程 璐 王青青

(浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所，杭州 310058)

SAMHD1對(duì)HBVDNA形成的抑制作用及其機(jī)制研究

程 璐 王青青

(浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所，杭州 310058)

目的研究不同肝細(xì)胞SAMHD1表達(dá)水平及其對(duì)HBV DNA形成的抑制作用和相關(guān)機(jī)制。方法通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot法檢測(cè)Jurkat、THP-1、HepG2、HepG2.2.15和Huh7細(xì)胞等細(xì)胞SAMHD1 mRNA和蛋白表達(dá)水平；通過對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒和shRNA，升高或者降低SAMHD1的表達(dá)水平，觀察不同SAMHD1表達(dá)水平對(duì)HBV DNA水平的影響；補(bǔ)充不同濃度的dNTP，比較不同dNTP濃度對(duì)HBV DNA水平的影響。結(jié)果肝癌細(xì)胞系有較高的SAMHD1表達(dá)水平；降低SAMHD1可以使HBV DNA水平升高2.3～2.8倍，升高SAMHD1可以使HBV DNA降低至33%左右(P<0.01)；升高dNTP濃度可以促進(jìn)HBV DNA的合成水平，抵消SAMHD1的抑制作用。結(jié)論SAMHD1可以抑制肝癌細(xì)胞內(nèi)HBV DNA的生成，可能是通過降低細(xì)胞內(nèi)dNTP濃度實(shí)現(xiàn)的。

SAMHD1； HBV； 肝癌細(xì)胞；dNTP； DNA； 宿主限制因子

宿主進(jìn)化出不同的機(jī)制來(lái)對(duì)抗和防御病毒的感染。通過不斷表達(dá)宿主限制因子來(lái)介導(dǎo)固有免疫反應(yīng)是近期來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種獨(dú)斷病毒感染的有效方式，與傳統(tǒng)的天然免疫機(jī)制有一定的差別[1]。SAMHD1(Sterile alpha motif and HD-domain containing protein 1)是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)抗病毒宿主限制因子，并且可以調(diào)控機(jī)體固有免疫應(yīng)答[2-4]，它的主要功能是將胞內(nèi)的dNTP水解成脫氧核苷和無(wú)機(jī)的三磷酸，從而降低核內(nèi)dNTPs的濃度，是參與細(xì)胞核酸代謝的重要酶[4,5]。包括HIV-1在內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄病毒在感染時(shí)首先要通過逆轉(zhuǎn)錄酶將自身RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA，這個(gè)過程需要高濃度的dNTP供應(yīng)，而SAMHD1則通過水解dNTP降低逆轉(zhuǎn)錄所需要的“原料”濃度，進(jìn)而限制了這些逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制水平。最近的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，SAMHD1可以通過限制DNA復(fù)制來(lái)抑制未分裂的髓系細(xì)胞內(nèi)的DNA病毒感染[6]。

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是一種DNA病毒，可導(dǎo)致肝硬化、肝衰竭和肝細(xì)胞肝癌等，并且每年造成約100萬(wàn)人死亡[7]。HBV雖然不是逆轉(zhuǎn)錄病毒，但在其生命周期中存在一個(gè)從RNA轉(zhuǎn)錄到DNA的逆轉(zhuǎn)錄的過程，類似于慢病毒的逆轉(zhuǎn)錄過程。研究發(fā)現(xiàn)，人類的肝臟中可以表達(dá)SAMHD1分子[8]，但目前對(duì)于HBV的復(fù)制是否能夠被肝細(xì)胞中表達(dá)的SAMHD1所阻斷仍然不清楚。有研究報(bào)道，SAMHD1的dNTP水解酶活性對(duì)HBV復(fù)制有抑制作用[8-10]。本文中，我們研究了SAMHD1對(duì)肝癌細(xì)胞中HBV復(fù)制的影響，發(fā)現(xiàn)SAMHD1能夠顯著抑制細(xì)胞外HBV DNA和細(xì)胞內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水平，但對(duì)HBV RNA和cccDNA水平無(wú)影響，外源性dNTP能夠解除SAMHD1的抑制作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系、試劑及儀器 Jurkat、THP-1、HepG2、HepG2.2.15和Huh7細(xì)胞等細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)，鼠抗人SAMHD1和GAPDH單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)R&D公司，dNTP混合液購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，Jurkat和THP-1細(xì)胞用含有10%胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)和1%青鏈霉素的RPIM1640(美國(guó)HyClone公司)完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；HepG2、HepG2.2.15和Huh7細(xì)胞用含有2%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM(美國(guó)HyClone公司)培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)瓶至于5% CO2的37℃恒溫孵箱中。

