葛紅蓮，郭 寧

(周口師范學(xué)院 生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南 周口 466001)

復(fù)合光合菌劑PS21對(duì)四環(huán)素脅迫下黃瓜幼苗生長(zhǎng)及抗氧化酶活性的影響

葛紅蓮，郭 寧

(周口師范學(xué)院 生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南 周口 466001)

采用室內(nèi)模擬試驗(yàn)法研究復(fù)合光合菌劑PS21與不同劑量四環(huán)素(10、20、40、60、80、100 mg/kg)協(xié)同處理對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)及抗氧化酶活性的影響，初步探討復(fù)合光合菌劑PS21緩解四環(huán)素對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)和抗氧化酶活性的抑制效應(yīng)。結(jié)果表明，單獨(dú)四環(huán)素處理顯著降低黃瓜幼苗的株高、根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和葉綠素含量，同時(shí)顯著提高丙二醛(MDA) 的含量。低劑量四環(huán)素激活超氧化物歧化酶 (SOD)、過氧化氫酶 (CAT) 和過氧化物酶 (POD) 活性，高劑量四環(huán)素降低SOD、CAT 和POD活性。108cfu/mL的PS21能緩解不同劑量四環(huán)素對(duì)黃瓜幼苗的傷害，與四環(huán)素單獨(dú)處理相比，黃瓜株高、根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、葉綠素含量和抗氧化酶活性提高，MDA含量下降。因此，復(fù)合光合菌劑PS21對(duì)黃瓜的四環(huán)素毒害具有較強(qiáng)的緩解作用。

復(fù)合光合菌劑； 四環(huán)素； 黃瓜； 幼苗生長(zhǎng)； 葉綠素含量； 抗氧化酶系

四環(huán)素是人畜共用的廣譜性抗生素，目前已成為生產(chǎn)量和使用量較大的抗生素之一[1-2]。四環(huán)素進(jìn)入人及動(dòng)物體后，大部分以原藥或代謝產(chǎn)物的形式隨生理代謝活動(dòng)排出體外，造成水體和土壤的污染。目前，在土壤、水、動(dòng)植物體中都能檢測(cè)到四環(huán)素[2-5]。一些研究表明，四環(huán)素對(duì)植物表現(xiàn)出較高的毒性，對(duì)植物的光合作用、發(fā)芽率和根的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用[2-3,5-6]。因此，近年來四環(huán)素對(duì)環(huán)境及植物的影響引起了人們的關(guān)注。但是，關(guān)于緩解四環(huán)素對(duì)植物傷害的報(bào)道較少。

光合細(xì)菌是一類能進(jìn)行不產(chǎn)氧光合作用的原核微生物，由于它能降解有機(jī)物并產(chǎn)生抗病活性因子和生長(zhǎng)激素而備受人們關(guān)注[7-9]。光合細(xì)菌能促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，提高植物幼苗的抗逆性，緩解重金屬、紫外線、鹽等脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制作用[10-13]。馬文麗等[11]研究表明，光合細(xì)菌能促進(jìn)Cd2+脅迫下黑小麥幼苗生長(zhǎng)，并提高植株的抗氧化酶活性。Kantha等[14]報(bào)道，光合細(xì)菌能緩解逆境脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制作用。但是光合細(xì)菌對(duì)作物的四環(huán)素類傷害是否有緩解作用，尚未見報(bào)道。為此，以黃瓜為材料，探索復(fù)合光合菌劑PS21對(duì)幼苗四環(huán)素傷害的緩解作用，為復(fù)合光合菌劑PS21的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1 供試土壤及黃瓜 土壤采自河南省周口師范學(xué)院試驗(yàn)田，采集未經(jīng)耕作和未被污染的上層土壤(0～20 cm)，保存于無菌塑料袋中帶回實(shí)驗(yàn)室。供試黃瓜品種為津綠3號(hào)。

1.1.2 供試菌株、培養(yǎng)基及試劑 復(fù)合光合菌劑PS21是周口師范學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)前期試驗(yàn)證明具有抗逆性和促生作用的光合細(xì)菌菌株AR12、AR13的復(fù)配菌劑。兩菌株經(jīng)初步鑒定分別為紅假單胞菌(Rhodopseudomonassp.)、紅螺菌 (Rhodospirilumsp.)。光合細(xì)菌培養(yǎng)基(PSB)采用MM培養(yǎng)基添加0.15%酵母膏[12]。鹽酸四環(huán)素由上海紫一試劑廠生產(chǎn)。

