趙偉燁,劉 瑋,劉 勤,蔣先軍*

(1.西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶 400715；2.中國科學(xué)院土壤研究所，江蘇 南京 210008)

不同利用年限水稻土氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化研究

趙偉燁1,劉 瑋1,劉 勤2,蔣先軍1*

(1.西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶 400715；2.中國科學(xué)院土壤研究所，江蘇 南京 210008)

【目的】本文以利用年限分別為100、300、700、1000和2000年的水稻土及杭州灣海涂(0年)作為研究對象，探究對不同利用年限水稻土氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)隨著利用年限的變化而顯著變化。【方法】采用PCR-DGGE技術(shù)分析6個(gè)利用年限水稻土的氨氧化細(xì)菌群落組成?！窘Y(jié)果】利用PCR-DGGE得到的電泳圖像顯示不同利用年限水稻土樣品可檢測到的AOB的DGGE條帶數(shù)量均存在明顯差異?！窘Y(jié)論】不同利用年限對水稻土氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大的影響。

利用年限；水稻土；氨氧化細(xì)菌；群落結(jié)構(gòu)

在水稻種植過程中，稻田土壤都會經(jīng)歷多個(gè)干濕交替循環(huán)[5]，這為土壤微生物提供了獨(dú)特的生存環(huán)境。土壤微生物是使土壤具有生命力的最主要成分，在土壤形成和發(fā)育過程中起主要作用，是評價(jià)土壤質(zhì)量和肥力的一個(gè)重要指標(biāo)[6]。利用年限對微生物的各項(xiàng)生理指標(biāo)均會產(chǎn)生深刻影響。【前人研究進(jìn)展】胡君利等對水稻土的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著利用年限的延長，水稻土微生物生物量碳、氮，基礎(chǔ)呼吸，過氧化氫酶，轉(zhuǎn)化酶等均有不同程度的下降[7]，硝化作用強(qiáng)度和產(chǎn)甲烷等也趨向降低[8]。長期固定的耕作模式定向改變著土壤中微生物區(qū)系和微生物生物量。Caldwell等(1999)研究發(fā)現(xiàn)，森林生態(tài)系統(tǒng)轉(zhuǎn)變成農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)會導(dǎo)致土壤退化[9]，土壤微生物生物量在土壤開發(fā)利用后快速下降，并會隨著農(nóng)業(yè)耕種而降低[10]。在達(dá)到一定利用年限后，土壤微生物生物量的變化幅度明顯減少，即微生物群落大小達(dá)到一個(gè)相對穩(wěn)定的狀態(tài)[11]。另外，利用年限也會影響土壤中微生物群落的演替。浙江慈溪旱作農(nóng)田土壤在整個(gè)旱作過程中，微生物生物量C/N始終隨年限延長而顯著升高[12]，這說明土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)一直對利用年限的延長而變化。對浙江慈溪水稻土研究發(fā)現(xiàn)，水稻土在持續(xù)耕作之后，微生物群落的碳源利用特性發(fā)生了改變，微生物功能多樣性得到了一定的加強(qiáng)。但是一些調(diào)控溫室氣體排放的微生物過程如呼吸作用明顯下降，硝化作用和產(chǎn)甲烷勢等均趨于減弱[13]。

【本研究切入點(diǎn)】眾多研究表明，不同植被條件下，利用年限的長短均會不同程度地影響土壤的理化性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)，這對于認(rèn)識農(nóng)業(yè)開發(fā)的生態(tài)效應(yīng)以及土地的可持續(xù)利用具有重要意義?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)以采自浙江慈溪的不同利用年限水稻土為研究對象，探究不同利用年限對氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，為解釋農(nóng)業(yè)土壤的環(huán)境質(zhì)量演變規(guī)律和可持續(xù)利用機(jī)理提供基礎(chǔ)依據(jù)，并進(jìn)一步指導(dǎo)具體農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，保護(hù)和引導(dǎo)土壤向高肥力和可持續(xù)方向發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

