張 劍，侯曉強(qiáng)，付亞娟*

(1.廊坊職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北 廊坊 065000；2.廊坊師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河北 廊坊 065000；3.河北省高校食藥用菌應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，河北 廊坊 065000；4.廊坊市食用菌技術(shù)重點實驗室，河北 廊坊 065000)

基于高通量測序分析大花杓蘭根際土壤細(xì)菌多樣性

張 劍1，侯曉強(qiáng)2,3,4，付亞娟2,3,4*

(1.廊坊職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北 廊坊 065000；2.廊坊師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河北 廊坊 065000；3.河北省高校食藥用菌應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，河北 廊坊 065000；4.廊坊市食用菌技術(shù)重點實驗室，河北 廊坊 065000)

【目的】從分子水平上對珍稀瀕危藥用植物大花杓蘭根際土壤細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行初步探討。【方法】通過Illumina Miseq高通量測序技術(shù)對大花杓蘭根際土壤細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4高變區(qū)片段進(jìn)行測序，而后進(jìn)行生物信息學(xué)分析。【結(jié)果】共得到166,847條16S rRNA基因序列?；凇?7 %的相似度水平，通過聚類共獲得1549個可操作分類單元 (operational taxonomic units,OTUs)。大花杓蘭根際土壤細(xì)菌在門、綱、目、科和屬分類水平上的優(yōu)勢類群分別為變形菌門Proteobacteria (39.67 %)、α-變形菌綱α-Proteobacteria (24.72 %)、根瘤菌目Rhizobiales (11.11 %)、鞘脂單胞菌科Sphingomonadaceae (7.13 %)和鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas(6.27 %)?！窘Y(jié)論】首次揭示了大花杓蘭根際土壤細(xì)菌群落的多樣性，為進(jìn)一步探究大花杓蘭與其根際細(xì)菌的相互關(guān)系以及大花杓蘭的遷地保育奠定了基礎(chǔ)。

大花杓蘭；根際細(xì)菌；細(xì)菌多樣性；高通量測序

【研究意義】大花杓蘭(CypripediummacranthumSw.)為蘭科杓蘭屬多年生草本植物，主要分布于我國東北、內(nèi)蒙古、北京、河北、山西和臺灣等地，俄羅斯、日本和朝鮮半島也有分布[1]。大花杓蘭不僅是名貴的觀賞花卉，還是我國瀕危的藥用植物，具有治療全身浮腫、小便不利、風(fēng)濕性腰腿痛、跌打損傷等作用[2]。旅游開發(fā)、棲息地的破壞及人為采挖，致使大花杓蘭野生種群數(shù)量急劇減少，迫切需要開展其人工組培繁殖和保育等方面的研究。目前大花杓蘭組培苗生長緩慢，出瓶后很難正常生長繁殖，制約其規(guī)?；斯し敝?。由于土壤微生物對植物根系的發(fā)育、植物的生長具有促進(jìn)作用，其根際微生物的多樣性、根際微生物的生態(tài)功能成為目前國內(nèi)外的研究熱點?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】蘭科植物與菌根真菌關(guān)系十分密切，無論是蘭科植物種子萌發(fā)、幼苗生長，還是植株形成都離不開菌根真菌。國內(nèi)外學(xué)者對大花杓蘭內(nèi)生真菌群落多樣性、以及利用菌根真菌來促種子萌發(fā)和幼苗促生長等方面進(jìn)行了研究，大花杓蘭種子的共生萌發(fā)、非共生萌發(fā)和快速繁殖技術(shù)已取得了一定進(jìn)展[3-9]，但由于原球莖誘導(dǎo)率低、褐化死亡率高、幼苗生長緩慢，目前仍處于少量微繁殖(Micropropagation)階段?！颈狙芯壳腥朦c】已有研究表明，多種蘭科植物不同組織中存在細(xì)菌，并對蘭科植物的生長發(fā)育有著重要的生物學(xué)功能，如促進(jìn)蘭科植物種子萌發(fā)[10]、加快植株生長[11]和增強(qiáng)抗逆性[12]。大花杓蘭作為蘭科瀕危藥用植物之一，其內(nèi)生或根際土壤細(xì)菌的相關(guān)研究國內(nèi)外尚未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以北京百花山地區(qū)的大花杓蘭根際土壤為研究對象，采用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)對其細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)片段進(jìn)行測序并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，從分子水平上揭示了大花杓蘭根際土壤細(xì)菌群落的多樣性，以期為將來深入研究大花杓蘭根際土壤細(xì)菌的潛在的生態(tài)功能、大花杓蘭人工組培繁殖和遷地保育研究提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2015年6月，在北京百花山國家自然保護(hù)區(qū)高山草甸采集大花杓蘭根際土壤。采取五點采樣法，將5個樣點的根際土壤樣品混勻，裝入無菌自封袋中，當(dāng)天帶回實驗室，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 土壤基因組DNA的提取

