李 瑜 陳 恩 陳純靜 曾凡勝 周 琳 曾 威

(益陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，益陽 413000)

MIC基因多態(tài)性與解脲脲原體感染的易感關(guān)聯(lián)性研究

李 瑜 陳 恩①陳純靜②曾凡勝 周 琳 曾 威③

(益陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，益陽 413000)

目的研究MIC等位基因多態(tài)性與解脲脲原體感染易感性之間的關(guān)聯(lián)性。方法采用PCR-SSP和PCR-SBT方法對(duì)樣本MIC等位基因的多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果解脲脲原體患者中檢出12種MICA、5種MICA-STR和14種MICB等位基因；和對(duì)照組相比較，解脲脲原體患者組中MICA* 010和MICB*009N等位基因分布頻率更高(MICA* 010:OR=3.85，95%CI：2.12-6.99，Pc<0.05;MICB*009N:OR=3.22，95%CI：1.33-7.80，Pc<0.05)，MICA-A5.1和MICB*00502等位基因分布頻率更低(MICA-A5.1：OR=0.61，95%CI：0.40-0.94，Pc<0.05；MICB*00502：OR=0.58，95%CI：0.40-0.83，Pc<0.05)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；基因型方面，MICA*010/010、MICA*01201/01201純合子分布頻率更高(MICA*010/010：OR=14.84，95%CI：1.90-115.9，Pc<0.05；MICA*01201/01201：OR=10.83，95%CI：1.35-86.79，Pc<0.05)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；解脲脲原體患者中MICB*00502/00502純合子分布頻率較高，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pc>0.05)。結(jié)論MIC等位基因多態(tài)性與解脲脲原體的易感性間存在關(guān)聯(lián)性。

MIC 基因；基因多態(tài)性；解脲脲原體

解脲脲原體(Ureaplasma urealyticum，UU)亦稱溶脲脲原體，是常見的性傳播性疾病病原體，雖然解脲脲原體感染的常規(guī)應(yīng)對(duì)方案為抗生素治療，但由于感染后癥狀不明顯，易被忽視而延誤診治，常導(dǎo)致持續(xù)感染；持續(xù)感染時(shí)可導(dǎo)致組織進(jìn)行性破壞和形成組織瘢痕，引起嚴(yán)重的并發(fā)癥和后遺癥，如男性的附睪炎、尿道炎、女性的子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎、異位妊娠、輸卵管性不孕等多種疾病[1,2]。

MIC是主要組織相容性復(fù)合體 Ⅰ 類相關(guān)基因(Major histocompatibility complex class Ⅰ chain-related gene，MIC)，MIC基因家族又稱PERB11，毗鄰HLA-B基因，屬非經(jīng)典的MHC Ⅰ 類基因家族，1994年由美國西雅圖大學(xué)研究中心Spies教授領(lǐng)導(dǎo)的研究隊(duì)伍報(bào)道[3]。MIC基因位于人類第6號(hào)染色體短臂，具有廣泛的多態(tài)性[4]。MIC基因家族包括MICA、MICB、MICC、MICD、MICE、MICF和MICG 7個(gè)基因，其中只有MICA、MICB是有功能的基因，具有編碼、轉(zhuǎn)錄、表達(dá)蛋白的功能，MICA/MICB編碼產(chǎn)物與HLA Ⅰ類分子極其相似，包括信號(hào)肽、胞外α1、α2和α3結(jié)構(gòu)，跨膜區(qū)和胞漿尾巴，但不與β2球蛋白結(jié)合。MICA/MICB是NK細(xì)胞表面NKG2D分子的配體，MICA/MICB與NK細(xì)胞表面NKG2D分子結(jié)合后，可以通過調(diào)節(jié)NK細(xì)胞功能來發(fā)揮重要的作用。

