艾光麗，王維，曾楨，蒲旭峰

·炮制制劑·

HPLC梯度洗脫法同時(shí)測(cè)定銀黃軟膠囊中綠原酸和黃芩苷的含量

艾光麗1，王維1，曾楨2，蒲旭峰2

目的：建立銀黃軟膠囊中綠原酸和黃芩苷含量同時(shí)測(cè)定的高效液相色譜法。方法：采用Symmetry-C18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，乙腈-0.4%磷酸水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)319 nm，柱溫35℃，流速1.0 mL．min-1,進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果：綠原酸在范圍1.67 μg．mL-1～16.7 μg．mL-1內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均回收率為99%，RSD為2.1%（n=6）；黃芩苷在范圍3.32 μg．mL-1～33.2 μg．mL-1內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均回收率為97%，RSD為1.1%(n=6)。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)所建立的色譜分析方法能夠簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確地測(cè)定銀黃軟膠囊中黃芩苷和綠原酸的含量。不同廠家的銀黃軟膠囊中綠原酸和黃芩苷含有量具有顯著差異,建立黃芩苷和綠原酸的定量控制方法具有重要意義。

銀黃軟膠囊；高效液相色譜法；綠原酸；黃芩苷；梯度洗脫

銀黃軟膠囊收載于國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)[1]，由金銀花提取物和黃芩提取物兩種物質(zhì)加工而成，具有清熱疏風(fēng)、利咽解毒的功效。銀黃制劑中含有多種有效成分，但指標(biāo)成分分別為金銀花提取物中的綠原酸和黃芩提取物中的黃芩苷；不同銀黃制劑的含量測(cè)定均是以指標(biāo)成分綠原酸和黃芩苷的含量為標(biāo)準(zhǔn)，文獻(xiàn)中多采用HPLC法、毛細(xì)管電泳法、UV法等分別或同時(shí)測(cè)定銀黃制劑中綠原酸和黃芩苷的含量[2-14]。目前，對(duì)銀黃軟膠囊制劑中的有效成分同時(shí)進(jìn)行測(cè)定的研究較少，為更好地控制該產(chǎn)品的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC梯度洗脫法，在同一波長(zhǎng)下同時(shí)測(cè)定銀黃軟膠囊中綠原酸和黃芩苷的含量，同時(shí)研究了提取銀黃軟膠囊中綠原酸和黃芩苷成分的相關(guān)條件。并利用建立的分析方法對(duì)不同廠家銀黃軟膠囊中指標(biāo)成分的含量進(jìn)行了比較，更有利于控制銀黃軟膠囊的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

儀器：Agilent 1200高效液相色譜儀，Agilent1200DAD二極管陣列檢測(cè)器，AUX220電子天平（日本島津），AE240電子天平（梅特勒-托利多，上海），SK25OH型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

對(duì)照品：綠原酸（110715-201016，96.2%，供含量測(cè)定用），黃芩苷（110753-201415，94%，供含量測(cè)定用），均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

試劑：乙腈、甲醇為色譜純（北京百靈威科技有限公司），水為超純水，其余試劑均為分析純。

藥品：銀黃軟膠囊（貴州世仁堂制藥有限公司，批號(hào)：151107；石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司，批號(hào)：359160115、359160113；桂林集琦藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20151002、20150704）。

2 方法學(xué)考察

2.1 色譜條件

色譜柱：Symmetry-C18柱( 4.6 mm×250 mm,5μm); 以0.4%磷酸水溶液為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，梯度洗脫，0～30 min，5%→40%B, 30～40 min，40%→80% B; 檢測(cè)波長(zhǎng)319 nm; 柱溫35℃; 流速1.0 mL． min-1; 進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷和綠原酸對(duì)照品適量，制成重量濃度分別為33.2 μg．mL-1黃芩苷，16.7 μg．mL-1綠原酸的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取裝量差異下的銀黃軟膠囊約0.3 g，研勻，精密稱定，置25 mL棕色容量瓶中，加入適量70%甲醇水溶液，超聲處理30 min，冷卻至室溫，加70%甲醇溶液至刻度線，搖勻，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取按銀黃軟膠囊工藝方法制備的缺黃芩提取物、缺金銀花提取物的陰性對(duì)照樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 線性關(guān)系的考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液0.5、2、4、6、8、10 mL，分別放于10 mL的棕色容量瓶中，加70%甲醇水溶液至刻度線。精密吸取系列對(duì)照液各10 μL，注入液相色譜儀，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）,峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，綠原酸和黃芩苷的回歸方程分別為Y=21.102X+0.4024(r=1),Y=15.784X +0.5212 (r=1)。結(jié)果表明綠原酸在8.35 μg．mL-1～167μg．mL-1，黃芩苷在16.6 μg．mL-1～332 μg．mL-1內(nèi)峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.4 專屬性試驗(yàn)