采用土壤DNA提取試劑盒(FastDNA SPIN Kit for Soil，USA)分離土壤總DNA，其操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。0.7 %瓊脂糖凝膠電泳對土壤DNA的完整性進(jìn)行檢測。

1.3 PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)

以提取的土壤基因組DNA為模板，338F 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和806R 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′為引物，PCR擴(kuò)增16S rRNA基因序列的V3～V4高變區(qū)。PCR反應(yīng)體系：5×Q5 Reaction Buffer 10 μl，基因組DNA 40～60 ng，10 mM dNTP 1 μl，338F和806R引物(10 μM)各1.5 μl，Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 0.5 μl，High GC Enhancer 10 μl，ddH2O補(bǔ)至總體系50 μl。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72℃ 30 s，15 循環(huán)；72 ℃最后延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測后，委托北京百邁克生物科技有限公司對16S rRNA基因序列V3～V4區(qū)進(jìn)行高通量測序(Illumina公司MiSeq測序儀)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與生物信息學(xué)分析

采用FLASH[13]軟件對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，Trimmomatic[14]軟件對拼接序列進(jìn)行質(zhì)量過濾，而后用Mothur中UCHIME[15]程序去除嵌合體序列，獲得高質(zhì)量的Tags序列。在相似性≥97 %的水平上，對優(yōu)質(zhì)序列進(jìn)行操作分類單元(operation taxonomic unit，OTU)聚類，并過濾OUT(0.005 %作為閾值)；基于Silva119數(shù)據(jù)庫，使用RDP Classifier[16]程序?qū)UT代表的序列進(jìn)行物種分類?；?7 %的閾值確定稀釋度，使用Mothur計算細(xì)菌群落物種的豐富度和多樣性指數(shù)，包括Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大花杓蘭根際土壤DNA的提取

應(yīng)用土壤基因組提取試劑盒對大花杓蘭根際土壤DNA進(jìn)行抽提，0.7 %瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，所提取基因組的DNA條帶清晰明亮，表明DNA基本沒有降解，具有較好的完整性。采用NanoDrop 2000超微量分光光度計對土壤DNA的純度進(jìn)行檢測，其A260/280比值為1.80，表明所提取的土壤DNA純度較高，無RNA和蛋白質(zhì)的污染，可滿足后續(xù)實驗的要求。

2.2 細(xì)菌16S rRNA (V3～V4)的PCR擴(kuò)增結(jié)果

以大花杓蘭根際土壤總DNA為模板，338F和806R為引物，PCR擴(kuò)增16S rRNA基因序列的V3～V4可變區(qū)(圖2)。與圖2中泳道1陰性對照(以無菌Milli-Q水代替土壤DNA作為PCR反應(yīng)的模板)相比，泳道2出現(xiàn)1條明亮的單一DNA條帶，其大小約470 bp，與16S rRNA的V3～V4片段理論值基本相符，表明該DNA條帶是來自土壤細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4區(qū)域的特異性擴(kuò)增。

M: DNA Marker; 泳道1：大花杓蘭根際土壤基因組DNAM: DNA Marker; Lane 1: Genomic DNA of C.macranthum rhizosphric soil圖1 大花杓蘭根際土壤基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis of genomic DNA isolated from C.macranthum rhizosphric soil

M: DNA Marker; 泳道1：陰性對照；泳道2：細(xì)菌16S rRNA V3～V4 PCR產(chǎn)物M: DNA Marker; Lane 1: Negative control； Lane 2: PCR product of bacterial 16S rRNA V3-V4 region 圖2 細(xì)菌16S rRNA (V3～V4)PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR product of bacterial 16S rRNA V3-V4 region

2.3 測序結(jié)果分析

通過對細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4可變區(qū)進(jìn)行高通量測序，共產(chǎn)生242 730條原始序列，質(zhì)控后得到166 847條Clean tags?；凇?7 %的相似度水平，通過聚類分析共獲得1549個有效OTUs(表1)。