研究表明，MIC基因的多態(tài)性與多種疾病易感性相關(guān)，但暫無與中國南方人群解脲脲原體患者易感性相關(guān)的報(bào)道[5-7]。因此本研究以南方漢族解脲脲原體人群為研究對(duì)象，以健康人群作為正常對(duì)照，對(duì)MIC基因多態(tài)性及解脲脲原體易感性之間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 122名解脲脲原體患者來自于湖南省益陽市中心醫(yī)院2012年10月至2016年2月的就診患者，且根據(jù)病史及相關(guān)檢測(cè)，排除有其他病原體感染的患者。患者平均年齡34.5歲(23～61歲)，其中女性81例(66%)，男性41例(34%)。137 例健康人群作為對(duì)照，年齡33.0歲(18～65歲)，其中女性95例(69%)，男性42例(31%)。研究對(duì)象相互間無親緣關(guān)系，均知情同意，并符合倫理委員會(huì)的相關(guān)要求。

1.2方法

1.2.1外周血基因組DNA 的提取 收集新鮮的EDTA抗凝靜脈血2 ml，采用WHO推薦的標(biāo)準(zhǔn)鹽析法提取gDNA[8]，測(cè)定波長(zhǎng)260 nm和280 nm 的OD 值，A260 /A280值在1.6～1.8范圍內(nèi)為宜。

1.2.2MIC基因分型方法 采用PCR-SSP(PCR sequence-specific primers)[9,10]與PCR-SBT(PCR sequence-based typing)[11,12]兩種不同的方法對(duì)樣本進(jìn)行MIC基因分型。大部分樣本采用PCR-SSP方法進(jìn)行分型，考慮到部分罕見MIC等位基因型別無法用PCR-SSP方法分析，采用PCR-SBT方法分析。PCR-SBT方法參照文獻(xiàn)[13,14]，采用Chromas Lite 2.01 軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，掃描MIC多態(tài)位點(diǎn)，進(jìn)行人工判讀并與MIC序列數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，獲得相應(yīng)的MIC等位基因型別。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 MIC等位基因頻率、MIC基因型頻率、Hardy-Weinberg equilibrium(HWE)采用SHESIS軟件進(jìn)行計(jì)算獲得。關(guān)聯(lián)性分析采用Logistic回歸進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性檢驗(yàn)采用Fisher精確概率檢驗(yàn)進(jìn)行，對(duì)P值采用Bonferroni校正后得到的Pc值在5%水平上進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1Hardy-Weinberg 平衡吻合度檢驗(yàn) 所選擇的健康對(duì)照經(jīng)Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗(yàn)分析表明，各等位基因的分布理論頻率與觀察頻率之間無顯著性差異，表明本實(shí)驗(yàn)所選樣本是符合Hardy-Weinberg 平衡的隨機(jī)婚配群體。

2.2MICA 等位基因多態(tài)性與解脲脲原體相關(guān)性分析 解脲脲原體患者中共檢出12 種MICA 等位基因，其中MICA*019、MICA*010、MICA*00201是患者組中分布頻率最高的3種等位基因，分別占20.1%、19.3%、19.3% 。和對(duì)照組相比較，解脲脲原體患者組中MICA* 010等位基因分布頻率顯著偏高(20.1% vs 5.8%)，MICA*010等位基因可能對(duì)解脲脲原體易感(OR=3.85，95%CI：2.12-6.99，Pc<0.05)，見表1。

2.3MICA-STR基因多態(tài)性與解脲脲原體關(guān)聯(lián)性分析 解脲脲原體患者中共檢出 5種MICA-STR等位基因，其中MICA-A5在解脲脲原體患者組中分布頻率最高，占39.3%。與對(duì)照組比較，解脲脲原體患者組中MICA-A5.1等位基因分布則顯著降低(16.8% vs 24.8%，OR=0.61，95%CI：0.40-0.94，Pc<0.05)，可能對(duì)解脲脲原體感染不易感，見表2。

2.4MICA 基因型與解脲脲原體相關(guān)性分析 和對(duì)照組基因型比較，解脲脲原體患者組MICA*010/010、MICA*01201/01201純合子分布頻率顯著增高(MICA*010/010：9.8% vs 0.7%；MICA*01201/01201：7.4% vs 0.7%)； MICA*010/010、MICA*01201/01201純合子可能對(duì)解脲脲原體易感(MICA*010/010：OR=14.84，95%CI：1.90-115.9，Pc<0.05；MICA*01201/01201：OR=10.83，95%CI：1.35-86.79，Pc<0.05)，見表3。