按上述色譜條件分別將對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液和供試品溶液注入液相色譜儀中，記錄色譜圖（見(jiàn)圖1）。試驗(yàn)結(jié)果表明各陰性樣品溶液的色譜圖中，在綠原酸及黃芩苷相應(yīng)的位置無(wú)干擾，表明該法專屬性良好。

圖1 銀黃制劑HPLC圖

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次并測(cè)定黃芩苷和綠原酸峰面積，黃芩苷RSD為0.4%，綠原酸RSD為0.3%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批供試品（151107），按正文含量測(cè)定項(xiàng)方法制備供試品溶液，分別于0,4,8,12,16,24 h測(cè)定黃芩苷和綠原酸峰面積，結(jié)果黃芩苷RSD為0.6%，綠原酸RSD為1.5%，表明供試品溶液中的綠原酸和黃芩苷成分在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批供試品（151107），研細(xì)，取0.3 g，按“正文含量測(cè)定方法平行測(cè)定6份，黃芩苷和綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)RSD分別為1.6%、2.0%，試驗(yàn)結(jié)果表明本法的精密度良好。

2.8 范圍試驗(yàn)

取同一批供試品（151107）6份，其中3份取0.15 g，另3份取0.6 g，精密稱定，按正文含量測(cè)定項(xiàng)下方法制備供試品溶液并進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果綠原酸和黃芩苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)RSD分別為1.78%、1.86%，表明供試品在限度的50%～200%之間，可滿足含量測(cè)定需要。

2.9 回收率試驗(yàn)

取已知含量（151107）的同一批樣品6份，每份0.01 g,精密稱定，分別加入相同量的綠原酸、黃芩苷對(duì)照品，按正文含量測(cè)定項(xiàng)下方法處理并進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。綠原酸平均回收率為99%，RSD為2.1%；黃芩苷平均回收率為97%，RSD為1.1%。表明該方法準(zhǔn)確可靠。

表1 綠原酸和黃芩苷回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.10 樣品測(cè)定

按正文擬定的含量測(cè)定方法對(duì)5批銀黃軟膠囊中黃芩苷和綠原酸含量進(jìn)行測(cè)定，每批平行測(cè)定2次，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=2)

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

綠原酸的最強(qiáng)吸收波長(zhǎng)是319 nm ,而黃芩苷在280 nm處有最強(qiáng)吸收， 319 nm有強(qiáng)吸收。銀黃制劑中綠原酸含量比黃芩苷低,在同一波長(zhǎng)下同時(shí)測(cè)定黃芩苷和綠原酸,應(yīng)選擇含量相對(duì)低的綠原酸的最大吸收波長(zhǎng)319 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng),從而減小誤差，不僅能夠提高綠原酸檢測(cè)的靈敏度,而且對(duì)黃芩苷的檢測(cè)也沒(méi)有明顯的影響。

3.2 提取條件的考察

提取方法有回流法、冷浸法、超聲法等，試驗(yàn)證明，回流法提取率比超聲法低，而冷浸法時(shí)間長(zhǎng)，不利于試驗(yàn)的進(jìn)行，超聲是最佳的提取方法。超聲時(shí)間對(duì)綠原酸無(wú)明顯影響，對(duì)黃芩苷的影響較大， 30 min綠原酸和黃芩苷都能達(dá)到最大提取量。綠原酸成分易溶于甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑，而黃芩苷成分較難溶于甲醇、乙醇，因此筆者選擇了水和醇的混合水溶液作為提取溶劑， 70%甲醇水溶液對(duì)綠原酸和黃芩苷的提取率最大。同時(shí)比較了用70%甲醇水溶液25 mL、50 mL、100 mL為提取溶劑進(jìn)行測(cè)定，不同溶劑量對(duì)含量測(cè)定結(jié)果影響較小，故選擇25 mL進(jìn)行提取。

