董 青,史靜柯,王?；?皇甫和平,郭宏偉,孫彥婷,王宏魁,王武卿,高文文

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州 450046)

鄭州地區(qū)7株鴨源雞桿菌的MALDI-TOFMS鑒定及其生物學(xué)特性分析

董 青,史靜柯,王?；?皇甫和平*,郭宏偉,孫彥婷,王宏魁,王武卿,高文文

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州 450046)

為了解鄭州地區(qū)鴨源雞桿菌的生物學(xué)特性和耐藥情況，利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)，從鄭州地區(qū)某雞場(chǎng)分離的細(xì)菌中鑒定出7株鴨源雞桿菌。對(duì)分離菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示，分離菌株在血平板上長(zhǎng)成光滑、圓潤(rùn)、灰白色、半透明、邊緣整齊且呈β-溶血的小菌落；L-阿拉伯醇、D-山梨醇、麥芽糖、海藻糖試驗(yàn)的鑒定結(jié)果表明，7株鴨源雞桿菌可能屬于不同的生物分型；整體上，分離菌株對(duì)頭孢噻肟、頭孢曲松、阿米卡星、慶大霉素等敏感,對(duì)氨芐西林、環(huán)丙沙星、妥布霉素、左氧氟沙星和氧氟沙星具有較強(qiáng)的耐藥性，對(duì)克林霉素、四環(huán)素、氯霉素、復(fù)方新諾明具有嚴(yán)重的耐藥性。

鴨源雞桿菌； MALDI-TOF MS鑒定； 藥敏試驗(yàn)； 生物學(xué)特性； 鄭州地區(qū)

Christensen等[1]將鴨巴氏桿菌(Pasteurellaanatis)、輸卵管炎放線桿菌(Actinobacillussalpingitidis)和溶血性巴氏桿菌(Pasteurellahaemolytica)歸于巴氏桿菌科中一個(gè)新的細(xì)菌屬——雞桿菌屬。Bisgaard等[2]通過(guò)對(duì)雞桿菌屬各株細(xì)菌的特異性序列進(jìn)行分析比較，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，將雞桿菌屬細(xì)化為7個(gè)種，鴨源雞桿菌是其中1個(gè)代表種。王川慶等[3]通過(guò)對(duì)我國(guó)的12個(gè)雞場(chǎng)進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查，首次報(bào)道了我國(guó)雞場(chǎng)中鴨源雞桿菌的感染情況，隨后我國(guó)一些學(xué)者開(kāi)始對(duì)雞桿菌進(jìn)行更深入的研究。鴨源雞桿菌的感染宿主很廣泛，目前研究多集中在雞群中鴨源雞桿菌感染方面。鴨源雞桿菌常引起雞輸卵管炎、雞輸卵管囊腫，從而導(dǎo)致產(chǎn)蛋量驟減，蛋品質(zhì)下降,給蛋雞養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的損失[4-6]。Bojesen等[7]對(duì)來(lái)自不同雞群的臨床健康雞的泄殖腔和上顎裂棉拭子進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，鴨源雞桿菌是一種條件性致病菌，對(duì)健康雞群也存在潛在的威脅。

目前,國(guó)內(nèi)對(duì)鴨源雞桿菌耐藥狀況的報(bào)道較少，臨床用藥缺乏可靠的理論依據(jù)和參考標(biāo)準(zhǔn)。鑒于此，從鄭州地區(qū)某雞場(chǎng)雞的上顎裂棉拭子和泄殖腔棉拭子分離細(xì)菌，進(jìn)行生化鑒定及藥敏試驗(yàn)，了解鄭州地區(qū)鴨源雞桿菌生物學(xué)特性和耐藥情況，以期為鴨源雞桿菌的鑒定及防治提供參考。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1 主要試劑 綿羊血瓊脂平板購(gòu)自鄭州人福博賽生物技術(shù)有限公司；超級(jí)胎牛血清由BBI Life Sciences公司生產(chǎn)；VITEK 2革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定卡購(gòu)自法國(guó)生物-梅里埃公司；藥敏紙片包括頭孢曲松(CRO)、頭孢噻肟(CTX)、氨芐西林(AMP)、環(huán)丙沙星(CIP)、克林霉素(DA)、慶大霉素(CN)、妥布霉素(TOB)、氯霉素(C)、四環(huán)素(TE)、左氧氟沙星(LEV)、氧氟沙星(OFX)、阿米卡星(AK)、復(fù)方新諾明(SXT)，由英國(guó)Oxoid Limited公司生產(chǎn)；Taq酶、DL2000 Marker，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.1.2 主要儀器 HR40-Ⅱ B2生物安全柜由青島海爾特種電器有限公司生產(chǎn)；3-30K高速冷凍離心機(jī)由德國(guó)SIGMA公司生產(chǎn)；900系列超低溫冰箱由美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司生產(chǎn)；Biotyper全自動(dòng)快速質(zhì)譜微生物鑒定系統(tǒng)由美國(guó)BD公司生產(chǎn)；VITEK 2 Compact 30全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)由法國(guó)生物梅里埃公司生產(chǎn)；ETC811 PCR儀，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。