浙江慈溪位于杭州灣南岸，介于北緯30°02′～30°24′和東經(jīng)121°02′～121°24′，海拔2.6～5.7 m。處于亞熱帶南緣，屬亞熱帶季風(fēng)氣候，年氣溫在-9.3～38.5 ℃，平均氣溫為16.3 ℃，無霜期246 d。年均降水量為1325.0 mm，平均日照為1933.5 h，平均風(fēng)速為2.7 m/s。土壤礦物主要為伊利石，高嶺石和蒙脫石。據(jù)慈溪水利志記載，現(xiàn)慈溪市境在6000多年前尚為淺海區(qū)，由江河輸入大海的陸地泥沙逐漸沉積堆高形成海涂，存在生物活動和有機(jī)質(zhì)、氮素等的積累，具有一定生產(chǎn)力。公元5世紀(jì)起，當(dāng)?shù)厝嗣耖_始圍涂開墾，并隨著海涂淤積的北移不斷增筑海塘，至今大部分地段已筑有十塘，建筑面積約有775 km2，按建筑年代大致可分為3片：南片——南境沿山北麓至大古塘以南，自公元5世紀(jì)開始成陸至公元10世紀(jì)(元代至正年間)，成陸歷時(shí)1500年；中片——大古塘以北至七塘，為11世紀(jì)至20世紀(jì)初所圍；北片——七塘至十塘，為20世紀(jì)中后葉圍成。由于各海塘修筑時(shí)間均有明確記載，現(xiàn)可根據(jù)海塘建筑年代來推算各海塘間水稻土的利用年限。

2015年11月依據(jù)海塘建筑年代核定各海塘間水稻土的利用年限，并采集在利用年限上具有明顯差距(50～2000年)的水稻土耕作樣品，0年土壤采樣點(diǎn)位于杭州灣灘涂，北緯30°19.5′，東經(jīng)121°8.82′；100年土壤采樣點(diǎn)位于慈溪市橋頭鎮(zhèn)小橋頭村車頭片，北緯30°09.2′，東經(jīng)121°20.3′；300年土壤采樣點(diǎn)位于慈溪市三北鎮(zhèn)公山村，北緯30°06.2′，東經(jīng)121°30.6′；700年土壤采樣點(diǎn)位于慈溪市周巷鎮(zhèn)大古塘村，北緯30°10.1′，東經(jīng)121°09.1′；1000年土壤采樣點(diǎn)位于慈溪市周巷鎮(zhèn)南周巷村，北緯30°09.5′，東經(jīng)121°06.9′；2000年土壤采樣點(diǎn)位于慈溪市掌起鎮(zhèn)任住溪村，北緯30°05.6′，東經(jīng)121°26.3′；采集的土樣于4 ℃冷存。土壤采集時(shí)各樣點(diǎn)稻田均處于落干狀態(tài)。所有土樣均發(fā)育于同一母質(zhì)(潮汐土壤)，其生態(tài)環(huán)境也一致。

1.2 采集與處理樣品

1.3 分析方法

1.3.1 土壤氨氧化細(xì)菌amoA功能基因定量分析 土壤微生物總DNA提取。采用FastDNA SPIN Kit For Soil (MP Biomedicals,LLC)試劑盒和FastPrep 24 bead-beating instrument (Qbiogene,Inc.)細(xì)胞裂解儀提取土壤總DNA。稱取0.50 g土壤樣品，按試劑盒操作說明的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行土壤微生物總DNA的提取，DNA樣品保存于-20 ℃待用。

amoA功能基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR分析。參照He等(2007)報(bào)道的方法[14]，可得到氨氧化細(xì)菌分子標(biāo)靶基因的重組質(zhì)粒，測定質(zhì)粒濃度，結(jié)合質(zhì)粒的分子質(zhì)量，計(jì)算得出氨氧化細(xì)菌的原始拷貝數(shù)為1.25×1023μl-1。以10倍梯度稀釋氨氧化細(xì)菌的質(zhì)粒，通過熒光實(shí)時(shí)定量PCR獲得氨氧化細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個(gè)樣品3次重復(fù)。