1.2復(fù)合光合菌劑的制備

將光合細(xì)菌AR12、AR13分別接種在PSB液體培養(yǎng)基中，厭氧、28 ℃、100 μmol/(m2·s)光照條件下培養(yǎng)7 d，然后5 000×g離心15 min，采用分光光度計(jì)于660 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，調(diào)整菌液OD值為1.013，此時(shí)菌液濃度為109cfu/mL。將2種光合細(xì)菌按1∶1的體積比配成復(fù)合光合細(xì)菌菌劑PS21，用無菌水調(diào)整菌液濃度為108cfu/mL。

1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將黃瓜種子用70%乙醇表面消毒1～2 min，0.05%次氯酸鈉溶液浸泡10 min，無菌水反復(fù)沖洗。然后將種子放到鋪有消毒濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，加少量蒸餾水，置于25 ℃光照培養(yǎng)箱在黑暗條件下催芽48 h。將風(fēng)干土裝入花盆中(盆高20 cm、直徑25 cm)。試驗(yàn)分A、B 2組，每組分6小組。A組1～6小組：向裝有風(fēng)干土的花盆中加入四環(huán)素，使四環(huán)素的含量分別為10、20、40、60、80、100 mg/kg，然后將黃瓜種子播種在花盆中，每盆20粒種子；B組1～6小組：先采用與A組相同的處理方法，然后分別向上述不同含量四環(huán)素土壤中澆灌復(fù)合光合菌劑25 mL。每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10盆苗。以未用四環(huán)素處理的黃瓜幼苗作為對(duì)照。將黃瓜幼苗置于人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)，光照時(shí)間為12 h/d、晝夜溫度30 ℃/22 ℃、相對(duì)濕度70%。在黃瓜幼苗期(培養(yǎng)第14天)測(cè)定黃瓜形態(tài)指標(biāo)，并取黃瓜植株同位葉測(cè)定生理生化指標(biāo)。

1.4黃瓜生理生化指標(biāo)的測(cè)定

超氧化物歧化酶(SOD) 活性測(cè)定采用NBT光化還原法[15]；過氧化氫酶(CAT) 活性測(cè)定采用紫外吸收法[15]；過氧化物酶(POD) 活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[15]；葉綠素含量測(cè)定采用丙酮和95%乙醇(V∶V=1∶1) 浸提—分光光度法[16]；丙二醛(MDA)含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸(TBA)法[16]。

1.5數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值，數(shù)據(jù)均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差用Microsoft Excel 2003進(jìn)行計(jì)算。數(shù)據(jù)差異顯著性用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1復(fù)合光合菌劑PS21對(duì)四環(huán)素脅迫下黃瓜幼苗生長(zhǎng)的影響

由圖1可知，10～100 mg/kg四環(huán)素顯著抑制黃瓜幼苗的生長(zhǎng)，且隨劑量的升高抑制作用加強(qiáng)。四環(huán)素劑量為100 mg/kg時(shí)，其對(duì)黃瓜生長(zhǎng)的抑制作用最強(qiáng)，與對(duì)照相比，黃瓜幼苗株高、根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量分別降低了62.07%、57.93%、67.95%和76.25%(P<0.05)。施用復(fù)合光合菌劑PS21后，黃瓜幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)顯著增加。PS21緩解了四環(huán)素對(duì)黃瓜生長(zhǎng)指標(biāo)的抑制作用(P<0.05)，但緩解效果與四環(huán)素劑量沒有明顯相關(guān)性。PS21對(duì)100 mg/kg四環(huán)素處理組黃瓜的株高、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的緩解效果最為明顯，比100 mg/kg四環(huán)素單獨(dú)處理組相應(yīng)值分別增加158.92%、140.89%和169.57%；其對(duì)60 mg/kg四環(huán)素處理組黃瓜根長(zhǎng)的緩解作用最為明顯，比60 mg/kg四環(huán)素單獨(dú)處理組提高了119.11%。

A組：四環(huán)素處理；B組：PS21+四環(huán)素處理。不同小寫字母表示同種處理不同劑量間 差異顯著(P<0.05)，*表示不同處理相同劑量間差異顯著(P<0.05)，下同圖1 復(fù)合光合菌劑PS21與不同劑量四環(huán)素復(fù)合處理對(duì)黃瓜幼苗株高、根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的影響

2.2復(fù)合光合菌劑PS21對(duì)四環(huán)素脅迫下黃瓜幼苗葉綠素含量的影響

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的主要色素，其含量反映了葉片的生理狀態(tài)。與對(duì)照相比，10～100 mg/kg四環(huán)素單獨(dú)處理組的黃瓜幼苗葉綠素含量顯著下降，分別比對(duì)照降低了8.02%、18.18%、32.62%、50.278%、55.08%和70.05%(圖2)。PS21處理四環(huán)素脅迫下黃瓜幼苗后，葉片葉綠素含量顯著增加。PS21不同程度地提高了10～100 mg/kg四環(huán)素脅迫下黃瓜葉片的葉綠素含量，分別比四環(huán)素單獨(dú)處理組相應(yīng)值增加了13.37%、18.30%、24.60%、46.24%、36.90%和48.21%。