通常用稀釋性曲線(Rarefaction Curve)來說明樣品的測序數(shù)據(jù)量是否合理，并間接反映樣品中物種的豐富程度。以樣品中隨機(jī)抽取的測序條數(shù)為橫坐標(biāo)，并以基于該測序條數(shù)聚類得到的有效OTU數(shù)量為縱坐標(biāo)，繪制了大花杓蘭根際土壤樣品高通量測序結(jié)果的稀釋性曲線(圖3)。由圖3可知，土壤樣品的稀釋曲線逐漸趨于平坦，表明目前已獲得的測序數(shù)據(jù)量足以覆蓋了大多數(shù)細(xì)菌類群，基本能反映土壤樣品細(xì)菌群落的組成和種類。

2.4 大花杓蘭根際土壤細(xì)菌群落組成分析

對大花杓蘭根際土壤進(jìn)行高通量測序，共得到1549個OTUs，分屬于14門31綱48目77科130屬。從門分類水平來看，其優(yōu)勢細(xì)菌類群主要分在8個門，依次為變形菌門Proteobacteria(39.67 %)、放線菌門Actinobacteria(27.72 %)、酸桿菌門Acidobacteria(8.34 %)、芽單胞菌門Gemmatimonadetes(8 %)、綠彎菌門Chloroflexi(4.91 %)、擬桿菌門Bacteroidetes(4.72 %)、疣微菌門Verrucomicrobia(2.77 %)、浮霉菌門Planctomycetes(1.19 %)(圖4a)。

圖3 大花杓蘭根際土壤樣品高通量測序結(jié)果的稀釋性曲線Fig.3 Rarefaction curve of high throughput sequencing results of C.macranthum rhizosphric soil

從綱水平來看，相對豐度(>1 %)的11個綱所占比例總和達(dá)到88.57 %，依次為α-變形菌綱α-Proteobacteria(24.72 %)、放線菌綱Actinobacteria(15.94 %)、β-變形菌綱Betaproteobacteria(8.35 %)、芽單胞菌綱Gemmatimonadetes(8.0 %)、酸桿菌綱Acidobacteria(7.64 %)、嗜熱油菌綱Thermoleophilia(5.66 %)、酸微菌綱Acidimicrobiia(5.47 %)、r-變形菌綱Gammaproteobacteria(4.84 %)、Sphingobacteriia綱(3.52 %)、Spartobacteria綱(2.60 %)和δ-變形菌綱Deltaproteobacteria(1.73 %)(圖4b)。

從目水平來看，相對豐度(>1 %)的17個目所占比例總和達(dá)到75.1 %(圖4c)。相對豐度最大的5個目，依次為根瘤菌目Rhizobiales(11.11 %)、鞘脂單胞菌目Sphingomonadales(8.58 %)、芽單胞菌目Gemmatimonadales(7.67 %)、伯克氏菌目Burkholderiales(6.40 %)、酸微菌目Acidimicrobiales(5.57 %)。

從科水平來看，相對豐度(>1 %)的15個科所占比例總和達(dá)到68 %(圖2d)。豐度較高的優(yōu)勢菌科，依次為芽單胞菌科Gemmatimonadaceae(7.68 %)、鞘脂單胞菌科Sphingomonadaceae(7.13 %)、黃單胞菌科Xanthomonadaceae (3.42 %)、叢毛單胞菌科Comamonadaceae(3.25 %)、柄桿菌科Caulobacteraceae(3.18 %)、類諾卡氏菌科Nocardioidaceae(3.13 %)和慢生根瘤菌科Bradyrhizobiaceae(3.01 %)。

表1 大花杓蘭根際土壤樣品OUT豐度和ɑ多樣性指數(shù)Table 1 OUT richness and alphy diversity indices of rhizosphric soil from C.macranthum

注：CMB代表采自北京百花山自然保護(hù)區(qū)的大花杓蘭根際土壤。
Note: CMB represents rhizosphric soil ofC.macranthumcollected from Beijing Baihuashan National Nature Reserve.

