孫 思 ， 陳玉玲， 左麗娜 ， 張文輝 ， 喬月華

(1徐州市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇 徐州 221009； 2徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 江蘇 徐州 221004)

辛伐他汀對小鼠巨細胞病毒肺炎Toll樣受體2表達的影響*

孫 思1， 陳玉玲2△， 左麗娜2， 張文輝2， 喬月華2

(1徐州市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇 徐州 221009；2徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 江蘇 徐州 221004)

目的觀察辛伐他汀對小鼠巨細胞病毒(MCMV)肺炎小鼠肺組織Toll樣受體2(Toll-like receptor 2, TLR-2)、干擾素γ(IFN-γ)和單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)表達的影響，并探討辛伐他汀干預(yù)MCMV肺炎的可能機制。方法將40只6～8周齡BALB/c小鼠隨機分成5組：正常對照(NC)組、MCMV感染組和辛伐他汀干預(yù)(SMV1、SMV2和SMV3)組。SMV1、SMV2和SMV3組分別在腹腔注射MCMV前7 d、與MCMV同時和MCMV感染后3 d給予辛伐他汀(50 mg·kg-1·d-1，均連續(xù)給藥7 d)灌胃，NC組及MCMV組分別予以同體積的生理鹽水灌胃。HE染色觀察小鼠肺組織的病理改變，real-time PCR檢測MCMV DNA的變化，免疫組化和Western blot檢測肺組織中TLR-2的表達，ELISA檢測肺組織中IFN-γ和MCP-1的變化。結(jié)果與NC組相比，MCMV組肺組織病理染色顯示肺泡間質(zhì)水腫，肺泡壁增寬，內(nèi)可見大量炎性細胞浸潤；肺組織中TLR-2的表達增加，MCMV DNA含量升高，肺組織中炎癥因子IFN-γ和MCP-1明顯增多(P<0.05)。辛伐他汀干預(yù)后，與MCMV組相比，肺組織病理改變較前減輕，TLR-2的表達下降(P<0.05)，MCMV DNA 含量降低(P<0.05)，炎性因子IFN-γ和MCP-1明顯下降(P<0.05)，且SMV1組TLR-2的表達量及MCMV DNA含量下降較SMV2和SMV3組更明顯(P<0.05)，而SMV2和SMV3兩組相比差異無統(tǒng)計學顯著性。結(jié)論辛伐他汀干預(yù)通過下調(diào)TLR-2信號通路而降低TLR-2的表達，減少IFN-γ和MCP-1的分泌，并抑制MCMV DNA的復制，從而使肺組織的病理損害得以減輕；且提前給予辛伐他汀干預(yù)對預(yù)防MCMV的感染及減輕炎癥反應(yīng)具有重要作用。

辛伐他??； 巨細胞病毒； Toll樣受體2； 干擾素γ； 單核細胞趨化蛋白1

巨細胞病毒(cytomegalovirus，CMV)是一種普遍存在的雙鏈DNA病毒，其通常呈隱性感染，多數(shù)感染者無臨床癥狀，但在一定條件下可以侵襲多個器官和系統(tǒng)產(chǎn)生嚴重疾病。數(shù)十年來，預(yù)防CMV感染的藥物不僅有限，而且結(jié)果往往不能令人滿意，因此，迫切需要一種新的更加安全有效的藥物以預(yù)防CMV感染、阻斷炎癥反應(yīng)的通路。已有研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀(simvastatin，SMV)，即3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，除了能有效降低膽固醇水平及減少心血管的發(fā)病，同時似乎也發(fā)揮一些“多效”作用，尤其在抗炎方面的作用更為突出[1]。既往研究表明，Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)可能參與辛伐他汀的抗炎過程[2]，而且CMV致使炎癥反應(yīng)的機制之一可能主要通過TLR-2-MyD88依賴性途徑介導炎癥反應(yīng)[3-4]。同時Niessner 等[2]研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀可能抑制TLR-2的表達，導致TLR信號通路下調(diào)，致使下游的細胞因子、趨化因子分泌減少。此外，抑制TLRs信號通路，能減少CMV的激活[2]。本實驗旨在探討辛伐他汀對TLR-2介導的信號通路和小鼠CMV(mouse CMV, MCMV) DNA復制的影響，驗證其能否成為一種新的預(yù)防CMV感染及減輕炎癥反應(yīng)的藥物。