2.3復(fù)合光合菌劑PS21對(duì)四環(huán)素脅迫下黃瓜幼苗抗氧化酶活性的影響

圖2 復(fù)合光合菌劑PS21與不同劑量四環(huán)素復(fù)合處理對(duì)黃瓜幼苗葉綠素含量的影響

SOD、CAT和POD是植物抗氧化酶系中的主要酶類，能清除植物體內(nèi)活性氧自由基，使植物細(xì)胞免受傷害。由圖3可知，低濃度的四環(huán)素能提高黃瓜幼苗SOD、CAT和POD活性。四環(huán)素劑量為40 mg/kg時(shí)，黃瓜幼苗SOD、POD活性達(dá)到最大值，比對(duì)照酶活性分別提高了167.27% 和169.83%(P<0.05)。CAT活性在四環(huán)素劑量為20 mg/kg時(shí)達(dá)到最高，比對(duì)照酶活性提高了32.20%。然而，隨著四環(huán)素劑量進(jìn)一步提高，SOD、CAT和POD活性降低，說明高濃度的四環(huán)素在一定程度上抑制了抗氧化酶活性。PS21處理黃瓜幼苗后，10～100 mg/kg四環(huán)素脅迫下黃瓜幼苗SOD、CAT和POD活性有不同程度的增加(P<0.05)。四環(huán)素劑量為100 mg/kg時(shí)，PS21對(duì)四環(huán)素抑制SOD活性的緩解效果最為明顯，比四環(huán)素單獨(dú)處理相應(yīng)值增加50.60%。四環(huán)素劑量為80 mg/kg時(shí)，PS21對(duì)四環(huán)素抑制POD活性的緩解作用最強(qiáng)，與單獨(dú)四環(huán)素處理相比，POD活性提高了129.16%。而PS21對(duì)10 mg/kg四環(huán)素抑制CAT活性的緩解效果最強(qiáng)，與單獨(dú)四環(huán)素處理相比，CAT活性提高了98.43%。

圖3 復(fù)合光合菌劑PS21與不同劑量四環(huán)素復(fù)合處理對(duì)黃瓜幼苗SOD、POD和CAT活性的影響

2.4復(fù)合光合菌劑PS21對(duì)四環(huán)素脅迫下黃瓜幼苗MDA含量的影響

MDA是膜脂過氧化的重要產(chǎn)物，其含量的高低是評(píng)定植物細(xì)胞膜受損害程度的指標(biāo)之一。圖4顯示，隨著四環(huán)素劑量的增加，黃瓜幼苗的MDA含量呈增加趨勢(shì)。100 mg/kg四環(huán)素單獨(dú)處理黃瓜幼苗的MDA含量達(dá)到最高，與對(duì)照相比，提高了131.58%。施用PS21后，10～100 mg/kg四環(huán)素各處理組黃瓜幼苗MDA含量下降，與四環(huán)素單獨(dú)處理相比均有顯著差異。四環(huán)素劑量為10 mg/kg時(shí)，PS21對(duì)四環(huán)素破壞細(xì)胞膜的緩解效果最為明顯，MDA含量比四環(huán)素單獨(dú)處理組相應(yīng)值降低25.33%。由此表明，復(fù)合光合菌劑緩解了四環(huán)素對(duì)黃瓜幼苗的傷害。

圖4 復(fù)合光合菌劑PS21與不同劑量四環(huán)素復(fù)合處理對(duì)黃瓜幼苗MDA含量的影響

3 結(jié)論與討論

張浩等[5]和張乙涵等[6]研究證明，四環(huán)素抑制植物的發(fā)芽和根的生長(zhǎng)，其機(jī)制是抑制葉綠體合成酶的活性。秦俊梅等[3]研究表明，四環(huán)素抑制光合作用，降低玉米的株高、根長(zhǎng)、莖葉質(zhì)量、根質(zhì)量和葉綠素含量。本試驗(yàn)結(jié)果表明，10～100 mg/kg四環(huán)素顯著降低黃瓜幼苗的株高、根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和葉綠素含量，且隨四環(huán)素劑量的升高抑制作用加強(qiáng)。同時(shí)，四環(huán)素在低劑量時(shí)提高SOD、CAT和POD活性，自由基能被及時(shí)清除，提高了植物的抗性，而高劑量的四環(huán)素降低SOD、CAT和POD活性，自由基不能及時(shí)得到清除，導(dǎo)致MDA含量的大幅度升高，從而使植物細(xì)胞受到損傷，植物抗逆性下降,植物的生長(zhǎng)受到抑制。

