陳影 徐喜媛 格日勒 烏日娜 楊敬平

膿毒癥相關miRNA的基因芯片研究

陳影1,2徐喜媛1格日勒1烏日娜1楊敬平1

目的應用基因芯片技術，篩選可用于診斷、預測膿毒癥預后的血清miRNA及其相關靶基因。方法膿毒癥組：我院呼吸與危重癥醫(yī)學科2015年01月到2015年12月收治的漢族膿毒癥患者32例；正常對照組：本單位健康體檢者32例。收集2組的外周血液標本，鑒定總RNA的質(zhì)量后與人類miRNA探針的基因芯片進行雜交并分析。結果膿毒癥組和正常對照組中差異表達的miRNA有305個，其中在膿毒癥組中上調(diào)miRNA有129個，下調(diào)miRNA有176個，上調(diào)基因中差異表達10倍以上的共有5個，分別是：miRNA-6778-3p、miRNA-6514-3p、miRNA-3591-3p、miRNA-4446-5p和miRNA-34b-3p；下調(diào)基因中差異表達10倍以上的有1個是miRNA-625-5p，在差異表達5倍以上的有5個，分別是miRNA-6756-5p、miRNA-505-5p、miRNA-130b-3p、miRNA-1914-3p和miRNA-501-5p。結論通過初步的基因芯片分析發(fā)現(xiàn)本組膿毒癥患者異常表達的miRNA有305個，其中顯著差異表達的miRNA有18個。

膿毒癥;基因芯片;miRNA

膿毒癥(Sepsis)是感染、燒傷及休克等急危重患者的常見并發(fā)癥，每年膿毒癥患者死亡率仍高達20%，因此快速識別診斷膿毒癥是有效降低膿毒癥致死率的關鍵[1]。目前研究表明miRNA參與膿毒癥的發(fā)病，但其對膿毒癥的診斷及預后判斷方面研究較少[2]。本研究應用基因芯片技術檢測膿毒癥患者外周血miRNA，為膿毒癥的早期診斷探索有意義的指標。

資料與方法

一、觀察對象

膿毒癥組：收集內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科2015年01月到2015年12月的膿毒癥住院患者32例，其中男性21例，女性11例，年齡在22-80歲。膿毒癥診斷標準符合Sepsis 3.0標準即感染+SOFA評分≥2分[2]。排除標準:① 年齡>80歲，年齡<18歲，肝腎功能衰竭的患者；② 住院前4周內(nèi)使用過糖皮質(zhì)激素的患者；③ 住院前8周內(nèi)接受過化療的患者；④ 既往有器官移植術，接受過免疫抑制劑治療的患者；⑤ 懷孕、HIV病毒攜帶者的患者；⑥ 有獲得性免疫缺陷綜合征的患者；⑦ 中途自動出院而退出的患者。健康對照組：本單位健康體檢者，共32例，其中男性18例，女性14例，年齡為26-80歲。本研究經(jīng)過我院醫(yī)學倫理委員會批準，所有研究對象均簽署書面知情同意書，研究對象可隨時根據(jù)自己的意愿退出臨床觀察,本組患者無脫落。

二、研究方法

1. 樣本收集:所有實驗人員均于入院時采集外周靜脈抗凝血4mL，分別放入2個含2%EDTA抗凝劑的試管中,-80℃冷凍保存。

2. 外周血目的RNA獲取及芯片分析：應用百泰克RNA提取試劑盒(北京中科瑞泰生物技術有限公司)提取總RNA：將標本室溫放置后，低溫高速離心機離心6.600rpm×10min，加入裂解液及蛋白酶，55℃孵育10min，過吸附柱CR2放入回收集管中，漂洗離心提取血液總RNA溶液。取2 μL總RNA應用Nanodrop1000紫外分光光度儀(美國Therom公司)檢測A230、A260和A280的值以確定所抽提的總RNA的質(zhì)量和濃度：純DNA的A260/A280比值為1.8，純RNA為2.0，純DNA和 RNA的A260/A230比值為2.5。將含有樣品的混合液進行電泳(美國伯樂公司)，在凝膠成像分析儀(日本Nikon公司)上觀察條帶并照相。質(zhì)檢合格的總RNA 進行使用 mirVana miRNA Isolation Kit(上海艾博思生物技術有限公司)純化。純化后總RNA去磷酸化，使用miRNA 完全標記和Hyb 工具包的試劑盒(Agilent 公司)中的 T4 RNA 連接酶把 Cyanine3-pCp 連接到 RNA3’端雜交，雜交結束洗片后進行掃描。Agilent芯片實驗及分析由北京博奧生物公司完成。

