曾 博， 傅珉倚， 馮沿芬， 韓向前， 鄒大威， 羅紅鶴， 雷藝炎△

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1胸外科， 2手術(shù)麻醉中心， 廣東 廣州 510080； 3中山大學(xué)腫瘤防治中心病理科， 廣東 廣州 510060)

Mnk2蛋白水平與食管鱗癌預(yù)后的相關(guān)性*

曾 博1， 傅珉倚2， 馮沿芬3， 韓向前1， 鄒大威1， 羅紅鶴1， 雷藝炎1△

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院1胸外科，2手術(shù)麻醉中心， 廣東 廣州 510080；3中山大學(xué)腫瘤防治中心病理科， 廣東 廣州 510060)

目的檢測(cè)絲裂原活化蛋白激酶相互作用激酶2(mitogen-activated protein kinase-interacting kinase-2，Mnk2)在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)水平，并探討其與患者生存預(yù)后的相關(guān)性。方法收集臨床食管鱗癌標(biāo)本86例及癌旁正常食管組織54例，應(yīng)用Western blot法和免疫組化SP法檢測(cè)腫瘤組織及正常食管黏膜組織中Mnk2蛋白表達(dá)水平，并用Kaplan-Meier生存曲線和Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型的方法探究其與食管鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果Mnk2在食管癌組織中呈高表達(dá)，并且Mnk2蛋白表達(dá)與食管鱗癌的TNM分期密切相關(guān)(P<0.05)，同時(shí)Mnk2蛋白高表達(dá)組的無疾病進(jìn)展生存期和總生存期均少于Mnk2低表達(dá)組，多因素分析提示Mnk2是食管鱗癌的獨(dú)立預(yù)后因子。結(jié)論Mnk2在食管鱗癌組織中的表達(dá)與TNM分期有關(guān)，同時(shí)可作為預(yù)測(cè)食管鱗癌患者預(yù)后的指標(biāo)。

食管鱗癌； 絲裂原活化蛋白激酶相互作用激酶2； 預(yù)后因子

食管癌已成為嚴(yán)重威脅人類健康的常見惡性腫瘤之一，全世界范圍內(nèi)其死亡率位于第6位[1]。食管癌主要分為鱗癌和腺癌2種病理類型，中國(guó)地區(qū)人群主要以鱗癌為主，超過了食管癌總數(shù)的90%。過去10年，雖然食管癌的早期診斷和個(gè)性化治療取得很大進(jìn)展，但是食管癌的5年生存率依然低于20%[2]?？茖W(xué)家們想通過研究例如程序性死亡分子配體1(programmed death ligand-1，PD-L1)和表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)等分子通路來分析食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，從而找到預(yù)測(cè)和治療食管癌的新方法，然而效果尚不令人滿意。

本課題組之前已報(bào)道了絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)相互作用激酶2(MAPK-interacting kinase-2，Mnk2)，作為一種MAPK通路激活的蛋白激酶，激活后可以作用于真核細(xì)胞翻譯起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E，eIF4E)，其上調(diào)被證明可以促進(jìn)食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展，提示Mnk2在食管鱗癌研究中的作用[3]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用Western blot法和免疫組化SP法進(jìn)一步驗(yàn)證Mnk2的表達(dá)，并首次分析了其對(duì)食管鱗癌患者預(yù)后的影響。

材 料 和 方 法

1研究對(duì)象

收集2010年8月～2012年6月中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外手術(shù)切除的86例食管鱗癌標(biāo)本及54例距癌組織5 cm以上的手術(shù)遠(yuǎn)端切緣的正常食管黏膜上皮組織標(biāo)本。全部患者均有完整臨床資料，術(shù)前均未接受放、化療，且術(shù)后全部病理切片均由我院病理科2位以上病理醫(yī)生確診為食管鱗癌。電話隨訪患者每3個(gè)月1次直至死亡或術(shù)后滿5年，隨訪時(shí)間是從手術(shù)日期到死亡日期或者最后1次隨訪日期計(jì)算。本研究經(jīng)中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2主要試劑