1.1.3 PCR引物 參考Christensen等[8]的方法設(shè)計(jì)rpoB基因的PCR引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列如下：rpoB-F:5′-GCAGTGAAAGARTTCTTTGGTTC-3′，rpoB-R:5′-GTTGCATGTTIGIACCCAT-3′，目的片段長(zhǎng)560 bp。

1.1.4 供試樣品 上顎裂棉拭子和泄殖腔棉拭子采自鄭州地區(qū)某蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2方法

1.2.1 細(xì)菌分離 用上顎裂棉拭子和泄殖腔棉拭子劃線接種于綿羊血瓊脂平板上，置37 ℃溫箱中培養(yǎng)24～48 h，挑取典型菌落傳代接種于綿羊血瓊脂平板上純化，進(jìn)行細(xì)菌涂片，革蘭氏染色、鏡檢。

1.2.2 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)鑒定

1.2.2.1 基質(zhì)溶液HCCA的配制 首先配制標(biāo)準(zhǔn)品和基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶劑50.0%乙腈+47.5%水+2.5%三氟乙酸；在裝有HCCA(α-氰基-4-羥基肉桂酸)的旋蓋存液管中添加250 μL標(biāo)準(zhǔn)溶劑(終質(zhì)量濃度10 mg/mL)；振蕩混勻，直到形成澄清溶液。

1.2.2.2 檢測(cè)樣品的制備 向EP管內(nèi)加300 μL滅菌水；用接種環(huán)挑取已經(jīng)純化過(guò)的菌落在滅菌水中稀釋，并用接種環(huán)混勻；向EP管中再加入900 μL乙醇，混勻；13 000 r/min離心2 min，棄上層液體；再次13 000 r/min離心2 min,棄上層液體,保證EP管中無(wú)乙醇；向其中加入30 μL 70%甲酸溶液，混勻；再向其中加入30 μL乙腈溶液，同上離心，將上清液移入新的EP管，備用。

1.2.2.3 點(diǎn)樣 吸取1 μL上清，滴加到MALDI-TOF MS儀器靶板上，并在室溫下晾干；1 h內(nèi)，用1 μL HCCA基質(zhì)溶液覆蓋上述樣品點(diǎn)，并在室溫下晾干；每個(gè)樣品重復(fù)3個(gè)孔。

1.2.2.4 質(zhì)譜分析 樣本干燥后將靶板放入 MALDI-TOF MS系統(tǒng)檢測(cè),參數(shù)設(shè)置為正線性操作模式，MALDI-TOF MS收集的質(zhì)量范圍為(2～20)×103u,加速電壓為20 kV,提取電壓為18.6 kV，聚焦電壓為6.5 kV，提取延遲時(shí)間為150 ns。每次試驗(yàn)前都要在采集數(shù)據(jù)的質(zhì)量范圍內(nèi)(2～20)×103u用校準(zhǔn)肽蛋白進(jìn)行質(zhì)量校正，校正完畢后方可進(jìn)行質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)的采集，圖譜采集使用Flex Control 3.0軟件,圖譜數(shù)據(jù)使用 BrukerBiotyper 3.0軟件與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，應(yīng)用分值量化判定結(jié)果：評(píng)分>2.3，可100%鑒定到種的水平；1.7<評(píng)分<2.3,可100%鑒定到屬的水平,80%鑒定到種的水平；評(píng)分<1.7，無(wú)法準(zhǔn)確判定。