2.5MICB 等位基因多態(tài)性與解脲脲原體相關(guān)性分析 解脲脲原體患者中共檢出14 種MICB 等位基因，其中MICB*00502、MICA*002是患者組中分布頻率最高的2種等位基因，分別占29.5%、18.4%。和對(duì)照組相比較，解脲脲原體患者組中MICB*00502等位基因分布頻率顯著偏低(29.5% vs 42.0%)，可能對(duì)解脲脲原體不易感(OR=0.58，95%CI：0.40-0.83，Pc<0.05)，而MICB* 009N等位基因分布頻率顯著偏高(7.8% vs 2.6%)，可能對(duì)解脲脲原體易感(OR=3.22，95%CI：1.33-7.80，Pc<0.05)，見表4。

2.6MICB 基因型與解脲脲原體相關(guān)性分析 解脲脲原體患者中MICB*00502/00502純合子分布頻率較高，與對(duì)照組相比較，MICB基因型與解脲脲原體易感性之間不存在相關(guān)性，見表5。

表1 MICA等位基因頻率在解脲脲原體患者與對(duì)照人群中的比較

Note：1)P<0.05.

表2 MICA-STR等位基因頻率在解脲脲原體感染患者與對(duì)照人群中的比較

Note：1)P<0.05.

表3 MICA基因型頻率在解脲脲原體感染患者與對(duì)照人群中的比較

Note：1)P<0.05.

表4 MICB等位基因頻率在解脲脲原體感染患者與對(duì)照人群中的比較

Note：1)P<0.05.

表5 MICB基因型頻率在解脲脲原體感染患者與對(duì)照人群中的比較

3 討論

解脲脲原體是常見的性傳播性疾病病原體，因感染后癥狀不明顯，易被忽視而延誤診治，導(dǎo)致組織進(jìn)行性破壞和形成組織瘢痕，引起嚴(yán)重的并發(fā)癥和后遺癥，如輸卵管性不孕等多種疾病?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，疾病的易感與遺傳多態(tài)性有關(guān)。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，MICA-A5.1和MICA*008等位基因與沙眼衣原體易感性呈負(fù)相關(guān)，帶有該等位基因的個(gè)體不易被沙眼衣原體所感染；何麗等[15]研究發(fā)現(xiàn)，中國北方漢族人群HLA-A基因多態(tài)性與SARS-Cov易感性相關(guān)；Zhao等[16]近來研究表明，功能性的MICA-129基因多態(tài)性與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病呈正相關(guān)。Gissel等[17]發(fā)現(xiàn)MICA*008型別為登革熱發(fā)病的易感基因，這些研究結(jié)果提示MICA/MICB在多種疾病感染與轉(zhuǎn)歸的過程中發(fā)揮了重要的作用，但解脲脲原體感染與MICA/MICB遺傳多態(tài)性之間的關(guān)系還未見報(bào)道。

我們采用PCR-SSP及PCR-SBT方法檢測(cè)了解脲脲原體感染患者組和對(duì)照組中MIC等位基因分布的頻率，首次報(bào)道了MIC等位基因在中國南方人群中解脲脲原體感染患者中的分布。解脲脲原體感染患者組中共檢出12種MICA 等位基因和14種MICB等位基因；和正常對(duì)照組相比較，MICA*010和MICB* 009N等位基因在解脲脲原體感染組分布頻率較高，可能是解脲脲原體易感等位基因(OR均大于1，且Pc<0.05)。解脲脲原體患者組中MICB*00502等位基因分布頻率顯著偏低，可能對(duì)解脲脲原體不易感(OR=0.58，Pc<0.05)。對(duì)基因型比較發(fā)現(xiàn)，解脲脲原體患者組MICA*010/010、MICA*01201/01201純合子分布頻率顯著增高，可能對(duì)解脲脲原體易感(OR均大于1，且Pc<0.05)。這些研究結(jié)果表明MIC等位基因多態(tài)性與解脲脲原體的易感性間存在關(guān)聯(lián)性，推測(cè)可能的致病機(jī)制是由于某些型別的MIC基因編碼的蛋白質(zhì)分子與NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞上的NKG2D受體親和力低，導(dǎo)致這些免疫細(xì)胞不能有效活化，對(duì)感染的病原體不能有效清除所致。