兔多克隆抗Mnk2抗體購自Sigma-Aldrich；BCA試劑盒和 II 抗購自Bio-Rad。

3方法

3.1Western blot法檢測(cè)Mnk2的表達(dá) 將食管組織研碎加入細(xì)胞溶解液提取蛋白。用BCA蛋白試劑盒檢測(cè)提取的組織溶液蛋白濃度。將等量的總蛋白進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，然后用脫脂奶粉封閉，洗膜后放入抗Mnk2抗體(1:1 000)溶液中，在4 ℃搖床上過夜。洗膜后放入 II 抗中孵育，再洗膜，顯影。顯影后的膠片用ImageJ 1.47i軟件掃描分析。

3.2免疫組化檢測(cè)Mnk2的表達(dá) 每例手術(shù)標(biāo)本分別在癌灶及距癌組織5 cm以上正常食管組織2處取材。全部標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定、石蠟包埋及4 μm連續(xù)切片。按照試劑盒說明書，采用SP方法進(jìn)行檢測(cè)，切片最終通過DAB顯色并分析。以Mnk2已知陽性反應(yīng)的組織切片作為陽性對(duì)照， 以PBS代替 I 抗作為陰性對(duì)照。

3.3免疫組化結(jié)果判定 Mnk2蛋白陽性信號(hào)定位于胞核。染色結(jié)果采用Thomas綜合計(jì)分法計(jì)算，即隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)算陽性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)和著色程度：陽性細(xì)胞<10%計(jì)0分，11%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，76%～100%計(jì)4分；淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。將陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和著色強(qiáng)度的計(jì)分相乘，以中位數(shù)8分作為截?cái)嘀?，小于或等?為低表達(dá)，大于8為過表達(dá)。以上結(jié)果均至少由2位病理科醫(yī)生以盲法觀察確定。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用χ2檢驗(yàn)、Kaplan-Meier生存曲線和Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型對(duì)臨床病理特征、總生存期(overall survival，OS)、無疾病進(jìn)展生存期(disease-free survival，DFS)及預(yù)后因子的單-多因素分析進(jìn)行處理， 以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1Mnk2在食管鱗癌中的表達(dá)

隨機(jī)挑選了20對(duì)新鮮食管鱗癌組織和癌旁正常組織行Western blot法檢測(cè)，結(jié)果示Mnk2在食管鱗癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，陽性率為75.0%，并且Mnk2陽性表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度(T)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N)和臨床分期(clinical stage)均有顯著的相關(guān)性(P<0.05)。將86份腫瘤組織和54份癌旁正常食管組織用免疫組化法進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)食管鱗癌組織中Mnk2染色陽性率為52.3%，在正常食管組織中則為5.6%，見圖1、2和表1、2。

Figure 1. The expression of Mnk2 in ESCC pericarcinomatous tissues and cancerous tissues detected by Western blot. Mean±SD.n=20.**P<0.01vspericarcinomatous tissue group.

圖1Westernblot法檢測(cè)Mnk2在食管鱗癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)

Figure 2. The expression of Mnk2 in normal esophageal tissues and ESCC tissues detected by immunohistochemistry. A: normal esophageal tissue showed nearly negative expression of Mnk2; B: low expression of Mnk2 in ESCC sample; C: high expression of Mnk2 in ESCC sample.

圖2免疫組化法檢測(cè)Mnk2在癌旁正常組織和食管鱗癌組織中的表達(dá)

表1Westernblot法檢測(cè)Mnk2在新鮮食管鱗癌組織中的表達(dá)及與腫瘤TNM分期的相關(guān)性分析

Table 1. Correlation between Mnk2 protein expression by Wes-tern blot and clinical characteristics in ESCC (n=20)

VariableLowexpression(n=5)Highexpression(n=15)PTstage0．014 T1/T24(20．0%)2(10．0%) T3/T41(5．0%)13(65．0%)Nstage0．016 N05(25．0%)5(25．0%) N1?20(0．0%)10(50．0%)Clinicalstage0．030 I/II5(25．0%)6(30．0%) III0(0．0%)9(45．0%)

