張龍，袁青，鄭雅萍

（浙江省金華市中心醫(yī)院 檢驗科，浙江 金華 321000）

不同分子生物學(xué)方法在手足口病標(biāo)本檢測中的應(yīng)用

張龍，袁青，鄭雅萍

（浙江省金華市中心醫(yī)院 檢驗科，浙江 金華 321000）

目的探究分析不同分子生物學(xué)方法在手足口病標(biāo)本檢測中的應(yīng)用效果。方法隨機選取我院2014年1月至2016年1月收集的120份手足口病標(biāo)本為研究對象，分別根據(jù)不同分子生物法，將其分為實時RTPCRZ組﹑一步法RT-PCRZ組﹑巢式PCR組進行檢測，比較分析三種方法檢測腸道71型（EV71）敏感性。結(jié)果實時RT-PCR法與巢式PCR手足口病檢測率明顯高于與一步法RT-PCR法（P＜0.05）。結(jié)論RT-PCR法與巢式PCR法在手足口病檢測方面的檢測準(zhǔn)確性較高，值得臨床應(yīng)用。

手足口??；PCR；一步法；陽性率

0 引言

手足口病（HFMD）是臨床診療中較為常見的小兒傳染性疾病，主要發(fā)病人群是5歲以下兒童，其病原體主要為科薩奇病毒A組16型，及腸道病毒71型[1]。目前，臨床上呢尚未出現(xiàn)有效針對治療藥物，因此，早期診斷手足口病是提高治療效果的關(guān)鍵[2-3]。隨著生物醫(yī)療研究發(fā)展的不斷深入，不同分子生物學(xué)方法在臨床上的應(yīng)用也更加普遍。鑒于此，本研究在手足口病標(biāo)本檢測中采用分子生物學(xué)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究所選120例研究標(biāo)本均來自于我院住院患兒，所有患兒入院時間為2014年1月至2016年1月。所有患兒均經(jīng)臨床診斷確診，符合手足口病診斷標(biāo)準(zhǔn)，具有發(fā)熱﹑口腔潰瘍﹑皮疹等臨床癥狀表現(xiàn)，并伴有不同程度中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[4]。120例患兒中30例需要住院，70例屬于病情較輕的患兒，20例患兒病情較重，男女患者分別65例﹑55例，年齡8個月至5歲，平均年齡為（3.1±1.5）歲。所有患兒所采集標(biāo)本均采用不同生物分子方法進行檢測。

1.2 檢測方法

所有手足口病標(biāo)本均取自120例患兒，標(biāo)本采集過程中嚴(yán)格遵循無菌操作，將收集到的患兒糞便放置在無菌密封的大便盒中。采用醫(yī)用棉簽在患兒扁桃體及咽后壁擦拭，收集咽喉部位的樣本，并將所用棉簽放在3mL Hank采樣管中保存，為了確保標(biāo)本的完好保存，將所得標(biāo)本放置在-80℃冰箱內(nèi)進行保存待用。然后，分別用實時RT-PCRZ法﹑一步法RT-PCRZ﹑巢式PCR法檢測所有標(biāo)本。PCR擴增儀及試劑盒均購自Promega公司，將溫度調(diào)至45℃并進行逆轉(zhuǎn)錄處理45min，然后將溫度控制在94℃，實施預(yù)變性處理2min，經(jīng)20s變性處理后，退火處理應(yīng)控制在45℃條件下，延伸溫度71℃條件下，時間為30s，共進行36個循環(huán)。最后，分析三組檢測結(jié)果。

表1 手足口病陽性結(jié)果（n，%）

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件，P＜0.05表示數(shù)據(jù)有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