光合細(xì)菌能降解有機(jī)物，并產(chǎn)生各種B族維生素、5-氨基乙酰丙酸卟啉類化合物、植物激素和抗病毒因子等大量生物活性物質(zhì)[7-13]。這些物質(zhì)能激發(fā)植物細(xì)胞的活性，提高植物的光合作用效率和SOD、CAT、POD活性，從而使植物的抗逆性增強(qiáng)。Lee等[17]報(bào)道，紅假單胞菌KL9和BL6菌株能產(chǎn)生吲哚乙酸(IAA)和5-氨基乙酰丙酸(ALA)，調(diào)節(jié)植物的代謝，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。Nunkaew等[13]報(bào)道，ALA能提高抗氧化酶活性，保護(hù)植物細(xì)胞免受破壞。本研究結(jié)果顯示，復(fù)合光合菌劑PS21處理黃瓜幼苗后，緩解了四環(huán)素對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)的抑制作用，促進(jìn)了黃瓜幼苗的生長(zhǎng)，并提高了抗氧化酶活性，黃瓜細(xì)胞內(nèi)活性氧被及時(shí)清除，細(xì)胞受到了保護(hù)。這與一些學(xué)者的研究結(jié)果一致，光合細(xì)菌能提高逆境下植物抗氧化酶活性，促進(jìn)幼苗的生長(zhǎng)[11-14]。本試驗(yàn)采用復(fù)合光合菌劑PS21處理四環(huán)素脅迫下黃瓜幼苗，克服了單一菌劑需菌量大、效果差的缺點(diǎn)。PS21為兩菌株復(fù)配，具有協(xié)同作用和功能互補(bǔ)特點(diǎn)，通過分泌多種生理活性物質(zhì)，促進(jìn)黃瓜幼苗的生長(zhǎng)，增強(qiáng)黃瓜的抗逆性。本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合光合菌劑PS21對(duì)四環(huán)素有較強(qiáng)的毒性緩解作用。分析其原因，可能是：(1)復(fù)合光合菌劑能降解及轉(zhuǎn)化四環(huán)素為無毒物質(zhì)，解除四環(huán)素對(duì)植物的毒害；(2)復(fù)合光合菌劑產(chǎn)生促生因子 (ALA、植物激素和抗病毒因子)，提高植物的抗逆性，促進(jìn)植物生長(zhǎng)。

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Effects of Composite Photosynthetic Bacterial Inoculant PS21 on Seedling Growth and Antioxidant Enzymes Activities in Cucumber under Tetracycline Stress

GE Honglian,GUO Ning

(College of Life Science and Agronomy,Zhoukou Normal University,Zhoukou 466001,China)

The seedling growth and antioxidant enzyme activities in cucumber seedlings were analysed after laboratory simulation of co-treating seedlings with PS21 and 0,10,20,40,60,80,100 mg/kg tetracycline,respectively,in order to explore whether the composite photosynthetic bacterial inoculant PS21 could mitigate the inhibition of cucumber growth by various concentrations of tetracycline.The results showed that tetracycline treatment reduced the shoot height,root length,dry weight,fresh weight as well as the total chlorophyll content and increased the malondialdehyde(MDA) content significantly.Tetracycline treatment activated superoxide dismutase(SOD),catalase(CAT),and peroxidase(POD) at low concentrations,while it decreased the activities of SOD,CAT and POD at high concentrations.At the concentration of 108cfu/mL,PS21 could markedly relieve the toxicity of different concentrations of tetracycline to cucumber seedlings.Compared to the sole tetracycline treatment,PS21 could remarkably increase the shoot height,root length,dry weight,fresh weight,the total chlorophyll content and antioxidant enzyme activities,whereas it decreased MDA content of seedling leaves.These results demonstrated that PS21 alleviated tetracycline toxicity to cucumber plant significantly.

composite photosynthetic bacterial inoculant; tetracycline; cucumber; seedling growth; chlorophyll content; antioxidant enzymes

S642.2

A

1004-3268(2017)10-0071-05

2017-03-15

河南省科技廳科技攻關(guān)項(xiàng)目(162102310588)；周口師范學(xué)院校本項(xiàng)目(ZKNUB215210)

葛紅蓮(1976-)，女，河南扶溝人，副教授，主要從事微生物農(nóng)藥和微生物菌肥的開發(fā)與應(yīng)用研究。E-mail:gehonglian2003@126.com