采用大連寶生物工程有限公司的SYBR Premix ExTaqTM Perfect Real Time試劑盒與CFX96 Real-Time PCR System 擴(kuò)增儀上進(jìn)行。氨氧化細(xì)菌的定量PCR分析的分子標(biāo)靶基因的引物序列為amoA-1F(GGGGTTTTCTAGGTGGT)及amoA-2R(CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC)，反應(yīng)條件為95℃,5.0 min;35個(gè)循環(huán)均為：95 ℃,30 s; 57 ℃,45 s; 72 ℃,1 min,85 ℃,5 s with plate read; Melt curve 65.0～95.0 ℃,increment 0.5 ℃,0:05+ ；PCR分析的分子標(biāo)靶基因的引物序列為amoA-1F-GC(CGCCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCGGGGTTTCTACTGGTGGT)及amoA-2R(CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC)，反應(yīng)條件為95 ℃,5.0 min; 35個(gè)循環(huán)(95 ℃,30 s; 57 ℃,45 s; 72 ℃,1 min,85 ℃,5 s); Melt curve 65.0 ℃ to 95.0℃,increment 0.5 ℃,0:05+ plate read。反應(yīng)體系為20 μl，包括1 μl DNA模板、10 μl SYBR Premix ExTaqTM Perfect Real Time，前、后引物各0.05 μl(20 (mol·L-1)和8.9 (l的滅菌雙蒸水。實(shí)驗(yàn)對照用滅菌雙蒸水代替DNA作為反應(yīng)模板。

1.3.2 氨氧化細(xì)菌amoA基因的PCR-DGGE分析 采用PCR-DGGE實(shí)驗(yàn)對氨氧化細(xì)菌的amoA基因進(jìn)行擴(kuò)增，以反映在不同利用年限水稻土中氨氧化細(xì)菌的多樣性。PCR擴(kuò)增引物分別采用amoA-1F-GC和amoA-2R。PCR擴(kuò)增過程在PCR熱循環(huán)儀(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)上進(jìn)行，PCR反應(yīng)體系為20 μl，包括1 μl DNA模板、10 μl premix綠酶，前、后引物各0.05 μl(20 μmol·L-1)和8.9 μl的滅菌雙蒸水。擴(kuò)增結(jié)束后，用1.2 %的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證細(xì)菌的amoA基因是否得到特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。氨氧化細(xì)菌對的DGGE分析采用8 %(質(zhì)量/體積)的聚丙烯酰胺凝膠，變性劑濃度梯度為45 %～65 %。土壤樣品每個(gè)重復(fù)取150～200 ng PCR產(chǎn)物加樣到按上述方法配制的聚丙烯酰胺凝膠中，在電泳槽中進(jìn)行電泳，采用0.5×Tris-acetate-EDTA緩沖液，溫度60 ℃，70 V電壓條件下電泳16 h。凝膠取出后用SYBR Green Ⅰ染料染色30 min，用分子成像器FX(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)掃描成像。DGGE圖像用Quantity One軟件進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

DGGE圖像處理采用Quantity One軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同利用年限水稻土氨氧化細(xì)菌數(shù)量變化

土壤中發(fā)生的硝化作用是典型的生物學(xué)過程，其發(fā)生與速率主要受氨氧化微生物的豐度和活性制約[15]。已有研究表明AOB可能在水稻土中氨氧化過程中起主導(dǎo)作用[4]。研究不同年限水稻土中氨氧化細(xì)菌有一定意義。從表1來看，對氨氧化細(xì)菌來說，0、100、300年水稻土中細(xì)菌數(shù)量呈現(xiàn)顯著增長趨勢，1000和2000年水稻土氨氧化細(xì)菌豐度與300年水稻土基本處于相同水平，而700年土壤氨氧化細(xì)菌含量顯著低于其他年限土壤(P<0.05)。