3.數(shù)據(jù)提取及分析:實驗所得雜交圖片用Agilent Feature Extraction(v10.7)軟件來進行處理分析，然后使用 Agilent GeneSpring軟件對數(shù)據(jù)采取歸一化的處理，采用 GeneSpring 軟件中的T-test unpair方法進行兩組差異表達得到P值(P<0.05表示差異表達有意義)，Benjamini Hochberg FDR方法進行校正得到P(Corr)值，TargentScan軟件對其可能的靶基因進行預測。

結 果

一、 膿毒癥患者一般資料

膿毒癥組及正常組CRP、PCT分別為：156±116 mg/L及11.3±6.1 mg/L、12.2±15.7及0.18±0.16 ng/mL。膿毒癥組患者以上各值均明顯高于對照組(P均<0.01)。膿毒癥組SOFA評分為3.33±1.36。(見表1)。

表1 膿毒癥患者臨床資料

二、提取RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖

28s和18s是真核生物rRNA(核糖體RNA)的兩個主要亞基，在RNA提取各個過程中均可能發(fā)生降解，28S與18S的比值為衡量提取的RNA完整性的指標。我們選取28S/18S在1.8-2.0之間的RNA樣品，其完整性較好，基本無降解發(fā)生，送生物公司進行基因芯片檢測(見圖1)。

圖1 健康組和膿毒癥組血液樣品提取的總RNA凝膠電泳圖

注：N:正常對照組，S：膿毒癥組， M：Hela Cell Control RNA. 28S的亮度是18S的2倍。

三、差異性表達miRNA的散點圖

散點圖中 X軸和Y軸分別以熒光信號強度為坐標，X軸代表正常對照組(N)，Y軸代表膿毒癥組(S)。每個點代表芯片上一個探針集(基因)的熒光信號強度，紅色代表膿毒癥組/正常對照組發(fā)生上調(diào)的基因；綠色代表膿毒癥組/正常對照組發(fā)生下調(diào)的基因；黑色代表膿毒癥組/正常對照組表達基本無差異的基因(見圖2)。

四、miRNA 基因芯片數(shù)據(jù)聚類分析

為了確定膿毒癥患者和正常人血清 miRNA表達情況，將正常對照組和膿毒癥組外周血標品進行miRNA基因芯片檢測，并且將miRNA 芯片雜交結果的信號值進行標準化處理，進而得到標準化信號值，進行分層聚類分析，顯示兩組間 miRNA 的表達趨勢。共檢測出兩組間差異性表達的miRNA 有305個，其中上調(diào)的miRNA有129個，下調(diào)的miRNA有176個。下圖為根據(jù)歸一化處理的原始數(shù)據(jù)中重復性高且在膿毒癥組和正常對照組中具有顯著差異性表達的miRNA的聚類分析圖。

圖2 對照組和膿毒癥組外周血差異性表達miRNA的散點圖

注：紅色代表Ratio值≥2，綠色代表Ratio值≤0.5，黑色代表Ratio值在0.5-2之間

圖3 兩組間部分顯著差異表達的miRNA

注：紅色代表顯著上調(diào)的miRNA，綠色代表顯著下調(diào)的miRNA。

五、差異表達的miRNA 分析

基于上一步高質(zhì)量的miRNA 基因芯片數(shù)據(jù)，采用GeneSpring軟件對數(shù)據(jù)進行歸一化處理。常規(guī)篩選標準為:p ≤ 0.05同時FC (abs)在2.0倍以上。FC (abs)值差異倍數(shù)越大，說明兩個樣品之間的差異越大。部分差異性表達的miRNA(見表2)。

表3 部分差異性表達micro RNA列表

注：“up”指膿毒癥組高表達的miRNA；“down”指低表達的miRNA。P值是采用T-test unpair方法計算得到的；P(Corr)是采用Benjamini Hochberg FDR方法進行校正得到的；FC (abs)是兩組或兩個樣品的差異倍數(shù)，以2為底，Log FC的絕對值為冪得到的數(shù)值；Regulation是mRNA在膿毒癥組血液樣品和正常對照組血液樣品變化趨勢的描述。