材 料 和 方 法

1動物與試劑

6～8周齡SPF級BALB/c小鼠40只，雄性，購自徐州醫(yī)學院實驗動物中心。動物飼養(yǎng)于獨立送風隔離籠具系統(tǒng)內(nèi)，等級為屏障系統(tǒng)。小鼠3T3細胞和MCMV Smith株均由山東省醫(yī)學科學院微生物研究所提供。小鼠3T3細胞按常規(guī)方法培養(yǎng)傳代，病毒致半數(shù)細胞感染量=108.31/L。辛伐他汀購自杭州默沙東有限公司；ELISA試劑盒購自上海依科賽生物制品有限公司。

2方法

2.1實驗動物分組及模型建立 將40只6～8周齡小鼠隨機均分成5組，即正常對照(normal control，NC)組、MCMV感染(MCMV)組和辛伐他汀干預(yù)組(SMV1、SMV2和SMV3組)，每組8只。以第1次注射環(huán)磷酰胺為第0天，MCMV、SMV1、SMV2和SMV3組均于第0、1、2天腹腔注射環(huán)磷酰胺(80 mg/kg)，第2天注射環(huán)磷酰胺后1 h，MCMV組和SMV干預(yù)組的小鼠每只腹腔注射MCMV株懸液0.8 mL。SMV1組、SMV2組和SMV3組的動物分別在腹腔注射MCMV前7 d、同時和后3 d給予辛伐他汀灌胃(均連續(xù)給藥7 d， 50 mg·kg-1·d-1)。NC組及MCMV組分別予以同體積的生理鹽水灌胃。在此期間觀察小鼠的一般情況，如活動、飲水、有無聳毛、毛發(fā)稀疏等情況。給藥結(jié)束后取小鼠肺組織行HE染色、免疫組化、real-time PCR和Western blot進行檢測。

2.2免疫組化法檢測TLR-2的表達 石蠟切片常規(guī)脫蠟、抗原修復及山羊血清封閉，加TLR-2抗體(1∶500稀釋)4 ℃孵育過夜，再加生物素標記Ⅱ抗孵育，DAB染色。胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達。用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件采集。每個指標選取5個不同切面，取平均值進行統(tǒng)計。

2.3Western blot檢測TLR-2 取肺組織100 mg，提取總蛋白，依次經(jīng)配膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，孵育TLR-2的Ⅰ抗抗體過夜，洗膜后加入熒光 II 抗室溫孵育2 h，ECL發(fā)光液顯色后用ImageJ軟件分析條帶的灰度。

2.4Real-time PCR法測肺組織中MCMV DNA含量 通過DNA試劑盒從肺組織中提取MCMV DNA，將各組標本的DNA濃度進行標準化，根據(jù)MCMV DNA的量和ddH2O的量的比例，計算各組DNA的量。上游引物為5’-TCAGCCATCAACTCTGCTACCAAC-3’，下游引物為5’-ATCTGAAACAGCCGTATATCATCTTG-3’。反應(yīng)條件： 94 ℃ 3 min； 94 ℃ 30 s， 48 ℃ 30 s， 72 ℃ 20 s， 循環(huán)40次； 72 ℃ 10 min； 4 ℃ 冷卻。反應(yīng)完成后，進行定量分析，根據(jù)預(yù)值調(diào)整基線，讀出結(jié)果。實驗結(jié)果按照2-ΔΔCt方法處理數(shù)據(jù)。

2.5ELISA檢測肺組織干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)和單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)的含量 嚴格按照試劑盒說明書操作，酶聯(lián)免疫檢測儀測定450 nm處吸光度值，繪制標準曲線，計算樣本結(jié)果。

3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較用SNK-q檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1肺組織病理學觀察

本文針對花崗巖和大理巖進行了4組三點彎曲巖石變形破裂過程微震和電荷感應(yīng)監(jiān)測試驗，其中75#和76#為完整花崗巖，77#和78#為預(yù)制裂紋花崗巖，79#和80#為完整大理巖，81#和82#為預(yù)制裂紋大理巖，所有試樣加載速度都為0.05kN/s，選取其中具有代表性的監(jiān)測數(shù)據(jù)作為研究對象，并對其中各參量數(shù)據(jù)進行處理。表1為各試樣載荷峰值、峰值位移以及試樣達到載荷峰值時刻，圖3為各試樣破壞后的照片。

光學顯微鏡可見：NC組肺組織均可見完整的肺泡腔，肺泡結(jié)構(gòu)正常，肺間質(zhì)偶有散在的炎性細胞存在。MCMV組可見肺泡間質(zhì)水腫，肺泡壁增寬，內(nèi)可見大量炎性細胞浸潤，以單核細胞為主，上述病理符合MCMV間質(zhì)性肺炎的表現(xiàn)。SMV干預(yù)后間質(zhì)性炎癥浸潤較MCMV組減輕，見圖1。

Figure 1. Observation of the lung tissues in each group under optical microscope (HE staining, ×200).

