張建峰 劉濤 曹波 李明強(qiáng) 吳樹寧 周立文 葉習(xí)紅

右美托咪定通過調(diào)控HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路抗膿毒癥大鼠肺損傷的實(shí)驗(yàn)研究

張建峰 劉濤 曹波 李明強(qiáng) 吳樹寧 周立文 葉習(xí)紅

目的探討右美托咪定對(duì)膿毒癥致肺損傷大鼠HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用。方法選取30只Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(假手術(shù))、模型組(盲腸結(jié)扎穿孔)、右美托咪定組(盲腸結(jié)扎穿孔+右美托咪定處理)，每組10只。右美托咪定組于術(shù)前30min腹腔注射40μg/kg 右美托咪定，對(duì)照組和模型組腹腔注射生理鹽水。造模后24h處死大鼠。蘇木精-伊紅染色法評(píng)估肺組織病理學(xué)變化；ELISA法檢測肺組織髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性；計(jì)算肺組織濕干重比(W/D)；western blot法檢測肺組織中HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組相比較，模型組大鼠肺組織MPO、肺損傷評(píng)分及肺組織W/D顯著增高(P<0.05)；與模型組相比較，右美托咪定組大鼠肺組織MPO、肺損傷評(píng)分及肺組織W/D顯著降低(P<0.05)，但仍高于對(duì)照組(P<0.05)。與對(duì)照組相比較，模型組大鼠肺組織HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著增高(P<0.05)；與模型組相比較，右美托咪定組大鼠肺組織HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，但仍高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論右美托咪定可能通過抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路，減輕炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮對(duì)膿毒癥肺損傷的保護(hù)作用。

右美托咪定；膿毒癥；肺損傷；HMGB1；TLR4

膿毒癥是指由感染誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)綜合征，常伴有多臟器功能障礙[1]。在膿毒癥并發(fā)的多器官損傷中，肺損傷出現(xiàn)最早，也最為常見，是導(dǎo)致膿毒癥患者預(yù)后不良的主要因素[2]。右美托咪定屬于高效α2腎上腺素能受體激動(dòng)劑。既往研究證實(shí)，右美托咪定可通過抑制機(jī)體炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，發(fā)揮對(duì)膿毒癥肺損傷的保護(hù)作用，但其分子機(jī)制尚未明確[3]。肺損傷的發(fā)生發(fā)展與高遷移率族蛋白B1(high-modility groupbox 1, HMGB1)活化密切相關(guān)，后者可通過激活下游Toll樣受體4(Toll like receptor 4, TLR4)/核因子κB(nuclear factor kappaB, NF-κB)信號(hào)通路致炎癥介質(zhì)過度釋放，進(jìn)而導(dǎo)致組織損傷[4]。右美托咪定是否通過HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路抑制膿毒癥所致的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而抗膿毒癥肺損傷尚未可知。本研究擬采用盲腸結(jié)扎穿孔法誘導(dǎo)的膿毒癥大鼠為模型，探討右美托咪定對(duì)膿毒癥肺損傷的保護(hù)作用，并分析右美托咪定對(duì)HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用，揭示右美托咪定抗膿毒癥肺損傷的分子機(jī)制，以期為膿毒癥肺損傷的臨床防治提供新思路。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

SPF級(jí)Wistar大鼠，雄性，15周齡，200-250g，共30只，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒購于南京建成生物有限公司；HMGB1、TLR4、NF-κB抗體購于大連Santa cruz公司；髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)，酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)試劑盒購于武漢博士德生物有限公司。

二、模型建立與分組處理

所有大鼠應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組及右美托咪定組，每組10例。模型組及右美托咪定組大鼠采用盲腸結(jié)扎穿孔法建立膿毒癥模型：術(shù)前禁食12h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，沿腹正中線做1cm長切口，游離盲腸及腸系膜，用4-0絲線對(duì)盲腸進(jìn)行環(huán)形結(jié)扎，在盲腸結(jié)扎端用18號(hào)針頭進(jìn)行貫通穿刺，之后還納腸段，常規(guī)縫合腹膜、皮膚。對(duì)照組僅常規(guī)開腹。右美托咪定組于術(shù)前30min給予腹腔注射40μg/kg 右美托咪定，模型組和對(duì)照組于相同時(shí)間點(diǎn)注射等量生理鹽水。

三、標(biāo)本取材

造模后24h處死大鼠，之后沿胸骨正中線剪開胸骨，暴露肺臟，結(jié)扎并剪取右側(cè)肺臟，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

