高海峰,白微微,劉恩良,趙海燕,李廣闊*,張 航,曾潮武

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學院 植物保護研究所/農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室/農(nóng)業(yè)部庫爾勒作物有害生物科學觀測實驗站,新疆 烏魯木齊 830091； 2.新疆農(nóng)業(yè)科學院 糧食作物研究所,新疆 烏魯木齊 830091)

新疆春小麥品種(系)抗白粉病基因的分子檢測

高海峰1,白微微1,劉恩良2*,趙海燕1,李廣闊1*,張 航1,曾潮武2

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學院 植物保護研究所/農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室/農(nóng)業(yè)部庫爾勒作物有害生物科學觀測實驗站,新疆 烏魯木齊 830091； 2.新疆農(nóng)業(yè)科學院 糧食作物研究所,新疆 烏魯木齊 830091)

通過苗期抗性鑒定和抗病基因的分子標記檢測，篩選對小麥白粉病具有抗性的春小麥品種(系)，明確Pm4、Pm8和Pm21在新疆春小麥品種(系)中的分布現(xiàn)狀，為新疆春小麥品種的合理布局及抗白粉病品種的選育提供依據(jù)。苗期抗性鑒定結(jié)果表明，新春38號和366S表現(xiàn)出抗性，高抗植株與中感植株的比率為2∶1，新春12號、新春15號、新春18號等29個小麥品種(系)對小麥白粉病均表現(xiàn)為高感。分子標記檢測結(jié)果表明，新春27號、1354和1360含有Pm4基因；983-S、MJ307、HMJ555和1112含有Pm8基因；366S含有Pm21基因。采用苗期抗性鑒定和分子標記檢測相結(jié)合的方法，可大大提高抗白粉病品種鑒定的準確性。

春小麥； 新疆； 小麥白粉病； 抗病基因； 分子標記

由專性寄生菌Blumeriagraminisf.sp.tritici引起的小麥白粉病是一種典型的氣傳病害，也是我國小麥主產(chǎn)區(qū)發(fā)生范圍和危害程度最大的小麥病害之一，在新疆各地均有發(fā)生，近年來，受菌源變異、氣候、栽培條件等因素影響，其危害愈發(fā)嚴重，發(fā)病時產(chǎn)量損失達5%～34%[1-4]。種植抗病品種是防治小麥白粉病最經(jīng)濟、有效的措施，但品種的單一性種植會對白粉菌群體產(chǎn)生定向化選擇，往往導(dǎo)致品種抗性的喪失[5-7]。明確新疆春小麥品種(系)中抗白粉病基因，對抗病育種、品種的合理利用和布局及小麥白粉病的防治具有重要的意義。近年來，由于分子標記技術(shù)具有快速、準確和不受環(huán)境條件限制等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于抗病基因的鑒定工作中[8]，迄今為止，已有70多個小麥主效抗白粉病基因被正式定名[9]。很多學者利用特異性引物對全國各地的小麥種質(zhì)資源進行了抗白粉病基因Pm4、Pm8和Pm21的分子檢測[8,10-18]。本研究擬利用小麥抗病基因Pm4(STS標記)、Pm8(STS標記)和Pm21(SSR標記)的分子標記，對新疆春小麥生產(chǎn)品種、區(qū)試品系及高代品系進行檢測，旨在明確新疆春小麥品種(系)中抗白粉病基因的分布現(xiàn)狀，為指導(dǎo)抗病育種、品種的合理利用和布局及小麥白粉病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1試驗材料

供試小麥生產(chǎn)品種、區(qū)試品系及高代品系共31份，其中新春12號、新春15號、新春18號、新春27號、新春29號、新春31號、新春33號、新春37號、新春38號、新春43號為育成品種；0721-1、983-S、1142、1201、1242為新疆區(qū)試品系；1112、1229、1245、1309、1330、1346、1352、1354、1357、1360為自育高代品系；HMJ555、MJ307、10H4670、HJ29為寧夏引進品系；Y-20為加拿大引進品系；366S為河南引進雜交品系。以上品種(系)由新疆農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所和核技術(shù)生物技術(shù)研究所提供。陽性對照Kavkaz(Pm8)、Armada(Pm4)、Khapli/8cc(Pm4)、南農(nóng)9918(Pm21)及陰性對照Chancellor由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所麥類真菌病害課題組提供。