討 論

全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)是發(fā)生于創(chuàng)傷、手術或感染后，導致機體失控，多種炎性介質(zhì)和效應細胞共同參與、自我級聯(lián)放大的炎癥因子和自我破壞的反應，當存在細菌感染或高度可疑感染病灶引起的SIRS稱為Sepsis，其發(fā)病過程通常被描述成兩個階段，早期為促炎因子和趨化因子的釋放，之后為抗炎因子和趨化因子的釋放，短期死亡率可高達70%。嚴重膿毒癥、多器官功能障礙綜合征(MODS)和膿毒癥休克是危重癥病人死亡的主要原因[1-3]。此外，大多數(shù)住院的膿毒癥患者死亡主要原因是因為早期不能夠得到有針對性的導向治療[4]。有研究表明：膿毒癥患者若在發(fā)病6小時內(nèi)得到有效靶向的治療可以明顯的降低死亡率，得不到恰當?shù)目股刂委熍c膿毒癥患者的死亡率密切相關[5]。所以，膿毒癥的早期診斷對于疾病的治療及預后尤為重要。但是由于膿毒癥患者癥狀、體征和實驗室檢查與患者的嚴重程度并不完全相符，導致膿毒癥早期診斷的困難[6]。目前對膿毒癥診斷的常見標志物包括降鈣素原(PCT)、高敏C反應蛋白(CRP)、乳酸、白細胞介素-6(IL-6)、不成熟的粒細胞(IG)等等，生物標志物目的是能夠在早期去診斷膿毒癥,以至于相應的措施也能盡快的實施[7],然而上述這些生物標記物不能顯示出高度的敏感性和特異性。所以，目前需要更加深入研究特異度和敏感度高的標志物來早期快速診斷膿毒癥，使膿毒癥患者盡早得到有效的治療，有利于患者改善預后，提高患者的生存質(zhì)量。

研究發(fā)現(xiàn)，在高溫或者低溫條件、PH的改變等環(huán)境變化的條件下，大部分RNA通常會降解，然而循環(huán)中的miRNA在這些條件變化的情況下通常是穩(wěn)定的。因此,血清或血漿中miRNA作為生物標記物具有良好的穩(wěn)定性、可重復性和組織特異性，能夠特異的診斷疾病，并在疾病早期診斷中具有廣泛的應用前景[8]。miRNA不能編碼蛋白質(zhì)，但是能通過抑制它們目標mRNA轉錄和翻譯來調(diào)節(jié)基因表達[9]。目前發(fā)現(xiàn)膿毒癥中miRNA的表達與健康人不同，但由于研究少，重復性低，至今未能找到可預測膿毒癥的miRNA?；蛐酒夹g是目前研究miRNA表達譜的主要方法。在超過100多個不同物種中目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過上萬個miRNAs,并且miRNA的數(shù)量仍在增加。對于數(shù)量這么多的miRNAs進行分析研究,需要具有高通量以及高效率的檢測手段。MiRNA基因芯片技術和傳統(tǒng)RNA分析方法相比較具有樣本需求量小，靈敏度和效率高并且可以高通量的聯(lián)合對上千個miRNA同時進行檢測[8-9]。本研究結果發(fā)現(xiàn)在膿毒癥組和正常對照組中差異性表達的miRNA共有305個，與正常對照組相比膿毒癥組中上調(diào)的miRNA有129個，下調(diào)的miRNA有176個，上調(diào)基因中FC (abs)值在10倍以上的共有5個，分別是：miRNA-6778-3p、miRNA-6514-3p、miRNA-3591-3p、miRNA-4446-5p和miRNA-34b-3p；下調(diào)基因中FC (abs)值在10倍以上的只有1 個是miRNA-625-5p，在FC (abs)值在5倍以上的有5個，分別是miRNA-6756-5p、miRNA-505-5p、miRNA-130b-3p、miRNA-1914-3p和miRNA-501-5p，以上均為本研究發(fā)現(xiàn)的顯著表達miRNA，目前尚無上述高表達miRNA與膿毒癥關系的報道。在人體中發(fā)現(xiàn)了超過1800個miRNA，預估計miRNA基因可能只占人類基因組的1%，但是控制所有蛋白編碼基因的60%[9]。近些年隨著對膿毒癥中標志性miRNA深入研究發(fā)現(xiàn)[10]： 膿毒血癥中常見的下調(diào)基因有：miRNA-150、miRNA-122和miRNA-193b；常見的上調(diào)基因有：miRNA-15a、miRNA-15b、miRNA-16、miRNA-133a、miRNA-342-3p、miRNA-3173-5p、miRNA-191、miRNA-223、miRNA-150、miRNA-4772和 miRNA-122，其中miRNA-150和miRNA-122在既往研究中既有上調(diào)也有下調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)miRNA差異表達譜中miRNA-150(FC 值為2.23，P值為0.213)為下降基因，而在我們的差異表達譜中并未找到miRNA-122。本研究結果發(fā)現(xiàn)上調(diào)的基因有：miRNA-16(FC值為1.01)和miRNA-223((FC值為1.91)；下調(diào)的基因有：miRNA-15a(FC值為1.19 )，miRNA-15b(FC值為1.18)和miRNA-191(FC值為2.22)，其余的miRNA均未在差異性表達的miRNA表達譜中找到，其中除了miRNA-15a和miRNA-15b與既往的研究不同以外，其余均相同。與上述研究結果不一致可能與本實驗樣本數(shù)及地域性差異有關。