圖4 采用高通量測序獲得大花杓蘭根際細(xì)菌群落豐度Fig.4 Relative abundance of C.macranthum rhizosphric bacteria analyzed by high throughput sequencing

從圖4e可以看出，在屬水平來上，相對豐度較大的6個屬為鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas(6.27 %)、芽單胞菌屬Gemmatimonas(4.09 %)、慢生根瘤菌屬Bradyrhizobium(2.67 %)、馬賽菌屬Massilia(2.61 %)、類諾卡氏屬Nocardioides(2.39 %)和分枝桿菌屬Mycobacterium(2.29 %)。

3 討 論

本研究采用Illumina MiSeq高通量測序平臺對大花杓蘭根際土壤細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行研究，初步獲得其根際細(xì)菌在門、綱、目、科、屬等不同分類水平上優(yōu)勢類群和相對豐度。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大花杓蘭根際土壤細(xì)菌在門和綱水平上的分類信息較為明確；在目、科和屬水平上尚未明確分類信息的類群所占比例較大，使得物種注釋時的分辨度降低；基本不能將細(xì)菌注釋到種的分類水平?？赡苁怯捎诒狙芯窟x用了16S rRNA的V3～V4可變區(qū)進(jìn)行高通量測序，而不是包含9個可變區(qū)總長約1540 bp的16S rRNA；高通量測序一般可以保證每個樣品測定幾萬個序列數(shù)，提高了測序深度和覆蓋度，但測序片段較短(約470 bp)，在一定程度上降低了物種注釋的分辨率。另外，16S rRNA基因的可變區(qū)的選擇也會影響分類信息的精確性。

蘭科植物根際微生物群落多樣性研究較少，尤其是杓蘭屬瀕危大花杓蘭根際微生物多樣性的探究目前尚未見報道。本研究以北京百花山自然保護(hù)區(qū)大花杓蘭根際土壤為研究對象，采用高通量測序技術(shù)對其細(xì)菌群落組成進(jìn)行初步分析。在97 %的相似度水平上，共獲得1549個細(xì)菌OTUs。通過與Silva數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，細(xì)菌可被分為變形菌門、放線菌門、酸桿菌門等14門，其中變形菌門為第一優(yōu)勢菌群，約占40 %。該研究結(jié)果與趙愛花等[17]的寶天曼國家級自然保護(hù)區(qū)落葉闊葉林土壤細(xì)菌、韓晶等[18]的新疆艾比湖濕地博樂河入口處土壤細(xì)菌、李新等[19]內(nèi)蒙古河套灌區(qū)不同鹽堿程度的土壤細(xì)菌、陳偉等[20]的納帕海高原濕地土壤細(xì)菌和隋心等[21]的三江平原小葉章濕地土壤細(xì)菌進(jìn)行對比分析發(fā)現(xiàn)，變形菌門通常是土壤中豐度最高的細(xì)菌類群，但在優(yōu)勢綱、科及屬的層面上卻存在著明顯的差異。以上研究結(jié)果充分體現(xiàn)了土壤細(xì)菌存在豐富的多樣性，不同類型的土壤中既存在各自獨特的優(yōu)勢類群，也有相似的類群。

大花杓蘭根際土壤細(xì)菌的優(yōu)勢屬為鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、馬賽菌屬(Massilia)、類諾卡氏菌屬(Nocardioides)和分枝桿菌屬(Mycobacterium)等。這與已報道的其他植物根際土壤細(xì)菌群落存在較大的差異。李鵬等[22]揭示小蓬竹根際土壤芽孢桿菌屬占絕對優(yōu)勢；陸曉菊等[23]研究發(fā)現(xiàn)三七根際土壤的優(yōu)勢菌群為伯克氏菌屬、節(jié)桿菌屬、鏈霉菌屬及芽孢桿菌屬；譚淵等[24]采用PCR-DGGE技術(shù)對黃連根際土壤細(xì)菌多樣性分析發(fā)現(xiàn)，已明確分類地位的優(yōu)勢菌群為嗜酸菌屬，芽孢桿菌屬，不動桿菌屬、呂沃爾菌屬和叢毛單胞菌屬；翅堿蓬根系土壤鹽單胞菌屬占最大比例，其次是海桿菌屬[25]。芽孢桿菌屬、伯克氏菌屬、鏈霉菌屬、嗜酸菌屬和節(jié)桿菌屬等在本研究中也被檢測到，但不作為優(yōu)勢菌群，而鹽單胞菌屬、海桿菌屬未發(fā)現(xiàn)。筆者認(rèn)為造成不同植物根際微生物種類及豐度差異顯著的原因，除了與檢測方法(傳統(tǒng)培養(yǎng)方法、PCR-DGGE和高通量測序技術(shù)等)、土壤類型、營養(yǎng)及所處環(huán)境有關(guān)以外，植物根系分泌物可能是影響根際微生物群落組成最為重要的因素。