1.2供試菌株

小麥白粉病菌(Blumeriagraminisf.sp.tritici)采自新疆昌吉州軍戶農(nóng)場試驗站試驗田，在新春6號上繁殖保存。

1.3苗期接菌及抗性鑒定

將小麥品種(系)播種于56 cm×32 cm×18 cm的塑料方盒內(nèi)，以感病品種新春6號為對照，放在20 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待第1片葉完全展開后，用抖接法充分接種小麥白粉病菌分生孢子，待感病品種充分發(fā)病后(接種后8～10 d)，按司權(quán)民等[19]的方法，調(diào)查記載病情(表1)。

表1 苗期抗性反應(yīng)型分級標準

1.4抗病基因的分子檢測

小麥種子在室溫下發(fā)芽，兩葉一心期，剪取葉片按CTAB法[20]提取基因組DNA。用于檢測Pm4、Pm8和Pm21基因的分子標記信息見表2，所用引物序列均由上海生工生物工程有限公司合成。反應(yīng)體系為20.0 μL，含有2×TaqPCR Master Mix 10.0 μL，正向引物、反向引物、DNA模板各1.0 μL，ddH2O 7.0 μL。擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，退火溫度(視不同引物而定)45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物用1.0%或2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表2 用于檢測小麥抗白粉病基因的分子標記及其引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1供試春小麥品種(系)苗期抗性鑒定

苗期接菌法抗性鑒定結(jié)果(表3)表明，新春38號和366S對小麥白粉病表現(xiàn)出抗性，HR∶MS=2∶1，推測其含有抗病基因；新春2號、新春6號和新春10號等29個品種(系)對小麥白粉病表現(xiàn)為高感。

表3 春小麥品種(系)苗期抗性鑒定結(jié)果

2.2供試春小麥品種(系)抗白粉病基因的分子檢測

2.2.1Pm4基因的分子標記檢測 利用與Pm4緊密連鎖的分子標記R1/C1對31份春小麥品種(系)進行了檢測，以Armada(Pm4)和Khapli/8cc(Pm4)為陽性對照，以Chancellor為陰性對照。結(jié)果表明，新春27號、1354和1360 能擴增出470 bp的特異條帶，與Armada(Pm4)和Khapli/8cc(Pm4)的特征帶相同，表明這些品系可能含有Pm4，占供試品系的9.68%；新春12號、新春15號、新春18號等28個小麥品種(系)不能擴增出與Armada(Pm4)和Khapli/8cc(Pm4)相同的特征帶，表明這些品種(系)不含Pm4(圖1，表4)。

M:D2000;1:Chancellor;2:Armada; 3:Khapli/8cc;4:新春12號;5:新春15號;6:新春18號;7:新春29號;8:新春31號; 9:新春33號;10:新春37號;11:新春38號;12:1309;13:983-S;14:MJ307;15:1360;16:新春43號; 17:HMJ555;18:366S;19:HJ29;20:新春27號;21:1346;22:1112

表4 春小麥品種(系)抗白粉病基因Pm4、Pm8和Pm21的分子標記檢測結(jié)果

注：分子檢測具有和不具有被測基因分別用“+”和“—”表示。

2.2.2Pm8基因的分子標記檢測 利用黑麥染色質(zhì)特異性引物AF1/AF4，以Kavkaz(Pm8)為陽性對照，以Chancellor為陰性對照，對31份春小麥品種(系)進行了檢測。結(jié)果表明，983-S、MJ307、HMJ555和1112能擴增出1.5 kb的特異DNA片段(圖2)，與Kavkaz(Pm8)的特征帶相同，表明這些品系可能含有Pm8，占供試品種(系)的12.90%；新春12號、新春15號、新春18號等27個小麥品種(系)不能擴增出與Kavkaz(Pm8)相同的特征帶，表明這些品種(系)不含Pm8(表4)。