四、肺組織病理學(xué)觀察

4%多聚甲醛固定肺組織24h，然后常規(guī)行組織石蠟包埋、切片及蘇木精-伊紅染色。光鏡下依據(jù)肺泡內(nèi)細(xì)胞浸潤、肺泡出血、肺泡間隔水腫及肺泡內(nèi)纖維蛋白沉積4個(gè)方面情況進(jìn)行肺損傷病理學(xué)評(píng)價(jià)，每只大鼠取4張切片，每張切片觀察6個(gè)不同視野，分別記錄病理學(xué)評(píng)分，最后取平均值。

五、髓過氧化物酶(MPO)活性

準(zhǔn)確稱取肺組織，用0℃生理鹽水制備5%肺組織勻漿，肺組織勻漿37℃水浴15min，按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，測量樣本490nm處OD值，根據(jù)OD值換算MPO活性。

六、肺組織濕干重比(W/D)測定

取出大鼠右肺后，立即用濾紙拭干肺組織表面水分、血液，用天平所稱得其質(zhì)量為濕重，之后將肺組織放入80℃烤箱烘烤48 h，再次用天平所稱得其質(zhì)量為干重，計(jì)算濕干重比(W/D)。

七、HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白測定

采用western blot法檢測肺組織中HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)。將肺組織、裂解液混合物置于勻漿器中，充分研磨后得到組織勻漿，冰上裂解30min后，離心10min，收集上清，BCA蛋白定量試劑盒檢測樣品蛋白濃度，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育，加入一抗(HMGB1、TLR4、NF-κB、β-actin)(1:2000)，4℃孵育過夜，TBS緩沖液洗滌3次，加入相應(yīng)二抗(1:500)，室溫孵育2h，常規(guī)顯影，并進(jìn)行定量分析。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、肺組織損傷程度

對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，無炎性細(xì)胞滲出；模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔內(nèi)可見大量炎性細(xì)胞滲出，肺間質(zhì)彌漫性出血；右美托咪定組大鼠肺組織炎癥細(xì)胞滲出及出血程度較模型組明顯減輕(見圖1)。

圖1 三組大鼠肺組織病理切片(蘇木精-伊紅染色，×100)

二、肺損傷指標(biāo)

與對(duì)照組相比較，模型組大鼠肺組織MPO、肺損傷評(píng)分及肺組織W/D顯著增高(P<0.05)；與模型組相比較，右美托咪定組大鼠肺組織MPO、肺損傷評(píng)分及肺組織W/D顯著降低(P<0.05)，但仍高于對(duì)照組，P<0.05，(見表1)。

表1 三組大鼠各項(xiàng)肺損傷指標(biāo)比較

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

三、肺組織HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)

與對(duì)照組相比較，模型組大鼠肺組織HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著增高(P<0.05)；與模型組相比較，右美托咪定組大鼠肺組織HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，但仍高于對(duì)照組，P<0.05，(見表2、圖2)。

圖2 三組大鼠肺組織HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)

表2 三組大鼠肺組織HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

討 論

膿毒癥常并發(fā)多器官功能障礙綜合征(Mutiple organ disfunction syndrome, MODS)，而肺臟則往往是受累的首位靶器官[5]。在膿毒癥病程早期就可出現(xiàn)急性肺損傷，之后隨著病情進(jìn)展，肺纖維化程度日益加重，最終導(dǎo)致呼吸衰竭、死亡[6-7]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，膿毒癥危重患者肺損傷發(fā)生率為70%，死亡率為40%，已成為致膿毒癥患者死亡的首位原因[8]。因此，防治膿毒癥肺損傷是改善臨床預(yù)后的關(guān)鍵。