1.2.3 分離菌株的rpoB基因PCR擴(kuò)增及序列比對(duì)

1.2.3.1 細(xì)菌DNA制備 將純化后的菌株接種于含10%小牛血清的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)18 h，移取1 mL培養(yǎng)好的菌液，10 000 r/min離心5 min，棄上清，加TE緩沖液600 μL振蕩混勻，沸水浴10 min，然后立即冰浴2 min，再12 000 r/min離心10 min，取上清-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2rpoB基因的PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液(含Mg2+)2.5 μL，dNTPs 0.5 μL，上下游引物(25 pmol/μL)各0.5 μL，Taq酶1.25 U，細(xì)菌DNA 1 μL，最后加滅菌超純水至25 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.3.3rpoB基因的測(cè)序及比對(duì) PCR產(chǎn)物利用DNA凝膠回收試劑盒純化，并提交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。測(cè)序后的序列利用NCBI在線比對(duì)軟件BLAST進(jìn)行比對(duì)。

1.2.4 生化試驗(yàn) 用VITEK 2 Compact 30全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生理生化特性的鑒定。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 選取13種廣譜或革蘭氏陰性菌敏感的抗生素藥敏片，按照常規(guī)紙片法在綿羊血平板上進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)，根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)抗菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(M100-S23)，判斷藥物的敏感及耐藥情況。

2 結(jié)果與分析

2.1分離細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果

細(xì)菌在綿羊血瓊脂平板上生長(zhǎng)良好，經(jīng)18～24 h培養(yǎng)后，形成光滑、圓潤(rùn)、灰白色、半透明、邊緣整齊、呈β溶血的均一小菌落,直徑1～2 mm。細(xì)菌涂片革蘭氏染色鏡檢結(jié)果顯示，菌體呈革蘭氏陰性、兩端鈍圓、單個(gè)散在或成對(duì)分布的小球桿菌(圖1)。

圖1 鴨源雞桿菌的鏡檢觀察結(jié)果(100×)

2.2分離細(xì)菌MALDI-TOFMS鑒定結(jié)果

分離菌株的質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)經(jīng)BrukerBiotyper 3.0軟件與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，有4株細(xì)菌的計(jì)分價(jià)值>2.3，鑒定為鴨源雞桿菌的概率為100%;3株細(xì)菌的計(jì)分價(jià)值介于1.7～2.3，鑒定為鴨源雞桿菌種的概率為80%。

表1 分離細(xì)菌MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果

注：菌株名稱命名方式為鴨源雞桿菌(Gallibacteriumanatis)英文名稱首字母大寫(xiě)+分離國(guó)家名稱的英文首字母大寫(xiě)+菌株分離編號(hào)。

2.3分離細(xì)菌的rpoB基因PCR擴(kuò)增及序列比對(duì)結(jié)果

rpoB基因PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)得到1條大小為560 bp的目的條帶(圖2)。將獲得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道的鴨源雞桿菌序列進(jìn)行BLAST分析，7個(gè)菌株與已知鴨源雞桿菌rpoB基因的同源性達(dá)到99%～100%。

M：DL2000 Marker；N：陰性對(duì)照；P：陽(yáng)性對(duì)照；1—7：分離細(xì)菌圖2 分離細(xì)菌rpoB基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.4分離細(xì)菌生化試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，7株鴨源雞桿菌的D-葡萄糖、D-甘露醇、D-甘露糖、蔗糖、磷酸酶、聚乙烯葡萄糖硒酸酶、埃爾曼試劑法反應(yīng)均為陽(yáng)性；β-半乳糖苷酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、酪氨酸芳胺酶、D-山梨醇、D-海藻糖、琥珀酸鹽產(chǎn)堿、2，4-二氨基-6，7-二異丙基蝶啶耐受反應(yīng)陽(yáng)性率在57.1%～85.7%；側(cè)金盞花醇、吡咯烷基芳胺酶、L-阿拉伯醇反應(yīng)陽(yáng)性率在14.3%～42.9%；丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶、D-纖維二糖、β-N-乙酰葡萄糖苷酶、谷氨酰芳胺酶等項(xiàng)目生化反應(yīng)均為陰性。