1.2方法

1.2.1Western blot 收集大約1×106個(gè)細(xì)胞，用200 μl 細(xì)胞裂解液(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)于冰上30充分裂解細(xì)胞，用8 000×g離心10 min，取上清液，用BCA protein assay kit試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度(美國(guó)Pierce公司)，用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品。將收取的細(xì)胞裂解液按照每孔相同蛋白量上樣，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上，用50 g/L的脫脂牛奶封閉后，加入1～2 μg/ml的鼠抗人SAMHD1一抗溫育4℃過夜，用HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗溫育2 h后進(jìn)行顯色曝光。提取的胞漿蛋白和核蛋白同法檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)GAPDH作為參照。

1.2.2熒光定量PCR反應(yīng) 用Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)或者miRNeasy Mini Kit試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)提取樣本中的總RNA，實(shí)驗(yàn)步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行?？俁NA用大連寶生物公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系為20 μl。用羅氏公司的SYBR Green kit試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，使用DNA Engine Chromo 4 Real-time quantitative PCR system(美國(guó)Bio-Rad公司)PCR儀，所用反應(yīng)體系為：模板1 μl，10 mmol/L引物各2 μl，2×PCR混合液25 μl，加去離子水至50 μl，反應(yīng)條件均為：94℃ 3 min，94℃ 30 s，55℃ 1 min，72℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。引物如表1所示。

1.2.3細(xì)胞外HBV DNA水平檢測(cè) 用Qiagen公司總DNA提取試劑盒提取細(xì)胞上清總DNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)HepG2.2.15 HBV DNA水平，分別采用0、10、100、1 000、10 000、100 000和1 000 000拷貝/ml的pAAV/1.2HBV質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，計(jì)算細(xì)胞外HBV DNA的相對(duì)拷貝數(shù)。所用引物序列如表1所示，所用試劑盒、反應(yīng)體系如SAMHD1 mRNA中所述。反應(yīng)條件為：95℃ 3 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。

1.2.4SAMHD1 RNAi和過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 通過PCR法擴(kuò)增SAMHD1全長(zhǎng)片段，所用引物如表1中所示，將擴(kuò)增好的SAMHD1全長(zhǎng)片段用Sal I和EcoR V雙酶切后克隆入pCDNA3.1質(zhì)粒的相應(yīng)多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建SAMHD1過表達(dá)質(zhì)粒。SAMHD1 shRNA和Control Scr shRNA片段序列根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[10]由上海吉瑪公司合成。將構(gòu)建好的SAMHD1過表達(dá)質(zhì)粒和SAMHD1 shRNA或Control Scr shRNA片段分別轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞接種于96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為10 000，至細(xì)胞生長(zhǎng)至80%孔面積時(shí)，用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)Life Technologies公司)轉(zhuǎn)染，按照說(shuō)明書操作。每孔質(zhì)?；蚱斡昧繛?.3 μg，脂質(zhì)體用量為1 μl，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，每種設(shè)6個(gè)重復(fù)孔。48 h后采用表1中的引物，按照步驟3所述熒光定量PCR法檢測(cè)SAMHD1 mRNA和HBV DNA水平。

表1 引物及片段序列

2 結(jié)果

2.1SAMHD1在不同肝癌細(xì)胞系中的表達(dá) 在蛋白質(zhì)水平和mRNA水平，SAMHD1在Jurkat細(xì)胞中低表達(dá)，THP-1細(xì)胞中高表達(dá)，與先前研究結(jié)果一致；三種肝癌細(xì)胞系HepG2、HepG2.2.15和Huh7中SAMHD1表達(dá)水平均較高，其中蛋白質(zhì)水平與THP-1細(xì)胞未見顯著差異，mRNA水平略低于THP-1細(xì)胞(P<0.05，圖1)。