圖1各組肺組織的病理變化

2免疫組織化學檢測TLR-2蛋白表達的變化

肺組織中TLR-2的表達在NC組與MCMV組及不同SMV干預(yù)組之間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，SMV干預(yù)后TLR-2表達明顯少于MCMV組(P<0.05)，且SMV1組與SMV2組和SMV3組相比，TLR-2表達更少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而SMV2組和SMV3組兩組相比差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖2。

Figure 2. The protein expression of TLR-2 in the lung tissues of each group determined by immunohistochemical staining(×200). Mean±SD.n=8.△P<0.05vsNC group;*P<0.05vsMCMV group;#P<0.05vsSMV1 group.

圖2各組肺組織TLR-2的免疫組織化學染色和半定量分析

3Westernblot檢測TLR-2蛋白表達的變化

感染MCMV后，MCMV組TLR-2表達增加，與NC組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；SMV1組、SMV2組和SMV3組的TLR-2表達較MCMV組下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；且SMV1組下降較SMV2組和SMV3組更為明顯(P<0.05)，而SMV2組和SMV3兩組之間相比差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖3。

4ELISA檢測IFN-γ和MCP-1的含量

與NC組比較，MCMV組的IFN-γ和MCP-1含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；SMV干預(yù)后的IFN-γ和MCP-1含量明顯低于MCMV組(P<0.05)，且SMV1組下降更明顯，與SMV2組和SMV3組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而SMV2組和SMV3兩組之間的差異無統(tǒng)計學顯著性，見表1。

與MCMV組比較，SMV1組、SMV2組和SMV3組MCMV DNA含量顯著下降，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，且SMV1組下降較SMV2和SMV3組更為明顯(P<0.05)，而SMV2和SMV3組之間差異無統(tǒng)計學意義，見圖4。

Figure 3. The protein expression of TLR-2 in lung tissues was detected by Western blot. Mean±SD.n=8.△P<0.05vsNC group;*P<0.05vsMCMV group;#P<0.05vsSMV1 group.

圖3Westernblot檢測肺組織中TLR-2蛋白的表達

表1 各組小鼠肺組織IFN-γ和MCP-1的表達

△P<0.05vsNC group;*P<0.05vsMCMV group;#P<0.05vsSMV1 group.

Figure 4. The relative content of MCMV DNA in lung tissue of each group. Mean±SD.n=8.△P<0.05vsNC group；*P<0.05 MCMV group；#P<0.05vsSMV1 group.

圖4各組小鼠肺組織MCMVDNA的相對含量

討 論

感染MCMV后，病毒蛋白可以識別并啟動TLRs介導的先天性抗病毒免疫反應(yīng)[5]。由于TLR-2位于細胞膜表面并識別病毒蛋白，與TLR-1或TLR-6共同作用激活MyD88依賴型及下游轉(zhuǎn)錄因子NF-κB信號通路誘導一系列促炎細胞因子、趨化因子及黏附分子的產(chǎn)生，調(diào)控病毒復制和/或宿主反應(yīng)，最終影響病毒的發(fā)病機制[6]。在小鼠脾臟感染MCMV的研究中，TLR-2能促進IFN-γ的產(chǎn)生[7]。IFN-γ還可以刺激多種先天性免疫細胞和免疫效應(yīng)器細胞活化，以激活適應(yīng)性免疫反應(yīng)發(fā)揮抗病毒作用[8]。有研究表明，感染MCMV的細胞可以通過間接效應(yīng)引起MCP-1的上調(diào)，刺激轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活[9]，進一步促進IFN-γ的產(chǎn)生，以對抗MCMV感染，發(fā)揮保護效應(yīng)。而其它研究也表明，在感染期間，IFN-γ的產(chǎn)生也會促進MCP-1的分泌[10]。而本實驗研究結(jié)果與Niessner 等[2]研究結(jié)果一致。本實驗結(jié)果顯示，感染MCMV后，小鼠肺組織發(fā)生病理損害，TLR2表達增加，IFN-γ和MCP-1明顯增多，影響MCMV的復制。因此，結(jié)合本研究結(jié)果，進一步表明MCMV肺炎的發(fā)生是通過上調(diào)TLR2信號通路介導的炎癥反應(yīng)，加重肺組織的病理損傷，最終影響MCMV的復制和合成。