2食管鱗癌Mnk2陽性表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

免疫組化方法顯示，在86例食管鱗癌中，Mnk2陽性表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度和臨床分期均有顯著的相關(guān)性(P<0.05)，而與年齡、性別、吸煙、腫瘤分化程度、腫瘤侵犯長(zhǎng)度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均未顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，見表3。

3食管鱗癌Mnk2的生存預(yù)后分析

Kaplan-Meier生存曲線提示ESCC 病人Mnk2高表達(dá)與較差的OS和DFS密切相關(guān)(P<0.05)，見圖3。單因素分析提示Mnk2高表達(dá)與DFS和OS相關(guān)(P<0.05)，多因素分析提示Mnk2是ESCC 病人DFS和OS的獨(dú)立預(yù)后因子(P<0.05)，見表4、5。

表2 免疫組化法檢測(cè)Mnk2在食管鱗癌和正常食管組織中的表達(dá)

討 論

MAPK信號(hào)通路在惡性腫瘤中發(fā)揮了促有絲分裂和抗凋亡作用，在食管癌研究中也發(fā)現(xiàn) MAPK 信號(hào)通路的表達(dá)失調(diào)，被認(rèn)為是參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要通路之一[4]。我們首次報(bào)道了Mnk2作為MAPK通路的重要信號(hào)分子，在食管鱗癌中的表達(dá)及作用，闡述了Mnk2可能作為細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)通路的下游因子，通過活化后上調(diào)eIF4E的表達(dá)，從而促進(jìn)食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展[5-6]。在本研究中，我們進(jìn)一步完善研究方法和樣本數(shù)，收集食管鱗癌患者隨訪預(yù)后資料，對(duì)Mnk2蛋白在疾病預(yù)后中的作用進(jìn)行了研究。

本次實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)黾恿藢?duì)新鮮食管鱗癌組織的檢測(cè)，并擴(kuò)大了正常組織對(duì)照樣本量，進(jìn)一步驗(yàn)證了Mnk2在食管鱗癌中的高表達(dá)效應(yīng)及在癌旁正常組織中的低表達(dá)效應(yīng)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在2種檢測(cè)方法中Mnk2的陽性表達(dá)均與食管鱗癌的腫瘤浸潤(rùn)深度、臨床分期密切相關(guān)，為Mnk2促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞增殖和抗凋亡進(jìn)而影響腫瘤浸潤(rùn)深度的作用提供了證據(jù)，然而Mnk2過表達(dá)對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響在大樣本中沒有統(tǒng)計(jì)相關(guān)性，其是否具有促腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用還有待進(jìn)一步研究。

表3食管鱗癌組織Mnk2陽性表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

Table 3. Correlatim between the protein expression of Mnk2 and clinical characteristics in ESCC (n=86)

VariableLowexpression(n=41)Highexpression(n=45)PAge(year)60．3±10．660．2±9．20．974Sex0．955 Male33(38．4%)36(41．9%) Female8(9．3%)9(10．5%)Smoking0．745 Yes26(30．2%)27(31．4%) No15(17．4%)18(20．9%)Differentiation0．337 Low17(19．8%)16(18．6%) Moderate20(23．3%)23(26．7%) High4(4．7%)6(7．0%)Lengthoftumor(cm)2．92±1．253．46±1．570．091Tstage0．001 T1/T224(27．9%)11(12．8%) T3/T417(19．8%)34(39．5%)Nstage0．356 N028(32．6%)24(27．9%) N1?213(15．1%)21(24．4%)Clinicalstage0．017 I/II28(32．6%)20(23．3%) III13(15．1%)25(29．1%)