在實時RT-PCR組，重死患兒﹑輕癥患兒以及住院患兒標(biāo)本陽性率檢測結(jié)果分別為80%﹑22.9%﹑80%。在一步法RT-PCR組中，重死患兒﹑輕癥患兒以及住院患兒標(biāo)本陽性率檢測結(jié)果分別為45%﹑8.6%﹑16.7%。在巢式PCR組中，重死患兒﹑輕癥患兒以及住院患兒標(biāo)本陽性率檢測結(jié)果分別為85%﹑25.7%﹑86.7%。各組檢測陽性率比較具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

3 討論

手足口病在兒童醫(yī)療診治中具有較高的發(fā)病率，是臨床醫(yī)療診治中較為常見的出疹性疾病，以人腸道病毒屬﹑微小核糖核酸病毒等病原為主，臨床發(fā)病率較高[5-7]。由于患兒體制較弱，各項免疫系統(tǒng)發(fā)展還不完善，一旦出現(xiàn)手足口病，將在一定程度上影響患兒健康成長，需要早發(fā)現(xiàn)早治療。因此，臨床檢測手足口病標(biāo)本病原體可以臨床病例治療中提供相關(guān)指導(dǎo)價值。陳競[8]等人通過對逆轉(zhuǎn)錄（RT）-聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）以及巢式PCR進行檢測結(jié)果比較，結(jié)果顯示，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)對兩種病毒的檢測分別是EV71為79例（38.9%），CAV16為 48例（23.6%）;巢 式 PCR監(jiān)測方法是EV71為145例（71.5%），CAV16為59例（29.1%）說明巢式PCR在CAV16及EV71檢測中的應(yīng)用價值更高，其靈敏度也相對較高。其中，實時RT-PCR需要在規(guī)定的時間內(nèi)完成，病原體陽性分析結(jié)果在合理的時間內(nèi)結(jié)果較為準(zhǔn)確[9]。一步法RT-PCR指的是在逆轉(zhuǎn)錄條件下，實施DNA擴增，并進行臨床分析[10]。巢式 PCR法需要與模板結(jié)合制作引物，并在引物的作用下完成擴增，進而實施病原體分析[11-12]。在本次研究中，實時RT-PCR檢測陽性率與一步法RTPCR﹑巢式PCR比較存在一定差異，前者檢測效果更為靈敏，檢測結(jié)果與以往研究報告[5]一致。

綜上所述，相對于一步法RT-PCR﹑巢式PCR，實時RT-PCR操作簡便，且在手足口病標(biāo)本檢測中的準(zhǔn)確率較高，因此，可將實時RTPCR﹑巢式PCR作為小兒手足口病檢測中的重要方式，值得深入探究。

[1] 關(guān)桂英,王風(fēng)朝.不同分子生物學(xué)方法檢測手足口病標(biāo)本的應(yīng)用分析[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2014,20(22):133-134.

[2] 黃薇,孟建彤,楊才彬,等.手足口病重癥死亡1例病原分子生物學(xué)分析[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)情報雜志,2012,28(1):15-19.

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Application of Different Molecular Biological Methods in Detection of Hand,Foot and Mouth Disease

ZHANG Long, YUAN Qing, ZHENG Ya-ping
(Department of Clinical Laboratory, Jinhua City Central Hospital of Zhejiang, Jinhua, Zhejiang, 321000)

ObjectiveTo investigate and analyze application effect of different molecular biological methods in detection of hand, foot and mouth disease.MethodsChoose 120 cases HFMD collected in our hospital from January 2014 to January 2016 randomly as research objects, according to different molecular biological methods, divide them into real-time RTPCRZ group, on step method RT-PCRZ group, nested PCR group respectively for detection, compare and analyze sensitivity detecting enterovirus 71 type (EV71) of three methods.ResultsHFMD detection rate of real-time RT-PCR and nested PCR was significantly higher than one-step RT-PCR method (P＜0.05).ConclusionRT-PCR and nested PCR method has higher accuracy in detecting HFMD disease, which is worthy of clinical promotion and application.

Hand foot mouth disease; PCR; One step method; Positive rate

10.19335/j.cnki.2096-1219.2017.12.038