膿毒癥所致肺損傷與HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活密切相關(guān)。正常生理狀態(tài)下， HMGB1存在于核內(nèi)，穩(wěn)定核染色體和調(diào)控蛋白轉(zhuǎn)錄、翻譯[9]；但膿毒癥時(shí)，在早期炎癥介質(zhì)和內(nèi)毒素的刺激下，單核/巨噬細(xì)胞通過出胞作用將HMGB1大量釋放到胞外，之后HMGB1與其內(nèi)源性配體TLR4在胞外結(jié)合，激活MyD88依賴性途徑，使NF-κB結(jié)構(gòu)中的IκB磷酸化，實(shí)現(xiàn)NF-κB活化，實(shí)現(xiàn)HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活，從而誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)等炎癥介質(zhì)大量分泌，導(dǎo)致毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞損傷，造成肺組織結(jié)構(gòu)和功能破壞[4]。此外，IL-6、TNF-α等促炎因子又可反過來促進(jìn)HMGB1分泌，正反饋瀑布式擴(kuò)大炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步加劇肺組織損傷[10]。本研究結(jié)果顯示，盲腸結(jié)扎術(shù)后模型組大鼠肺組織MPO、肺損傷評(píng)分及肺組織W/D顯著增高(P<0.05)，提示盲腸結(jié)扎誘發(fā)了大鼠肺組織炎性反應(yīng)，導(dǎo)致急性肺損傷；以此同時(shí)，模型組肺組織HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)顯著增高(P<0.05)，HMGB1、TLR4及NF-κB表達(dá)與肺組織損傷程度存在某種正相關(guān)性，提示HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活在膿毒癥肺損傷中發(fā)揮重要作用。

右美托咪定屬于新型α2腎上腺素能受體(α2-AR)激動(dòng)劑，其可通過與α1及α2腎上腺素能受體選擇性結(jié)合，發(fā)揮抑制交感神經(jīng)及刺激迷走神經(jīng)的雙重作用，并兼具鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛及抗炎等功效[11]。動(dòng)物研究證實(shí)，右美托咪定具有多器官保護(hù)作用，而其抗膿毒癥肺損傷作用，可能與抑制HMGB1、IL-6等炎癥介質(zhì)分泌有關(guān)，但其分子機(jī)制尚未完全明確[3，12-13]。本研究結(jié)果顯示，采用右美托咪定進(jìn)行預(yù)處理，膿毒癥大鼠肺組織HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)顯著減少，同時(shí)肺組織結(jié)構(gòu)和功能得到明顯改善，提示右美托咪定可能是通過激活HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路抗膿毒癥肺損傷。

綜上所述，右美托咪定可抑制膿毒癥所致的HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活，減輕炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮對(duì)膿毒癥肺損傷的保護(hù)作用。但右美托咪定是否還可通過調(diào)控其他信號(hào)通路影響膿毒癥致肺損傷，仍有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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Studyofdexmedetomidineagainstratsepsis-inducedlunginjurybyregulatingHMGB1/TLR4/NF-κBsignalingpath

ZHANGJian-feng,LIUTao,CAOBo,LIMing-qiang,WUShu-ning,ZHOULi-wen,YEXi-hong

XiangyangCentralHospital,Xiangyang,Hubei441021,China

ObjectiveTo evaluate the effect of dexmedetomidine against rat sepsis-induced lung injury by regulating HMGB1/TLR4/NF-κB signaling pathway.Methods30 Wistar rats were randomly divided into the control group (sham-operation), the model group (cecal ligation and puncture) and the dexmedetomidine group (cecal ligation and puncture+dexmedetomidine treatment), 10 rats in each group. 30min before operation, the dexmedetomidine group was intraperitoneal?injected with 40μg/kg dexmedetomidine, and the control group and model group were intraperitoneal?injected with normal saline. 24 hours after modeling, pulmonary pathological changes were detected by hematoxylin-eosin staining. The myeloperoxidase (MPO) activity of lung tissue were detected by ELISA method. The wet and dry weight ratio (W/D) of lung tissue was detected. The protein expression of HMGB1, TLR4 and NF-κB in lung tissue were detected by Western blot.ResultsCompared with the control group, the MPO, lung injury score and lung tissue W/D increased significantly in the model group (P<0.05). Compared with the model group, the MPO, lung injury score and lung tissue W/D decreased obviously in the dexmedetomidine group (P<0.05), but they were still higher than those in the control group. Compared with the control group, the MPO, protein expression of HMGB1, TLR4 and NF-κB increased significantly in the model group (P<0.05). Compared with the model group, the protein expression of HMGB1, TLR4 and NF-κB of the dexmedetomidine group significantly decreased (P<0.05), but still higher than those in the control group.ConclusionDexmedetomidine can inhibit HMGB1/TLR4/NF-κB signaling pathways, reduce inflammation, playing a role of protection for sepsis-induce lung injury.

dexmedetomidine; sepsis; lung injury; HMGB1; TLR4

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.010.005

湖北省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No 2014CFC1076)

441021 湖北 襄陽，襄陽市中心醫(yī)院麻醉科，湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科

劉濤，E-mail:liutao558558@163.com

2017-02-28]