2.2.3Pm21基因的分子標記檢測 利用與Pm21緊密連鎖的分子標記WS-1 F/R對31份春小麥品種(系)進行了檢測，以南農(nóng)9918(Pm21)為陽性對照，以Chancellor為陰性對照。結(jié)果表明，366S能擴增出949 bp的特異條帶(圖3)，與南農(nóng)9918(Pm21)的特征帶相同，表明該品系可能含有Pm21，占供試品種(系)的3.23%；新春12號、新春15號、新春18號等30個小麥品種(系)不能擴增出與南農(nóng)9918(Pm21)相同的特征帶，表明這些品種(系)不含Pm21(表4)。

M:D2000;1:Chancellor;2:Kavkaz;3:新春12號;4:新春15號;5:新春18號;6:新春29號;7:新春31號;8:新春33號; 9:新春37號;10:新春38號;11:1309;12:983-S;13:MJ307;14:1360;15:新春43號;16:HMJ555; 17:366S;18:HJ29;19:新春27號;20:1346;21:1112;22:1201

M:D2000;1:Chancellor;2:南農(nóng)9918;3:新春12號;4:新春15號;5:新春18號;6:新春29號;7:新春31號;8:新春33號; 9:新春37號;10:新春38號;11:1309;12:983-S;13:MJ307;14:1360;15:新春43號;16:HMJ555; 17:366S;18:HJ29;19:新春27號;20:1346;21:1112;22:1201

3 結(jié)論與討論

近年來，新疆小麥白粉病的發(fā)生呈加重趨勢。研究表明，2012年核桃小麥間作和紅棗小麥間作小麥白粉病病情指數(shù)最高時分別達到46.67和40.00，2013年病情指數(shù)最高時分別為39.22和36.67[21]。新疆小麥品種(系)抗白粉病鑒定結(jié)果表明，在68份供試品種(系)中，新疆冬小麥生產(chǎn)品種對小麥白粉病全部表現(xiàn)為高感[22]，這嚴重威脅著新疆小麥安全生產(chǎn)。因此，本研究又對31份春小麥生產(chǎn)品種、區(qū)試品系、高代品系進行了抗白粉病研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在10份春小麥品種中，只有新春38號表現(xiàn)出抗性，且抗病植株與感病植株的比率為2∶1，其余9個品種均表現(xiàn)為高感；5個參加區(qū)試的品系和10個自育高代品系在苗期對小麥白粉病均表現(xiàn)為高感；只有引進的雜交品系366S表現(xiàn)出抗性，且抗病植株與感病植株的比率為2∶1。

據(jù)報道，新疆小麥品系新紫1號和14/8329對小麥白粉病表現(xiàn)為抗病[22]，對其抗病基因進行分子鑒定發(fā)現(xiàn)，新紫1號和14/8329均含有Pm4[8]。Pm4在20世紀90年代開始被應(yīng)用于抗病育種中，至今仍在使用。Pm8抗病基因曾被廣泛應(yīng)用于抗病育種中，但由于大面積單一種植含Pm8基因的小麥品種，會對小麥白粉菌群體產(chǎn)生定向化選擇，導(dǎo)致品種抗性的喪失，1990—1991年我國小麥白粉病大流行的一個原因就是Pm8基因抗病性的喪失[23]?？共』騊m21對小麥白粉病具有持久和廣譜抗性，20世紀80年代選育出的貴農(nóng)21、貴農(nóng)22等一系列材料對小麥白粉病具有較好的抗性，經(jīng)分子標記檢測證實，貴農(nóng)21、貴農(nóng)22含有的抗病基因為Pm21，被廣泛應(yīng)用于貴州、四川盆地和隴南等地小麥育種中[17]。本研究對31個春小麥品種(系)進行了抗病基因分子檢測，發(fā)現(xiàn)新春27號、1354和1360含有抗病基因Pm4，占供試品種(系)的9.68%；983-S、MJ307、HMJ555和1112含有抗病基因Pm8，占供試品種(系)的12.90%；366S含有抗病基因Pm21，占供試品種(系)的3.23%。