已有研究表明，鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)和分枝桿菌屬(Mycobacterium)對杓唇石斛種子具有促萌發(fā)作用，并對四季豆根段有促生長作用[10]。本研究從大花杓蘭根際土壤中也檢測到了相對豐度較高的鞘氨醇菌屬和分枝菌屬，推測其可能對大花杓蘭種子萌發(fā)及幼苗生長也有促進(jìn)作用。慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)是具有固氮作用，能在寄主植物的根部膨大生成根瘤的一類細(xì)菌。慢生根瘤菌屬在大花杓蘭根際土壤中具有相對較高的豐度，其可能為大花杓蘭生長發(fā)育提供N素營養(yǎng)。鞘氨醇單胞菌屬、分枝桿菌屬和慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)是否具有上述的生物學(xué)功能，還需要將來從大花杓蘭根系環(huán)境中分離到相關(guān)菌株，并通過實驗深入探究其與宿主的相互關(guān)系。另外，瀕危物種大花杓蘭根際土壤中未被確定分類地位的細(xì)菌占有很大的比重，這說明在大花杓蘭根際土壤存在著廣泛的菌種資源，有待人們充分挖掘和深入研究。本研究只是首次采用高通量測序技術(shù)對其根際細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行了分析，而根中內(nèi)生細(xì)菌多樣性還需進(jìn)一步研究。鑒于蘭科植物內(nèi)生細(xì)菌與其生長、健康密切，下一步將要開展的工作是從大花杓蘭根及根際土壤中分離篩選菌根輔助細(xì)菌和促生細(xì)菌，以期為珍稀瀕危大花杓蘭的保育及規(guī)?；斯そM培繁殖奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究采用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)對瀕危藥用植物大花杓蘭根際土壤細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行初步探討，研究結(jié)果表明大花杓蘭根際土壤細(xì)菌具有較高的物種多樣性，其在門、綱、目、科和屬分類水平上的優(yōu)勢類群分別為變形菌門(Proteobacteria)、α-變形菌綱(α-Proteobacteria)、根瘤菌目(Rhizobiales)、鞘脂單胞菌科(Sphingomonadaceae)和鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)。

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RhizosphericBacteriaDiversityofCypripediummacranthumEstimatedviaHighThroughputSequencing

ZHANG Jian1,HOU Xiao-qiang2,3,4,FU Ya-juan2,3,4*

(1.Langfang Polytechnic Institute,Hebei Langfang 065000,China; 2.College of Life Science,Langfang Normal University,Hebei Langfang 065000,China; 3.Edible and Medicinal Fungi Research and Development Center of Hebei Universities,Hebei Langfang 065000,China; 4.Langfang Key Laboratory of Edible Fungi Technology,Hebei Langfang 065000,China)

【Objective】Rhizospheric bacteria diversity of medicinal plantsCypripediummacranthumendangered was preliminary explored at the molecular level.【Method】V3-V4 variable regions of 16S rRNA gene inC.macranthumrhizospheric soil were sequenced with the Illumina Miseq high throughput sequencing platform,and bioinformatics analysis of these sequences were then performed.【Result】A total of 166,847 partial 16S rRNA gene sequences were obtained.At the 97 % sequence similarity levels,1549 operational taxonomic units (OTUs) were identified based on UCLUST algorithm.At the classification level of phylum,class,order,family and genera,the dominant groups ofC.macranthumrhizospheric bacteria were Proteobacteria (39.67 %),α-Proteobacteria (24.72 %),Rhizobiales (11.11 %),Sphingomonadaceae (7.13 %),Sphingomonas(6.27 %),respectively.【Conclusion】The research revealed for the first time bacteria diversity inC.macranthumrhizospheric soil.The result of the study would be beneficial for further exploring the interaction betweenC.macranthumand its rhizospheric bacteria and other related scientific questions.

Cypripediummacranthum; Rhizospheric bacteria; Bacterial diversity; High throughput sequencing

1001-4829(2017)4-0811-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.4.017

2016-10-21

河北省教育廳青年拔尖人才項目(BJ2016045)；廊坊師范學(xué)院博士基金項目(LSLB201405)；廊坊師范人才引進(jìn)科研啟動項目(0140102001)；廊坊師范學(xué)院微生物學(xué)重點學(xué)科項目(2015001)

張 劍(1981-)，男，碩士，講師，研究方向：微生物學(xué)；E-mial: zhangjian810916@163.com，*為通訊作者：付亞娟(1981-)，女，博士，研究方向：分子微生物學(xué)；E-mial: fuyajuan501@163.com

Q938.1

A

(責(zé)任編輯 李 潔)