閆 偉，石鳳翎，錢亞斯

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019)

內(nèi)蒙古西部地區(qū)12份苜蓿根瘤菌株的16SrDNA鑒定

閆 偉，石鳳翎*，錢亞斯

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019)

在內(nèi)蒙古西部的4個(gè)地區(qū)(呼和浩特市，沙爾沁，海流圖，達(dá)拉特旗)，從9份豆科牧草材料(7份苜蓿屬材料，2份草木樨屬材料)上采集分離得到12份苜蓿根瘤菌株。通過16SrDNA鑒定，確定從草原3號(hào)雜花苜蓿(達(dá)拉特旗)和新疆大葉紫花苜蓿(海流圖)上分離的2份菌株為固氮根瘤菌屬(Rhizobium)，而另外10份菌株均為苜蓿中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)；采集于同一地點(diǎn)不同植物材料上的菌株大多數(shù)表現(xiàn)為親緣關(guān)系較近。

苜蓿；根瘤菌；16SrDNA

Abstract：12 Alfalfa Rhizobia Strains isolated from 9 legume forage material(7 Medicago material, 2 parts of the Melilotussuaveolens material) in the four western regions of Inner Mongolia (Hohhot, Shaerqin, Hailiutu, Dalad Banner).Two strains isolated from the M.variaMartin.cv.Caoyuan No3. (Dalad Banner) and M.sativa L. cv. Xinjiangdaye (Hailiutu) were identified by 16SrDNA identification as Rhizobium, while the other 10 strains were Sinorhizobium；The strains showed close relationship which isolated from different materials but the same regions.

Keywords:Alfalfa; Rhizobia; 16SrDNA

在苜蓿栽培生產(chǎn)中，特別是在新開墾的土地和未種植過豆科作物的土地上種植苜蓿時(shí)，接種根瘤菌可顯著提高苜蓿成苗率和固氮能力。因此，接種根瘤菌是苜蓿栽培中的重要技術(shù)措施〔1〕。但目前利用根瘤菌劑接種仍存在一些問題，如這些菌劑在土壤中的生存競(jìng)爭(zhēng)性能不如土著根瘤菌，菌劑施用的廣譜性能不佳，同時(shí)又由于各菌劑對(duì)特定豆科植物具有專一性，同一菌劑的施用還會(huì)因地域和環(huán)境不同而產(chǎn)生一定的差異〔2〕。為了獲得根瘤菌劑最佳的接種增產(chǎn)效果，需針對(duì)種植環(huán)境及寄主植物選擇最佳匹配的根瘤菌〔3-4〕。因此，為獲得適宜內(nèi)蒙古西部地區(qū)不同土壤條件下接種的苜蓿根瘤菌菌株，需要對(duì)相關(guān)牧草根際微生物進(jìn)行分離和鑒定，為進(jìn)一步的接種和匹配試驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)對(duì)內(nèi)蒙古西部地區(qū)不同土壤條件下苜蓿屬和草木樨屬的牧草材料根瘤菌進(jìn)行了采集，通過分離、培養(yǎng)、鑒定，以明確不同材料及不同土壤條件下的根瘤菌種類。

1 材料與方法

1.1根瘤菌采集地的地理位置

12份菌株采集于內(nèi)蒙古西部的4個(gè)地點(diǎn)，分別為內(nèi)蒙古自治區(qū)土默特左旗沙爾沁基地(N40°34′54″，E111°46′54″，海拔1 050m)、土默特左旗海流基地(N40°31′17″,E111°23′46″，海拔1 008m)、呼和浩特市內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)新校區(qū)(N40°41′30″，E111°22′30″，海拔1 055m)達(dá)拉特旗關(guān)碾房(N40°19′7″，E109°59′52″，海拔1 030m)。

1.2采集地土壤養(yǎng)分狀況

各采集地地勢(shì)平坦，土壤主要養(yǎng)分含量見表1。

表1 4個(gè)采集地點(diǎn)土壤養(yǎng)分含量

1.3供試菌株植物材料

12份根瘤菌菌株采集地和植物材料詳見表2。

表2 供試菌株

按上述組分配制好反應(yīng)液，分裝于PCR管中，加入模板DNA混勻后進(jìn)行PCR反應(yīng)。

PCR反應(yīng)條件：

4℃保藏

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠，100V、40min水平電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照，目標(biāo)條帶約1800bp。

圖1 供試菌株P(guān)CR凝膠電泳

(3)序列測(cè)定及序列數(shù)據(jù)分析:

將PCR產(chǎn)物送至華大基因公司測(cè)序，通過Internet網(wǎng)(http://www.ncbi.nlm.nihgov/blast.cgi)進(jìn)行比對(duì)，選取同源性95%以上的11株細(xì)菌，用Mega(4.0)程序包中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定各根瘤菌在微生物系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上的地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 12份菌株的分類地位

通過各菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹表3可知，12份根瘤菌菌株中H8與DC3與菌株RhizobiumgiardiniistrainH152相似性最高，達(dá)99%，為固氮根瘤菌屬Rhizobium；其余10份菌株均為苜蓿中華根瘤菌屬Sinorhizobium，其中菌株H2、SJN、XBC、XHC、HH與Sinorhizobiumkummerowiaestrain CCBAU 71714菌株相似性達(dá)99%，H7與菌株Sinorhizobiummelilotistrain IAM 12611相似性達(dá)99%，SWL、XH與菌株Sinorhizobiummelilotistrain NBRC 14782相似性達(dá)99%，而SD與菌株Sinorhizobiumsaheli strain NBRC 100386相似性達(dá)99%，與該屬內(nèi)其余種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