在本研究中，解脲脲原體感染患者組中MICA-A5.1等位基因分布則顯著降低，可能對(duì)解脲脲原體感染不易感(OR=0.61,Pc<0.05)。MICA-A5.1是在其跨膜區(qū)第5個(gè)GCT重復(fù)順序上再額外插入一個(gè)G堿基，形成GGCT序列，導(dǎo)致該基因發(fā)生了移碼突變，在TM區(qū)提早出現(xiàn)了終止密碼子，經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯時(shí)，蛋白質(zhì)翻譯提前結(jié)束從而缺少了胞漿區(qū)，形成了短尾的蛋白分子[18,19]；部分型別的MICA-A5.1在氨基酸129位置編碼纈氨酸(V)，能降低MICA蛋白與NKG2D受體的結(jié)合力，其原因在于129位置的M能夠與G136、A139、M140等氨基酸殘基之間形成疏水鍵，而129位置的纈氨酸則會(huì)破壞這一結(jié)構(gòu)，從而使得螺旋部位的構(gòu)象發(fā)生變化，最后導(dǎo)致對(duì)MICA與NKG2D的結(jié)合力產(chǎn)生影響[20]，降低了MICA蛋白與NKG2D的結(jié)合能力，導(dǎo)致活化的NK細(xì)胞數(shù)量偏少，于是NK細(xì)胞分泌的抵抗解脲脲原體感染的細(xì)胞因子降低，從而引起解脲脲原體的持續(xù)感染。

[1] Trinchieri A.Urinary calculi and infection[J].Urologia，2014,81(2):93-98.

[2] Baka S,Kouskouni E,Antonopoulou S,etal.Prevalence of Ureaplasma urealyticum and Mycoplasma hominis in women with chronic urinary symptoms[J].Urology，2009,74(1):62-66.

[3] Bahram S,Bresnahan M,Geraghty DE,etal.A second lineage of mammalian major histocompatibility complex class I genes[J].Proc Natl Acad Sci U S A，1994,91(14):6259-6263.

[4] Bahram S.MIC genes:from genetics to biology[J].Adv Immunol，2000,76:1-60.

[5] Glas J,Martin K,Brunnler G,etal.MICA,MICB and C1_4_1 polymorphism in Crohn′s disease and ulcerative colitis[J].Tissue Antigens，2001,58(4):243-249.

[6] Kimura T,Goto K,Yabuki K,etal.Microsatellite polymorphism within the MICB gene among Japanese patients with Behcet′s disease[J].Hum Immunol，1998,59(8):500-502.

[7] Lu M,Xia B,Li J,etal.MICB microsatellite polymorphism is associated with ulcerative colitis in Chinese population[J].Clin Immunol，2006,120(2):199-204.

[8] Gong Z,Luo QZ,Lin L,etal.Association of MICA gene polymorphisms with liver fibrosis in schistosomiasis patients in the Dongting Lake region[J].Braz J Med Biol Res，2012,45(3):222-229.

[9] Luo QZ,Lin L,Gong Z,etal.Positive association of major histocompatibility complex class I chain-related gene A polymorphism with leukemia susceptibility in the people of Han nationality of Southern China[J].Tissue Antigens，2011,78(3):178-184.

[10] Mei B,Luo Q,Du K,etal.Association of MICA gene polymorphisms with Chlamydia trachomatis infection and related tubal pathology in infertile women[J].Hum Reprod，2009,24(12):3090-3095.

[11] Chen E,Lin L,Chen CJ,etal.MIC gene polymorphism and haplotype diversity in Zhuang nationality of Southern China[J].Hum Immunol，2014,75(9):953-959.

[12] Lin L,Yang W,Chen E,etal.MIC gene polymorphism and haplotype diversity in Li nationality of Southern China[J].Tissue Antigens，2015,85(1):45-49.