2.5分離細(xì)菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，整體上，分離菌株對(duì)頭孢噻肟、頭孢曲松、阿米卡星、慶大霉素敏感，對(duì)氨芐西林、環(huán)丙沙星、妥布霉素、左氧氟沙星和氧氟沙星具有較強(qiáng)耐藥性，對(duì)克林霉素、四環(huán)素、氯霉素、復(fù)方新諾明存在嚴(yán)重的耐藥性。

表2 分離細(xì)菌生化試驗(yàn)結(jié)果

注：+表示結(jié)果為陽(yáng)性；-為陰性；(-)為疑似陰性。

表3 分離細(xì)菌對(duì)13種抗生素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

注：S為高度敏感，I為中度敏感，R為耐藥；括號(hào)內(nèi)數(shù)字為抑菌圈直徑(mm)。

3 結(jié)論與討論

根據(jù)分離菌株血平板上的菌落形態(tài)、顯微鏡檢結(jié)果、MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果、rpoB基因序列比對(duì)結(jié)果，以及VITEK 2 Compact 30全自動(dòng)生化檢測(cè)結(jié)果，證實(shí)分離的7株細(xì)菌為鴨源雞桿菌。

MALDI-TOF MS系統(tǒng)是近幾年新興起的應(yīng)用于病原微生物快速檢測(cè)的一項(xiàng)技術(shù)，同其他鑒定方法相比，該方法具有快速、穩(wěn)定、準(zhǔn)確、靈敏和分辨率高的優(yōu)點(diǎn)。MALDI-TOF MS系統(tǒng)鑒定結(jié)果表明，7株細(xì)菌中有4株的計(jì)分價(jià)值>2.3，鑒定為鴨源雞桿菌的概率為100%，有3株細(xì)菌的計(jì)分價(jià)值介于1.7～2.3，鑒定為鴨源雞桿菌種的概率為80%。本試驗(yàn)是國(guó)內(nèi)首次采用MALDI-TOFMS系統(tǒng)鑒定鴨源雞桿菌，這將為我國(guó)鴨源雞桿菌病的研究提供新的鑒定方法。

VITEK 2 Compact 30全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)并未包含雞桿菌的參考標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)法直接鑒定出確切的歸屬，但其結(jié)果可用于分離細(xì)菌的生化分析。根據(jù)以往對(duì)雞桿菌生理生化特性的研究[1-2]，木糖、阿拉伯糖、肌醇、山梨醇、麥芽糖、海藻糖等的反應(yīng)差異是雞桿菌的生物型分型依據(jù)，本研究中D-山梨醇、D-麥芽糖、D-海藻糖反應(yīng)的陽(yáng)性率分別為85.7%、0.0%、85.7%，表明7株鴨源雞桿菌可能屬于不同的生物型分型。另外，本試驗(yàn)中7株雞桿菌β-半乳糖苷酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、酪氨酸芳胺酶、琥珀酸鹽產(chǎn)堿、2，4-二氨基-6，7-二異丙基蝶啶耐受反應(yīng)、側(cè)金盞花醇、吡咯烷基芳胺酶的試驗(yàn)陽(yáng)性率分別為85.7%、57.1%、85.7%、85.7%、71.4%、28.6%、14.3%，進(jìn)一步表明雞桿菌生化反應(yīng)的多樣性，也為鴨源雞桿菌的分型鑒定提供了一定的參考。

本研究中，7株鴨源雞桿菌耐藥性最強(qiáng)的菌株對(duì)10種藥物產(chǎn)生了耐藥性。郭倫濤[9]從河南、安徽、山西和山東等地區(qū)分離的75株雞桿菌對(duì)磺胺甲惡唑、鏈霉素、克林霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星嚴(yán)重耐藥。高冬生[10]從河南分離的61株鴨源雞桿菌對(duì)環(huán)丙沙星、克林霉素、青霉素、諾氟沙星、卡那霉素、鏈霉素嚴(yán)重耐藥?？梢?jiàn)，我國(guó)的鴨源雞桿菌對(duì)多種抗生素已經(jīng)產(chǎn)生了廣泛的耐藥性。