表3 12份菌株的分類地位

2.2 12份菌株種屬關(guān)系的差異

由圖3可知，在不同土壤條件下從草原3號(hào)雜花苜蓿上分離得到的菌株DC3(關(guān)碾房)與H7(海流圖)分屬于兩個(gè)根瘤菌屬的菌株；黃花草木樨在2種土壤條件下的菌株為同一屬，但親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

在同一土壤環(huán)境下，從不同材料上分離得到的各菌株均表現(xiàn)為親緣關(guān)系較近。分離自呼和浩特市的3份菌株(黃花草木樨的2株菌株XH與XHC及白花草木樨的菌株XBC)親緣關(guān)系較近、分離自沙爾沁苜蓿屬材料的3株菌株SWL、SJN、SD菌株的親緣關(guān)系較近、分離自海流圖苜蓿屬2株菌株(草原3號(hào)雜花苜蓿菌株H7、呼倫貝爾黃花苜蓿菌株H2)與1株草木樨屬材料的菌株(黃花草木樨菌株HH)的親緣關(guān)系較近。

圖3 Neighbour Joining法構(gòu)建的12份菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

采集于不同地點(diǎn)的菌株，可能與不同土壤的養(yǎng)分差異、地區(qū)氣候條件及土壤微生物菌群與寄主植物的互作等密切相關(guān)〔8～12〕。從本試驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步證明，采集于同一地點(diǎn)下不同材料上的菌株，其親緣關(guān)系均較近；對(duì)于采集于不同地點(diǎn)上的同一材料的菌株可能分屬于兩個(gè)屬或同屬內(nèi)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，寄主種子經(jīng)過商品菌劑的包衣(SWL)與同地采集的未包衣寄主材料的菌株(巨能7號(hào)SJN)親緣關(guān)系相近，由此說明2菌株中經(jīng)接種的前處理無效或所接種的菌劑與該地采集的菌株SJN(土著根瘤菌)相同。

〔1〕馬曉彤,劉惠琴,寧國(guó)贊.我國(guó)苜蓿根瘤菌與苜蓿共生固氮優(yōu)良組合研究進(jìn)展及前景〔C〕.中國(guó)苜蓿發(fā)展大會(huì)暨牧草種子、機(jī)械、產(chǎn)品展示會(huì).2003.

〔2〕Moot D J. Nodule occupancy by strain WSM1325 following inoculation of four annual species in Canterbury, New Zealand〔J〕. New Zealand Journal of Agricultural Research, 2013, 56(3):215-223.

〔3〕趙士豪,王來福,陳文新.根瘤菌對(duì)紫花苜蓿接種效果的研究〔J〕.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,34(23):6258-6259.

〔4〕康俊梅,張麗娟,郭文山,等.中苜1號(hào)紫花苜蓿高效共生根瘤菌的篩選〔J〕.草地學(xué)報(bào),2008,16(5):497-500.

〔5〕鐘文文,張小平,Kristina Lindstrom. 高效苜蓿根瘤菌的篩選〔J〕. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2006, 15(3):69-74.

〔6〕熊志銳,張新宇,王永寶,等.新疆耐鹽苜蓿根瘤菌的分離和高效菌株的篩選〔J〕.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,46(6):1301-1306.

〔7〕何亮,謝小軍,王沖,等.16SrRNA序列同源性分析結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建鑒定6株生殖道乳桿菌〔J〕.中華全科醫(yī)學(xué),2013,11(4):617-618.

〔8〕張小甫.甘肅不同生態(tài)區(qū)域苜蓿根瘤菌篩選菌株常規(guī)鑒定與分子鑒定〔D〕.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),2008.

〔9〕朱瑞芬,唐鳳蘭,劉杰淋,等.不同土壤中紫花苜蓿根瘤菌抗逆性的比較〔J〕.草地學(xué)報(bào),2013,21(6):1113-1118.

〔10〕管鳳貞,鐘少杰,邱宏端,等.紫云英根瘤菌的分離與鑒定〔J〕.福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2012,27(5):524-532.

〔11〕Khansolepatil G, Gachande B D. MORPHOLOGICAL, CUUIURAL AND BIOCHEMICAL CHARACTERISTICS OF RIIIZOBIUM JAPONICUM SYN AND BMDYRHIZOBIUM TAPONICUM OF' SOYBEAN〔J〕. Bioscience Discovery An International Journal of Life Sciences, 2011, 2(1):1-4.

〔12〕Bradley D J, Wood E A, Larkins A P, et al. Isolation of monoclonal antibodies reacting with peribacteriod membranes and other components of pea root nodules containing Rhizobium leguminosarum〔J〕.Planta, 1988, 173(2):149.

Identificationof12AlfalfaRhizobiaStrainsby16SrDNAofInnerMongoliawesternregion

YanWei,ShiFengling*,QianYasi

(CollegeofGrassland,ResourceandEnvironmental,InnerMongoliaAgriculturalUniversity;Hohhot010019,China)

S154.38+1

A

2095—5952(2017)03—0036—06

2017-07-24

農(nóng)業(yè)部公益行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)“苜蓿高效種植技術(shù)研究與示范”(201403048)、內(nèi)蒙古自治區(qū)草原英才“內(nèi)蒙古高原鄉(xiāng)土草種質(zhì)資源遺傳改良與利用”創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)

閆 偉(1990- )，男，內(nèi)蒙古鄂爾多斯人，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)槟敛葸z傳與育種，E-mail：328694586@qq.com。

石鳳翎 E-mail：sfl0000@126.com