[13] 李 瑜，陳純靜，王芙艷，等.MICB基因多態(tài)性與肺癌的易感關(guān)聯(lián)性研究[J].激光生物學(xué)報(bào),2016,25(1):69-74.

[14] Wang YJ,Zhang NJ,Chen E,etal.Allele polymorphism and haplotype diversity of MICA/B in Tujia nationality of Zhangjiajie,Hunan Province,China[J].Hum Immunol,2016,77(5):411-417.

[15] 何 麗，魏茂提，王世鑫，等.HLA-A基因多態(tài)性與SARS易感性及癥狀關(guān)系的研究[J].中國免疫學(xué)雜志，2011，27(7):630-633.

[16] Zhao J,Jiang Y,Lei Y,etal.Functional MICA-129 polymorphism and serum levels of soluble MICA are correlated with ulcerative colitis in Chinese patients[J].J Gastroenterol Hepatol，2011,26(3):593-598.

[17] Garcia G,Del PF,Perez AB,etal.Association of MICA and MICB alleles with symptomatic dengue infection[J].Hum Immunol，2011,72(10):904-907.

[18] Gaudieri S,Leelayuwat C,Townend DC,etal.Allelic and interlocus comparison of the PERB11 multigene family in the MHC[J].Immunogenetics，1997,45(3):209-216.

[19] Visser CJ,Tilanus MG,Tatari Z,etal.Sequencing-based typing of MICA reveals 33 alleles:a study on linkage with classical HLA genes[J].Immunogenetics，1999,49(6):561-566.

[20] Steinle A,Li P,Morris DL,etal.Interactions of human NKG2D with its ligands MICA,MICB,and homologs of the mouse RAE-1 protein family[J].Immunogenetics，2001,53(4):279-287.

[收稿2017-03-22 修回2017-05-25]

(編輯 倪 鵬)

StudyonassociationbetweenMICgenepolymorphismandureaplasmaurealyt-icuminfection

LIYu，CHENEn,CHENChun-Jing，ZENGFan-Sheng，ZHOULin，ZENGWei.
YiyangMedicalCollege,Yiyang413000,China

Objective:To investigate the association between MIC allele polymorphism and susceptibility to Ureaplasma urealyticum infection.MethodsPCR-SSP and PCR-SBT were used to analyze the gene polymorphism of every one.ResultsTwelve allele genes of MICA and five MICA-STR and fourteen MICB were found in the participants，the frequency of MICA*010 and MICB*009N were higher in ureaplasma urealyticum infection patients than in healthy controls(MICA* 010:OR=3.85,95%CI:2.12-6.99,Pc<0.05;MICB*009N:OR=3.22,95%CI:1.33-7.80,Pc<0.05);the frequencies of MICA-A5.1 and MICB*00502 were lower in ureaplasma urealyticum infection patients than in healthy controls(MICA-A5.1:OR=0.61,95%CI:0.40-0.94,Pc<0.05;MICB*00502:OR=0.58,95%CI:0.40-0.83,Pc<0.05),the differences were statistically significant;MICA*010/010,MICA*01201/01201 homozygote were higher in ureaplasma urealyticum infection patients than in healthy controls(MICA*010/010:OR=14.84,95%CI:1.90-115.9,Pc<0.05:MICA*01201/01201:OR=10.83,95%CI:1.35-86.79,Pc<0.05)，the differences were statistically significant.The distribution frequency of MICB*00502/00502 in patients with ureaplasma urealyticum was higher,but the difference was not statistically significant(Pc>0.05).ConclusionMIC allele gene polymorphism may be associated with ureaplasma urealyticum infection.

MIC alleles;Gene polymorphism;Ureaplasma urealyticum

①南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院，衡陽 421001。

②長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410219。

③益陽市中心醫(yī)院，益陽 413000。

R392

A

1000-484X(2017)10-1478-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.10.008

李 瑜(1984年-)，女，碩士，講師，主要從事遺傳免疫學(xué)方面研究，E-mail:120819273@qq.com。