本研究中，新春27號、1354和1360雖含有抗病基因Pm4，但在苗期抗病性鑒定中發(fā)現(xiàn)這3個品種(系)對小麥白粉病均表現(xiàn)為感病，這可能是由于Pm4抗性基因的長期使用，導(dǎo)致小麥白粉病菌對Pm4毒性頻率上升，據(jù)報道，2005、2006、2007、2008年度其毒性頻率分別為8.37%、29.01%、20.68%和25.10%[24]，因此在生產(chǎn)上注意慎用。983-S、MJ307、HMJ555和1112含有抗病基因Pm8，但在苗期抗病性鑒定中發(fā)現(xiàn)這4個品系對小麥白粉病均表現(xiàn)為感病，表明Pm8在新疆小麥生產(chǎn)上已喪失抗病性。當前對小麥白粉病仍具較好抗性的Pm21基因在新疆春小麥主栽品種中分布較少，因此在今后育種中應(yīng)加強Pm21的利用。新春38號對小麥白粉病表現(xiàn)出抗性，高抗植株與中感植株的比率為2∶1，但其不含抗性基因Pm4、Pm8和Pm21，因此，在以后的工作中應(yīng)進一步明確新春38號含有的抗性基因。

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Molecular Detection of Powdery Mildew Resistant Genes of Spring Wheat Varieties(Lines) in Xinjiang

GAO Haifeng1,BAI Weiwei1,LIU Enliang2*,ZHAO Haiyan1,LI Guangkuo1*,ZHANG Hang1,ZENG Chaowu2

(1.Institute of Plant Protection,Xinjiang Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crop in Northwestern Oasis,Ministry of Agriculture/Scientific Observing and Experimental Station of Korla,Ministry of Agriculture,Urumqi 830091,China; 2.Institute of Grain Crop,Xinjiang Academy of Agricultural Sciences,Urumqi 830091,China)

The present study was conducted to screen spring wheat cultivars(lines) which had resistance to wheat powdery mildew,and to define the distribution ofPm4,Pm8 andPm21 in the spring wheat varieties(lines) in Xinjiang by seedling resistance identification and molecular markers detection of wheat resistance genes,so as to provide the basis for cultivar deployment and disease resistance breeding.The results showed that Xinchun No.38 and 366S showed resistance to wheat powdery mildew by wheat seedling resistance identification,and the ratio of high resistant plants to middle sensitive plants was 2∶1.Twenty nine wheat cultivars(lines) such as Xinchun No.12,Xinchun No.15,and Xinchun No.18 showed high sensitivity to wheat powdery mildew.Pm4 was detected in Xinchun No.27,1354 and 1360.Pm8 was detected in 983-S,MJ307,HMJ555 and 1112.Pm21 was detected in 366S.The combination of seedling resistance identification and molecular markers detection of wheat resistance genes can greatly improve the identification accuracy of wheat cultivars(lines) resistant to powdery mildew.

spring wheat; Xinjiang; wheat powdery mildew; resistant gene; molecular marker

S435.121

A

1004-3268(2017)10-0076-05

2017-04-18

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學基金(2016D01B045)

高海峰(1983-)，男，河南商水人，助理研究員，碩士，主要從事糧食作物病害研究。E-mail:ghf20044666@163.com

*通訊作者：李廣闊(1973-)，男，河南夏邑人，副研究員，碩士，主要從事農(nóng)作物病蟲草害防治研究。E-mail:1448832764@qq.com 劉恩良(1984-)，男，甘肅天水人，助理研究員，主要從事小麥及甘薯栽培育種研究。E-mail:liuenliang_513@163.com