我們還發(fā)現(xiàn) Mnk2表達(dá)高低對(duì)食管鱗癌患者的預(yù)后存在顯著影響，Mnk2高表達(dá)組 OS及 DFS較 Mnk2 低表達(dá)組明顯降低，提示其表達(dá)高低與預(yù)后密切相關(guān)。進(jìn)一步行多因素分析， 結(jié)果發(fā)現(xiàn) Mnk2 的表達(dá)是影響食管鱗癌患者 OS及 DFS的獨(dú)立預(yù)后因子。 因此，我們認(rèn)為 Mnk2 的表達(dá)對(duì)預(yù)測(cè)食管鱗癌患者的預(yù)后具有一定價(jià)值，同時(shí)可能作為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)之一。已有報(bào)道研究Mnks抑制劑在腫瘤中的抗癌作用，例如急性髓系白血病[7]、卵巢癌、結(jié)腸癌和乳腺癌[8]等。由于Mnks抑制劑作用的復(fù)雜性，不同的研究甚至出現(xiàn)了相互矛盾的結(jié)果。一方面Mnks抑制劑表現(xiàn)出了在細(xì)胞周期中抗腫瘤細(xì)胞生殖和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用，另一方面證明了Mnks抑制劑的敏感性可能與eIF4E的磷酸化水平相關(guān)[9]。更多研究報(bào)道了大部分實(shí)體瘤對(duì)特異性Mnk2抑制劑的敏感性超過了非特異性的Mnks抑制劑[7]，提示了Mnk2在實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)的過程中的特殊作用。然而Mnks抑制劑對(duì)食管癌作用的資料尚少，將是我們今后研究工作的方向。

綜上所述， 本研究從Mnk2與食管鱗癌的臨床相關(guān)性進(jìn)行了研究，證明了Mnk2的表達(dá)與食管鱗癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，且其表達(dá)情況與食管鱗癌的臨床特性存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性， 提示可能在食管鱗癌中的發(fā)生發(fā)展起重要作用，同時(shí)為研究Mnk2信號(hào)通路在食管癌中的作用及其作為靶向治療的潛在靶點(diǎn)提供了前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

Figure 3. Kaplan-Meier survival analysis of Mnk2 expression in ESCC patients (n=86). A: overall survival (OS) curves for ESCC patients according to the expression of Mnk2; B: disease-free survival (DFS) curves for ESCC patients according to the expression of Mnk2.

圖3Kaplan-Meier生存曲線分析Mnk2表達(dá)與食管鱗癌患者OS及DFS的關(guān)系

表4 食管鱗癌患者DFS的單-多因素分析

表5 食管鱗癌患者OS的單-多因素分析

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 余小慧)

CorrelationbetweenMnk2proteinexpressionandprognosisofpatientswithesophagealsquamouscellcarcinoma

ZENG Bo1, FU Min-yi2, FENG Yan-fen3, HAN Xiang-qian1, ZOU Da-wei1, LUO Hong-he1, LEI Yi-yan1

(1DepartmentofThoracicSurgery，2DepartmentofSurgeryandAnesthesiaCenter,TheFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China;3DepartmentofPathology,SunYat-senUniversityCancerCenter,Guangzhou510060,China.E-mail:leiyyzsu@126.com)

AIM: To investigate the protein expression of mitogen-activated protein kinase-interacting kinase-2 (Mnk2) and its prognostic effect in the patients with resected esophageal squamous cell carcinoma (ESCC).METHODSA total of 86 informative patients with surgically resected ESCC and 54 normal esophageal tissues were enrolled. Western blot and immunohistochemistry (IHC) were utilized to assess the protein expression of Mnk2, and its correlation with prognosis was statistically analyzed by the methods of Kaplan-Meier curve and Cox proportional hazard mode.RESULTSThe protein expression of Mnk2 was elevated in most of tumor tissues compared with the adjacent tissues. Clinicopathologic analysis showed that Mnk2 expression was significantly correlated with the TNM stage (P<0.05). Both disease-free survival (DFS) and overall survival (OS) of Mnk2 over-expression patients were shorter than those in Mnk2 negative expression group. Multivariate analysis confirmed that Mnk2 expression, as an independent and significant factor for both DFS and OS, predicted a poor prognosis of the patients with resected ESCC (P<0.05).CONCLUSIONThe expression of Mnk2 was significantly related to the TNM stages, and might be a novel predictor for prognosis in ESCC.

Esophageal squamous cell carcinoma; Mitogen-activated protein kinase-interacting kinase-2; Prognosis factor

R730.23； R735.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.10.021

1000- 4718(2017)10- 1864- 05

2017- 07- 04

2017- 09- 11

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助項(xiàng)目(No. A2014217； No. A2014246； No. A2016297)

△通訊作者 Tel: 020-87755766-8782; E-mail: leiyyzsu@126.com

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