2.2 不同利用年限水稻土氨氧化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

利用氨氧化細(xì)菌的特異引物amoA-1F，amoA-2R對提取出來的土壤微生物總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增出來的PCR產(chǎn)物在變性梯度為45 %～65 %的凝膠中進(jìn)行電泳，得到不同利用年限水稻土氨氧化細(xì)菌群落組成的DGGE圖譜(圖1)。

利用Quantity One軟件(Bio-red)對DGGE圖譜條帶進(jìn)行數(shù)字化處理分析，結(jié)果顯示不同利用年限水稻土樣品可檢測到的DGGE條帶數(shù)量存在明顯差異，水稻土中氨氧化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)隨利用年限發(fā)生顯著變化。利用年限為300、700年的水稻土中可以檢測到的DGGE條帶數(shù)量都較高，在12條左右；而利用年限為0、100、1000和2000年的水稻土中可以檢測到的條帶數(shù)量低于9條。說明年限為300、700年的水稻土中氨氧化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)多樣性要比利用年限為0、100、1000和2000年的水稻土中氨氧化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)多樣性好，氨氧化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)多樣性隨著利用年限的增加呈現(xiàn)出先曾加后降低的趨勢。

表1 不同利用年限水稻土氨氧化細(xì)菌數(shù)量Table 1 The number of ammonia oxidizing bacteria with different utilization years in paddy soil

注：小寫字母為同行相比，字母不同表示差異達(dá)到P<0.05顯著水平。

圖1 不同利用年限水稻土氨氧化細(xì)菌的PCR-DGGE圖譜Fig.1 PCR-DGGE mapping of ammonia oxidizing bacteria with different utilization years in paddy soil

2.3 不同利用年限水稻土氨氧化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)聚類分析

對DGGE圖譜進(jìn)行聚類分析結(jié)果，如圖2所示。首先利用年限為0年的水稻土中氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成與100、300、700、1000、2000年的水稻土中氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成相似度約為26 %，明顯不同于其他利用年限水稻土中氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成，故單獨(dú)歸為一類，說明人工耕作明顯影響了氨氧化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)組成。氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成相似性最高的是100和700年的水稻土，相似度接近70 %；其次是1000和2000年的水稻土中氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成，相似度約為63 %。100和700年與1000和2000年這2組的相似度也達(dá)到50 %左右，故將這4個(gè)利用年限水稻土中氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成聚為一類。然后在與300年處理聚類相似度約為44 %。這也與DGGE圖譜可檢測條帶數(shù)量差異的結(jié)果一致。

相似性越大，表明氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成越接近，差異越小。各利用年限水稻土中氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的相似性不高，說明不同利用年限水稻土中氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成差異性較大。表明人工耕作會對氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成造成影響，但影響效果并不是隨著利用年限的增加而增大，而是呈現(xiàn)出不規(guī)則的變化。

3 結(jié) 論

通過對土壤樣品中氨氧化細(xì)菌DNA的提取以及PCR-DGGE分析的結(jié)果表明，不同利用年限對水稻土氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大的影響。

圖2 不同利用年限水稻土氨氧化細(xì)菌的PCR-DGGE圖譜的聚類分析Fig.2 Cluster analysis of PCR-DGGE spectra of ammonia oxidizing bacteria with different utilization years in paddy soils

(1)不同利用年限水稻土中氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性表現(xiàn)出隨著利用年限的增加先增加后降低的趨勢。

(2)不同利用年限水稻土中氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成相似性不高，差異性較大。

[1]曹志洪.中國史前灌溉稻田和古水稻土研究進(jìn)展[J].土壤學(xué)報(bào),2008，45(5):784-791.

[2]Roy R,Misra R.Economic and environmental impact of improved nitrogen management in Asian rice-farming systems[A].In: Proceedings of the 20th Session of the International Rice Commission; p.2003:23-26.

[3]Cai Z C,Xing G X,Yan X Yi,et al.Methane and nitrous oxide emissions from rice paddy fields as affected by nitrogen and water management[J].Plant Soil,1997,196:7-14.