3.3 流動(dòng)相的考察

流動(dòng)相應(yīng)有較好的分離度，且綠原酸、黃芩苷的保留時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。等度洗脫保留時(shí)間短，但綠原酸的色譜峰分離效果不好；而梯度洗脫保留時(shí)間適宜，且綠原酸的色譜峰分離效果好。同時(shí)考察了甲醇-磷酸水溶液、甲醇-水、乙腈-磷酸水溶液、乙腈-水等體系，結(jié)果乙腈-磷酸水溶液的峰形好，分離效果較好，基線平穩(wěn)，干擾少。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)表明，磷酸加入量對(duì)拖尾情況影響較小，根據(jù)銀黃系列制劑的標(biāo)準(zhǔn)[1,15,16,17]，選擇0.4%的磷酸水溶液，可得到較好的色譜峰形。

3.4 結(jié)果分析

銀黃軟膠囊為中藥復(fù)方制劑, 所含成分較為復(fù)雜,本文運(yùn)用HPLC法同時(shí)測(cè)定銀黃軟膠囊中綠原酸和黃芩苷的含量, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、靈敏度高, 可用于該制劑的質(zhì)量控制。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了3個(gè)不同廠家、不同批次的銀黃軟膠囊制劑,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 不同廠家生產(chǎn)的制劑中綠原酸和黃芩苷的含有量相差較大, 同一廠家不同批次內(nèi)所含綠原酸和黃芩苷也存在差異, 但各廠家藥品的服用量是相同的, 這可能會(huì)影響該制劑的臨床療效, 故產(chǎn)生的副作用緩急有無(wú)也不同。因此, 有必要對(duì)銀黃軟膠囊制劑中綠原酸和黃芩苷含量進(jìn)行限定。

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（ 責(zé)任編輯：胡慧玲）

Simultaneous determination of chlorogenic acid and baicalin in Yinhuang soft capsule by HPLC with gradient elution/

AI Guang-li1, WANG Wei1, ZENG Zhen2, PU Xu-feng2//1.(Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137.Sichuan; 2.Chengdu Center for Food and drug Control, Chengdu 610000,Sichuan)

Objective: To establish a method for the simultaneous determination of chlorogenic acid and baicalin in Yinhuang soft capsule.Method:The chromatographic separations were obtained on a Symmetry-C18column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm). The mobile phase was consisted of acetonitrile and 0. 4% phosphoric acid solution in a gradient elution manner with a fl ow rate of 1. 0 mL．min-1at 35℃．The detection wavelength was set at 319 nm．Sample volume was 10 μL.Result:Linear range of chlorogenic acid was 1.67～16.7 μg．mL-1and that of baicalin was 3.32 ～33.2 μg．mL-1. The recovery of chlorogenic acid and baicalin was 99.0% (RSD=2.1%) and 97% (RSD=1.1%), respectively.Conclusion:The chromatographic method established can be used simply and accurately to detect the content of chlorogenic acid and baicalin in Yinhuang soft capsule. The contents of chlorogenic acid and baicalin are different in different manufacturer productions, and it is necessary to establish the quantitative control of chlorogenic acid and baicalin.

Yinhuang soft capsule; HPLC; chlorogenic acid; baicalin; gradient elution

R 283.6

A

] 1674-926X(2017)02-011-03

2015年成都市食品安全風(fēng)險(xiǎn)研究項(xiàng)目；金銀花提取物的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)研究（2015cdfx01）

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137；2.成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院， 四川 成都 610000

艾光麗（1989-），女，在讀碩士研究生，主要從事的研究方向：中藥新制劑、新劑型、新技術(shù)Tel:15828578362 Email:1063681279@qq.com

蒲旭峰，博士研究生，研究員，研究方向: 中藥新制劑、新劑型、新技術(shù) Email: pxf68@263.net

2016-06-01