辛伐他汀除了其有效降低膽固醇水平，減少心血管發(fā)病，同時具有多效性[1]。已有研究證明，辛伐他汀能抑制TLR-2的表達[2]，并通過MyD88介導的途徑抑制下游NF-κB信號通路的激活[11-12]，從而減少細胞因子的產(chǎn)生。在每一個炎癥反應(yīng)過程中，絕大多數(shù)細胞反應(yīng)需要NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性[13]。這些效應(yīng)可能與辛伐他汀減少NF-κB的結(jié)合活性有關(guān)[14]。根據(jù)一系列證據(jù)表明，本實驗結(jié)果顯示的MCMV肺炎通過辛伐他汀干預(yù)后，下調(diào)TLR-2介導的信號通路，從而使TLR-2表達下降；進一步通過下調(diào)TLR-2-MyD88依賴性途徑致使IFN-γ和MCP-1分泌減少，從而使MCMV肺炎的病理損害得以減輕的這一過程似乎為辛伐他汀的“抗病毒”作用提供了一個較為合理的解釋。因此，目前的發(fā)現(xiàn)進一步支持這一觀點，通過干預(yù)TLRs信號通路可能成為減輕宿主細胞炎癥反應(yīng)的治療靶點。因此，辛伐他汀可以考慮作為一個特殊的抗炎藥物干預(yù)CMV感染，同時也可以通過干預(yù)CMV的復制周期發(fā)揮所謂的“抗病毒”作用。

本實驗研究也發(fā)現(xiàn)，在MCMV感染前給予辛伐他汀干預(yù)比在機體免疫力下降和感染后給藥效果更明顯。目前也有大量臨床研究表明，提前干預(yù)效果可能會更好。由于辛伐他汀的可利用性，特殊的抗炎作用及對CMV活性的影響，它可以考慮用于CMV感染前的預(yù)防用藥，以減少甚至阻斷CMV的感染和發(fā)病。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

EffectofsimvastatinonexpressionofToll-likereceptor2inmousecytomegaloviruspneumonia

SUN Si1, CHEN Yu-ling2, ZUO Li-na2, ZHANG Wen-hui2, QIAO Yue-hua2

(1DepartmentofRespiratoryMedicine,TheCentralHospitalofXuzhou,Xuzhou221009,China；2DepartmentofRespiratoryMedicine，TheAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalUniversity，Xuzhou221004，China.E-mail:pingcyl@126.com)

AIM: To investigate the effects of simvastatin on the expression of Toll-like receptor 2 (TLR-2), interferon-γ (IFN-γ) and monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) in lung tissues of mice with mouse cytomegalovirus (MCMV) pneumonia and to explore the possible mechanism.METHODSMale BALB/c mice (6～8 weeks old,n=40) were randomly divided into 5 groups: normal control (NC) group, MCMV infection group, simvastatin group 1 (SMV1 group), simvastatin group 2 (SMV2 group), and simvastatin group 3 (SMV3 group). The mice in SMV1, SMV2 and SMV3 groups were gavaged with simvastatin (50 mg·kg-1·d-1for 7 d) 7 d before, on the same day of and 3 d after intraperitoneal injection of MCMV, while the mice in normal control group and MCMV infection group were gavaged with the same volume of normal saline. HE staining was used to observe the pathological changes of lung tissues in mice. Total tissue protein was extracted from the lung homogenates to detect the expression of TLR-2 by Western blot and immunohistochemical staining. Real-time PCR was used to analyse the content of MCMV DNA. The levels of IFN-γ and MCP-1 were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).RESULTSCompared with NC group, the pathological changes of the lung tissues of the mice in MCMV group showed alveolar interstitial edema, alveolar wall widening and a large number of inflammatory cells. The expression of TLR-2 in the lung tissues of the mice in model group was increased significantly. The content of MCMV DNA was increased， and the expression of IFN-γ and MCP-1 was also increased significantly. Compared with the mice in MCMV group, the pathological changes of the lung tissues of simvastatin groups showed that the inflammatory cells were decreased. The expression of TLR-2 was down-regulated. The content of MCMV DNA was decreased， and the levels of IFN-γ and MCP-1 were also decreased significantly. At the same time, the expression of TLR-2 and the content of MCMV DNA in SMV1 group were less than those in SMV2 and SMV3 groups (P<0.05), and no statistically significant difference between SMV2 and SMV3 groups was observed.CONCLUSIONSimvastatin down-regulates the TLR-2 signaling pathway, and reduces the expression of TLR-2 and replication of MCMV DNA, thus attenuating the pathological damage of the lung tissue. Early intervention with simvastatin plays an important role in preventing the infection of MCMV and reducing the inflammation.

Simvastatin; Cytomegalovirus; Toll-like receptor 2; Interferon-γ; Monocyte chemoattractant protein-1

R373.9； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.10.025

1000- 4718(2017)10- 1886- 05

2016- 11- 16

2017- 05- 04

江蘇省六大人才高峰項目(No. 2014-WSN-043)

△通訊作者 Tel： 0516-85902322； E-mail： pingcyl@126.com

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