2.2SAMHD1表達(dá)水平對(duì)肝癌細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制的影響 通過RNAi敲低SAMHD1的表達(dá)，或者轉(zhuǎn)染SAMHD1過表達(dá)質(zhì)粒升高SAMHD1表達(dá)，檢測(cè)不同SAMHD1表達(dá)水平對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞中HBV復(fù)制的影響。結(jié)果顯示，RNAi可以顯著降低SAMHD1的表達(dá)水平至25%～33%，過表達(dá)質(zhì)?？梢陨逽AMHD1表達(dá)水平至4～5倍(P<0.01，圖2A)；SAMHD1表達(dá)降低后細(xì)胞外HBV DNA水平升高2.3～2.8倍，SAMHD1過表達(dá)后細(xì)胞外HBV DNA水平降低至1/3左右(P<0.01，圖2B)。

2.3不同dNTP濃度對(duì)肝癌細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制的影響 我們進(jìn)一步檢測(cè)改變dNTP濃度是否會(huì)影響SAMHD1對(duì)HBV復(fù)制的抑制效果。分別用0、1、2、3 mmol/L的dNTP處理HepG2.2.15細(xì)胞和轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒的HepG2.2.15細(xì)胞24 h，結(jié)果顯示，升高培養(yǎng)基中dNTP濃度可以顯著提高HBV的復(fù)制，2～3 mmol/L的dNTP可以將細(xì)胞外HBV DNA水平升高2倍左右(P<0.01，圖3)；高濃度的dNTP可以對(duì)抗SAMHD1對(duì)HBV復(fù)制的抑制效果，2～3 mmol/L 的dNTP 可以完全抵消SAMHD1的抑制效果，3 mmol/L的dNTP可以將轉(zhuǎn)染了SAMHD1過表達(dá)質(zhì)粒的肝癌細(xì)胞外HBV DNA水平升高至1.5～1.9倍(P<0.01，圖3)。

圖1 不同細(xì)胞系中SAMHD1的蛋白和mRNA表達(dá)水平Fig.1 Levels of SAMHD1 protein and mRNA in different cell linesNote:*.P<0.05,**.P<0.01.

圖2 不同SAMHD1表達(dá)水平對(duì)細(xì)胞外HBV DNA的影響Fig.2 Effect of different SAMHD1 expression on extra-cellular HBV DNA levelsNote:SAMHD1 expression in HepG2.2.15 was knocked down by shRNA,or increased by over-expression vectors.Fluorescence quantitative PCR was used to detect(A) relative SAMHD1 mRNA levels and(B) extracellular HBV DNA levels.Levels of HBV DNA in Mock group were defined as 1.**.P<0.01.

圖3 不同dNTP濃度對(duì)肝癌細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制的影響Fig.3 Effect of different dNTP concentration on HBV replication in liver cancer cellsNote:HepG2.2.15 cells with and without over-expressed SAMHD1 were treated with 0,1,2 and 3 mmol/L dNTP for 24 h.Fluorescence quantitative PCR was used to detect extracellular HBV DNA levels.Levels of HBV DNA in untreated HepG2.2.15 cells were defined as 1.**.P<0.01.

3 討論

SAMHD1是最新發(fā)現(xiàn)的一種HIV-1宿主限制因子，如同核苷類似物一類的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑一樣，都是限制病毒的逆轉(zhuǎn)錄過程[2-6]。SAMHD1可以被來(lái)自HIV-2和部分SIV來(lái)源的輔助蛋白Vpx降解，因此對(duì)于這些病毒，SAMHD1不具有限制性[5]。但HIV-1在進(jìn)化過程中丟失了Vpx蛋白，雖然有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，與Vpx功能相近的Vpr蛋白也有部分抗SAMHD1的作用，但僅限于某些SIV，HIV-1的Vpr蛋白不具有此功能[11]。因此，不同于其他HIV-1宿主限制因子，SAMHD1是目前已知的HIV-1唯一無(wú)法對(duì)抗的宿主限制因子[12]。HBV雖然是DNA病毒，但在其生命周期中存在從RNA到DNA的復(fù)制過程，類似于HIV-1的逆轉(zhuǎn)錄過程。SAMHD1是否對(duì)HBV的復(fù)制過程有抑制作用目前尚不清楚。