目前，膿毒癥發(fā)病機制不清，缺乏有效治療方法，如果能早期鑒定出治療的靶點，對預后有重大意義。miRNA的研究不僅可以更新膿毒癥的發(fā)病機制，也為治療提供新的靶點。本研究能夠提示新型的生物學標志物及其在膿毒癥過程中的功能作用，對膿毒癥發(fā)病過程有新的進一步了解，并可能成為膿毒癥新的血清學預測因子。如果能夠開發(fā)出相應的預測軟件或方法，可能發(fā)現(xiàn)相對應的人類基因組相關功能基因及蛋白在膿毒癥發(fā)病中的意義。

目前對于膿毒血癥的早期診斷和及其預后評估目前還沒有突破性的進展，確定膿毒癥特征性的miRNA表達譜可能會為膿毒癥早期診斷及其治療提供新的依據(jù)。然而，基因芯片結果有一定局限性，得到的膿毒癥特征性miRNA表達譜可能存在假陽性的結果。因此，我們在之后將要進行qRT-PCR來進一步驗證我們的結果。

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GenechipstudyofrelevantmiRNAinsepsis

CHENYing,XUXI-yuan,GERILE，Wu-rina,YANGJing-ping

theThirdAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Baotou,InnerMongolia124010,China

ObjectiveTo detect and confirm the altered miRNA expression in sepsis by miRNA microarray.MethodsThe study selected 32 patients with sepsis from January 2015 to December 2015 as the sepsis group and 32 healthy people as the normal control group. The peripheral blood and general information were collected. The total RNA of blood samples were extracted. The quality of total RNA was determined.Total RNA samples were hybridizated with miRNA probe of human gene chip.Results305 miRNAs were detected to be significantly regulated between the sepsis group and the normal control group, 129 miRNAs were up-regulated and 176 miRNAs were down-regulated in the sepsis group. The top five up-regulated miRNAs included miRNA-6778-3p, miRNA-6514-3p, miRNA-3591-3p, miRNA-4446-5p and miRNA-34b-3p. MiRNA-625-5p was found to be more than tenfold alterations of down-regulated miRNAs. The top five down-regulated miRNAs included miRNA-6756-5p, miRNA-505-5p, miRNA-130b-3p, miRNA-1914-3p and miRNA-501-5p.ConclusionThrough the analysis of miRNA microarray, 305 miRNAs are found to be expressed abnormally in patients with sepsis, 18 of which show significant differences.

sepsis; gene chip; microRNA

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.010.016

1.014010 內(nèi)蒙古 包頭，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院 2.124010 遼寧 盤錦，盤錦市中心醫(yī)院 陳影，楊敬平并列第一作者

徐喜媛，E-mail:xuxiyuan9@sina.com

2017-06-27]