-熒光探針?lè)z出7例，測(cè)序法檢出1例),3b型為1.7%。說(shuō)明慶陽(yáng)地區(qū)近幾年由于流動(dòng)人口、獻(xiàn)血者、涉毒人員等因素，HCV基因型分布狀況在迅速發(fā)生改變。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)1b基因型患者ALT、AST、PLT和HCVRNA(lg)水平均高于2a基因型患者(P<0.05)，而1b 基因型和2a 基因型患者的WBC和Hb 水平比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,和聶紅明等[12]報(bào)道一致。ALT 和AST可以提示肝臟炎性反應(yīng)的程度，不同基因型患者肝細(xì)胞損害的嚴(yán)重程度可能也有差別，1b型患者可能更容易出現(xiàn)肝臟損害。

HCV RNA基因分型結(jié)果有非常重要的臨床意義，有助于判定HCV治療的難易程度及制定抗病毒治療的個(gè)體化方案?；驕y(cè)序被認(rèn)為是目前HCV分型的金標(biāo)準(zhǔn)，但其操作繁瑣、程序復(fù)雜、成本過(guò)高，難以對(duì)較大樣本進(jìn)行分析，因此在臨床工作中不可行。近年來(lái)有一些新的HCV 分型方法相繼被報(bào)道，如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析法、型特異性引物PCR 法、型特異性探針核酸雜交分析法和基因芯片法等，這些方法的特異度和靈敏度有較大差異，也存在儀器設(shè)備復(fù)雜、操作繁瑣、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、成本高等缺點(diǎn)，亦不能滿(mǎn)足臨床需求[13]。本研究采用PCR-熒光探針?lè)ǚ治鰬c陽(yáng)地區(qū)HCV患者基因型，289 份標(biāo)本中除2例HCV 基因分型不確定外，其余均被PCR-熒光探針?lè)z出。此方法的靈敏度高，特異度為100%，重復(fù)性良好，并且其CV 值<10%。與PCR-反向點(diǎn)雜交法、巢式PCR測(cè)序法比較，三種方法分型結(jié)果均一致，準(zhǔn)確度為100%。2例基因分型不確定的標(biāo)本，測(cè)序法分型其中1例3a型，可能是由于此標(biāo)本3a亞型的濃度偏低以至于PCR-熒光探針?lè)](méi)有分出。綜上所述，PCR-熒光探針?lè)ǚ中驮噭└鞣矫嫘阅芰己?，可滿(mǎn)足臨床HCV 基因分型檢測(cè)的需求，優(yōu)于之前的類(lèi)似研究[14]。

由于本研究納入樣本數(shù)量較少，在時(shí)間選擇上比較局限，這些均有可能對(duì)研究結(jié)果造成一定的影響。在接下來(lái)的研究中，我們會(huì)進(jìn)一步對(duì)PCR-熒光探針?lè)ǚ中驮噭┑男阅茉u(píng)價(jià)、慶陽(yáng)地區(qū)HCV基因型分布特征、HCV基因型臨床意義等進(jìn)行大樣本的分析研究。

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[收稿2017-04-16 修回2017-06-29]

(編輯 張曉舟)

·啟事·

《臨床肝膽病雜志》2018年征稿征訂

《臨床肝膽病雜志》于1985年創(chuàng)刊。是中華人民共和國(guó)教育部主管、吉林大學(xué)主辦、中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)學(xué)術(shù)支持的我國(guó)首個(gè)肝膽胰疾病專(zhuān)業(yè)雜志?？?hào)ISSN 1001-5256，CN 22-1108/R。

本刊在2016年《中國(guó)科技期刊引證報(bào)告(核心版)》中影響因子為1.127；在擴(kuò)展版中影響因子為1.428。在15種消化病學(xué)類(lèi)核心期刊中，影響因子和綜合評(píng)價(jià)總分均位列第三。

本刊為“中國(guó)科技論文統(tǒng)計(jì)源期刊”(中國(guó)科技核心期刊)。被俄羅斯《文摘雜志》(AJ)、美國(guó)《化學(xué)文摘》(CA)、美國(guó)《劍橋科學(xué)文摘》(CSA)、波蘭《哥白尼索引》(IC)、英國(guó)《國(guó)際農(nóng)業(yè)與生物科學(xué)研究中心》(CABI)、世界衛(wèi)生組織《西太平洋地區(qū)醫(yī)學(xué)索引》(WPRIM)等海內(nèi)外二十家數(shù)據(jù)庫(kù)收錄。

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GenotypingofhepatitisCvirusbyPCR-fluorescentprobeinQingyangarea

HOUJuan-Juan,ZHANGZhi-Feng,ZHANGJi-Ping,XIWei-Yue,ZHENGHong-Jun,ZHAOHai-Yan,LIJuan．
ClinicalLaboratory,thePeople′sHospitalofQingyangCity,Qingyang745000,China

Objective:To detect the genotyping of hepatitis C virus by PCR-fluorescent probe in Qingyang area,and to evaluate the performance of PCR-fluorescent probe.MethodsThe clinical data and peripheral venous blood of patients with HCV were collected(n=289).PCR-fluorescent probe was used to detect the genotype and HCV RNA of hepatitis C virus,and compare with PCR reverse dot blot,RT nested-PCR.ResultsAmong 289 samples detected by PCR-fluorescent probe,the rate of genotyping of hepatitis C virus was 99.3%(287/289)，and 139 for 1b(48.1%)，136 for 2a(47.1%)，7 for 3a(2.4%)，5 for 3b(1.7%),2 for unknow(0.7%).The specificity and efficiency was 100%,better repeatability,consistent with PCR reverse dot blot and RT nested-PCR(98.2%,P>0.05).The ALT,AST,PLT and HCVRNA(lg)for 1b patients was higher than 2a(P<0.05).ConclusionMulti-genotype distribution of HCV was revealed in the hepatitis C patients of Qingyang,1b and 2a were the main genotypes,and the ratio was equal，2a was increased,1b was declined．The sensibility and specificity was higher for PCR-fluorescent probe,and could be used in clinic.

PCR-fluorescent probe method;Qingyang;Hepatitis C virus;Genotype

①本文為甘肅省衛(wèi)生行業(yè)科研計(jì)劃項(xiàng)目(GSWSKY-2014-49)。

R446.9R512.6

A

1000-484X(2017)10-1526-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.10.017

侯娟娟(1983年- )，女，碩士，副主任檢驗(yàn)師，主要從事臨床免疫學(xué)與分子生物學(xué)方面研究，E-mail:997336471@qq.com。