本研究首次利用MALDI-TOF MS 技術(shù)對(duì)鴨源雞桿菌進(jìn)行了鑒定，并對(duì)分離菌株的生化特性和藥物敏感性進(jìn)行了研究，為臨床鴨源雞桿菌感染的快速診斷和藥物防制提供了重要參考。

[1] Christensen H,Bisgaard M,Bojesen A M,etal.Genetic relationships among avian isolates classified asPasteurellahaemolytica,‘Actinobacillussalpingitidis’orPasteurellaanatiswith proposal ofGallibacteriumanatisgen.nov.,comb.nov.,and description of additional genomospecies withinGallibacteriumgen.nov[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2003,53:275-287.

[2] Bisgaard M,Korczak B M,Busse H J,etal.Classification of the taxon 2 and taxon 3 complex of Bisgaard withinGallibacteriumand description ofGallibacteriummelopsittacisp.nov.,Gallibacteriumtrehalosifermentanssp.nov.andGallibacteriumsalpingitidissp.nov[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2009,59:735-744.

[3] 王川慶,陳陸,楊霞,等.蛋雞群卡氏桿菌感染情況的初步研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2008(3):97-100,103.

[4] 鄭鹿平,楊霞,陳陸,等.45株雞卡氏桿菌的分離鑒定[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2010,30(3):347-351.

[5] Jordan F T,Williams N J,Wattret A,etal.Observations on salpingitis,peritonitis and salpingoperitonitis in a layer breeder flock[J].The Veterinary Record,2005,157(19):573-577.

[6] 劉慧敏,陳陸,楊霞,等.SPF蛋雞人工感染雞桿菌的病理形態(tài)學(xué)觀察[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2010,30(7):969-973.

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[8] Christensen H,Kuhnert P,Olsen J E,etal.Comparative phylogenies of the housekeeping genesatpD,infBandrpoBand the 16S rRNA gene within thePasteurellaceae[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2004,54(5):1601-1609.

[9] 郭倫濤.雞桿菌地方分離株耐藥性及耐藥基因的研究[D].鄭州:河南農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

[10] 高冬生.61株鴨源雞桿菌部分耐藥基因及其與耐藥性關(guān)系的研究[D].鄭州:河南農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

Identification of 7GallibacteriumanatisStrains by MALDI-TOF MS in Zhengzhou Area and Research on Partial Biological Characteristics

DONG Qing,SHI Jingke,WANG Haihua,HUANGFU Heping*，GUO Hongwei,SUN Yanting, WANG Hongkui,WANG Wuqing,GAO Wenwen

(College of Veterinary Medicine,Henan University of Animal Husbandry and Economy,Zhengzhou 450046,China)

In order to investigate the biological characteristics and drug resistance ofGallibacteriumanatisstrains in Zhengzhou area,matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) was used to identified 7 strains ofGallibacteriumanatiswhich were isolated from a poultry farm in Zhengzhou area.The colony morphology observation biochemical test and antimicrobial susceptibility test were carried out.The results showed that the isolates formed smooth,rounded,grayish,translucent,neat and β-hemolytic small colonies on blood agar plate.The results of L-arabicol,D-sorbitol,maltose and trehalose test indicated that the isolated strains ofGallibacteriumanatismay belong to different taxonomy.The isolated strains ofGallibacteriumanatiswere susceptible to cefotaxime sodium,ceftriaxone,amikacin and gentamicin,and had resistance to ampicillin,ciprofloxacin,tobramycin,levofloxacin,ofloxacin,and had severe resistance to clindamycin,tetracycline,chloramphenicol,cotrimoxazole.

Gallibacteriumanatis； identification by MALDI-TOF MS； antimicrobial susceptibility test； biological characteristics； Zhengzhou area

S855.1

A

1004-3268(2017)10-0143-05

2017-04-13

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(U1404328)；河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(HUAHE2015014)；河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(MXK2016102)

董 青(1981-)，女，河南沈丘人，講師，碩士，主要從事動(dòng)物疾病發(fā)病機(jī)制研究。E-mail：dongqingcoco@163.com

*通訊作者：皇甫和平(1977-)，男，河南焦作人，副教授，博士，主要從事動(dòng)物疾病發(fā)病機(jī)制研究。E-mail：hepinghf@163.com