[4]Li X,Xia L,Yan X.Application of membrane inlet mass spectrometry to directly quantify denitrification in flooded rice paddy soil[J].Biology and Fertility of Soils,2014,50:891-900.

[5]李慶逵.中國水稻土[M].北京: 科學(xué)出版社,1992:50-81.

[6]Huang C Y.Soil Science.Beijing[M].China Agriculture Press,2000.50-65.

[7]胡君利,林先貴,尹 睿，等.浙江慈溪不同利用年限水稻土微生物生物量與酶活性比較[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2008,28(4):1552-1557.

[8]胡君利,林先貴,尹 睿，等.浙江慈溪不同利用年限水稻土肥力特征的比較[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào),2008,14(4):673-377.

[9]Caldwell B A,Griffiths R P,Sollins P.Soil enzyme response to vegetation distance in two lowland Costa Rican[J].Soil Biol.Biochem.,1999,31: 1603-1608.

[10]Sparling G P.Soil microbial biomass,activity and Nutrient Cycling as indicators of soil health[J].Biological Indicators of Soil Health.Ocon: CABI Publishing,1997,12:97-120.

[11]Saggar S,Yeates G W,Shepherd T G.Cultivation effects on soil biological properties,microfauna and organic matter dynamics in Eutric Gleysol and Gleyic Luvisol soils in New Zealand[J].Soil Till.Res,2001,58(1-2): 55-68.

[12]胡君利,林先貴,尹 睿，等.浙江慈溪旱作農(nóng)田土壤微生物生物學(xué)性狀的時(shí)空演變特征[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2008,19(9):1977-1982.

[13]胡君利,林先貴,尹 睿，等.浙江慈溪不同利用年限水稻土主要微生物過程強(qiáng)度的比較[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2008,28(1):174-179.

[14]He J Z,Shen J P,Zhang L M,et al.Quantitative analyses of the abundance and composition of ammonia-oxidizing bacteria and ammonia-oxidizing archaea of a Chinese upland red soil under long-term fertilization practices[J].Environmental Microbiology,2007,9:2364-2374.

[15]Hyman M R,Arp D.14C2H2- and 14CO2-labeling studies of the de novo synthesis of polypeptides by Nitrosomonas europaea during recovery from acetylene and light inactivation of ammonia monooxygenase[J].Journal of Biological Chemistry,1992,267: 1534-1545.

ComparisonofAmmoniaOxidationBacteriaCommunityStructureinPaddySoilwithDifferentUtilizedYears

ZHAO Wei-ye1,LIU Wei1,LIU Qin2,JIANG Xian-jun1*

(1.School of Resources and Environment,Southwest University,Chongqing 400716,China;2.Institute of Soil Science,Chinese Academy of Sciences,Jiangsu Nanjing 210008,China)

【Objective】In the present paper,paddy soil and tideland soil of Hangzhou Bay were taken as target soil to gain a understand of how the utilized years affected the ammonia oxidation bacteria community structure,in which the former has been used to plant rice for about 100,300,700,1000,2000 years and the latter has never been used to plant crops (0 year).【Method】PCR-DGGE technology was adopted to analyze the ammonia oxidation bacteria community structure of 6 soil samples with different utilized years.【Result】The AOB and DGGE strips showed a significant different pattern in electrophoretic images attained from PCR-DGGE analyzing.【Conclusion】Differences in utilized years can greatly affect the ammonia oxidation bacteria community structure in paddy soil.

Utilized years; Paddy soil; Ammonia oxidation bacteria; Community structure

1001-4829(2017)4-0784-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.4.013

2016-04-08

水體污染控制與治理科技重大專項(xiàng)(2012ZX07104-003)

趙偉燁(1991-)，男，山東濱州人，碩士研究生，主要從事土壤肥力與生態(tài)研究，E-mail:zhaowy666@163.com，Tel：15736032323，*為通訊作者，E-mail: jiangxj@swu.edu.cn。

S154.37

A

(責(zé)任編輯 李 潔)