本研究首先檢測(cè)了SAMHD1在不同肝癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，我們的研究結(jié)果顯示，SAMHD1可以高表達(dá)于三種肝癌細(xì)胞系HepG2、HepG2.2.15和Huh7中，其表達(dá)水平略低于單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞，但顯著高于CD4+T細(xì)胞系Jurkat細(xì)胞。最近研究發(fā)現(xiàn)，HIV-1難以感染單核細(xì)胞的主要原因是在單核細(xì)胞中存在著高水平的SAMHD1表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致dNTP低于HIV-1逆轉(zhuǎn)錄所需的水平，而低表達(dá)SAMHD1的CD4+T細(xì)胞則對(duì)HIV-1易感[13]。我們的研究表明，肝癌細(xì)胞系中高表達(dá)的SAMHD1可能對(duì)HBV復(fù)制起抑制作用。進(jìn)一步通過過表達(dá)和敲低HepG2.2.15細(xì)胞中SAMHD1的表達(dá)水平，觀察不同SAMHD1表達(dá)水平對(duì)HBV DNA水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，表達(dá)高水平的SAMHD1可以顯著抑制HBV DNA的水平，而敲低SAMHD1表達(dá)后HBV DNA水平明顯升高，這些結(jié)果表明，SAMHD1對(duì)HBV DNA的生成有顯著的抑制作用，可能進(jìn)一步抑制HBV的感染。

SAMHD1的主要生物學(xué)功能是水解dNTP，降低細(xì)胞內(nèi)的dNTP水平，SAMHD是否通過降低dNTP水平抑制HBV DNA的生成尚不清楚。我們進(jìn)一步研究了不同dNTP濃度對(duì)SAMHD1抑制HBV DNA生成作用，結(jié)果顯示高濃度的dNTP可以顯著促進(jìn)HBV DNA的生成，甚至可以完全對(duì)抗SAMHD1的抑制作用。因此，我們的結(jié)果表明SAMHD1是通過水解dNTP來(lái)抑制HBV DNA的生成的，另有研究報(bào)道，SAMHD1還可以促進(jìn)干擾素的生成來(lái)抑制HBV DNA的生成[9,10]，詳細(xì)的機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。

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[收稿2017-03-17 修回2017-06-06]

(編輯 張曉舟)

InhibitoryeffectofSAMHD1onproductionofHBVDNA

CHENGLu,WANGQing-Qing.
InstituteofImmunology,SchoolofBasicMedicalScience,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China

Objective:To study the expression levels of SAMHD1 in different liver cancer cells and the inhibition of HBV DNA production by SAMHD1.MethodsSAMHD1 mRNA and protein levels in Jurkat,THP-1,HepG2,HepG2.2.15 and Huh7 were detected by Real-time quantitative PCR and Western blot.SAMHD1 expression in HepG2.2.15 was increased by transfecting SAMHD1 over expression vectors or was inhibited by transfecting SAMHD1 specific shRNA,and then HBV DNA levels were detected.The effect of different dNTP concentration on HBV DNA production was detected also.ResultsSAMHD1 were highly expressed in liver cancer cells.Decreased SAMHD1 expression could enhance HBV DNA production by 2.3-2.8 times,and increased SAMHD1 expression could inhibit HBV DNA levels by 3 times(P<0.01).Increased dNTP concentration could enhance HBV DNA production and counteract the inhibitory effect of SAMHD1.ConclusionSAMHD1 can inhibit the production of HBV DNA in liver cancer cells by decreasing dNTP concentration.

SAMHD1;HBV;Liver cancer cells;dNTP;DNA;Host restriction factors

R392.11

A

1000-484X(2017)10-1474-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.10.007

程 璐(1984年-)，女，主管技師，主要從事臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究,現(xiàn)工作于浙江醫(yī)院。

及指導(dǎo)教師：王青青(1971年-)，女，博士，教授，系主任，主要從事免疫醫(yī)學(xué)研究，E-mail：wqq@zju.edu.cn。