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(江蘇省泰州市食品藥品檢驗所,江蘇泰州 225300)

醬鹵肉制品中酸性橙Ⅱ檢測方法的優(yōu)化

馮寅潔,喬勇升,紀晨,陳偉

(江蘇省泰州市食品藥品檢驗所,江蘇泰州225300)

優(yōu)化了固相萃取-高效液相色譜檢測醬鹵肉制品中酸性橙Ⅱ的方法。樣品經(jīng)過石油醚去油后,用氨水-乙醇-水溶液(體積比20∶70∶10)提取,70 ℃水浴濃縮,調(diào)節(jié)pH至5～6,通過Cleanert PWAX弱陰離子交換柱凈化和富集,60 ℃水浴揮干洗脫液后用水溶解定容,借助Thermo Hypersil Gold C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)分離,20 mmol/L乙酸銨溶液-甲醇(體積比35∶65)為流動相,以1 mL/min的流速等度洗脫。結(jié)果表明:酸性橙Ⅱ在0.1～5 μg/mL內(nèi)線性良好,相關(guān)系數(shù)(r)大于0.99995,檢出限為0.01 mg/kg。對鴨翅空白樣品分別進行0.5、1.0、1.5、2.0 mg/kg四種水平的加標回收實驗,酸性橙Ⅱ的加標回收率為80.8%～86.3%,相對標準偏差為2.1%～4.7%(n=6)。該方法去除了樣品中的基質(zhì)干擾,較好地提取了酸性橙Ⅱ,選用的固相萃取柱凈化和富集效果理想,具有靈敏度高、可操作性強、重復性好、適用于批量檢測等特點。

醬鹵肉,酸性橙Ⅱ,固相萃取柱,高效液相色譜

Abstract:An optimized method was developed for the determination of acid orange Ⅱ in soy sauce and pot-roast meat products by HPLC-SPE. Samples were firstly removed oil by petroleum,extracted by ammonia-ethanol-water solution(20∶70∶10 of volume ratio),concentrated by water bath at 70 ℃,and adjusted pH value to 5～6. Then,the extraction was cleaned and enriched by Agela Cleanert WPAX weak anion exchange column. The elution was dried by water bath at 60 ℃ and dissolved with water to a constant volume. Sample solution were separated by Thermo Hypersil Gold C18column(250 mm×4.6 mm,5 μm)with the mobile phase of 20 mmol/L ammonium acetate aqueous solution-methanol(35∶65 of volume ratio)at the flow rate of 1 mL/min.Results indicated a good linearity with the linear correlation coefficient(r)above 0.99995 in the range of 0.1～5 μg/mL and the detection limit was 0.01 mg/kg. Under the chosen experiment condition,the average recoveries at four spiked levels(0.5,1.0,1.5,2.0 mg/kg)were 80.8%～86.3% and the relative standard deviations(RSD)were 2.1%～4.7%(n=6). The method can remove sample’s matrix interference,better extracted acid orange Ⅱ,and has advantages such as high sensitivity,good operability and repeatability,which can be applied for the batch detection.

Keywords:soy sauce and pot-roast meat;acid orange Ⅱ;solid phase extraction column;high performance liquid chromatography

酸性橙Ⅱ化學名2-萘酚偶氮對苯磺酸鈉,化學結(jié)構(gòu)式如圖1所示[1],它是一種常用的酸堿指示劑,同時也因其色澤鮮艷、著色穩(wěn)定而應(yīng)用于工業(yè)印染。有研究表明此種偶氮類染料具有致癌、致畸的風險[2-3],若將其加入食品中改善色澤,可能會危害食用者的健康。在食品整治辦〔2008〕3號文——全國打擊違法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑專項整治領(lǐng)導小組關(guān)于印發(fā)《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單(第一批)》的通知中，將酸性橙Ⅱ列入可能違法添加的非食用物質(zhì)名單,嚴禁將其作為著色劑添加到鹵制熟食中。國家食品藥品監(jiān)管總局發(fā)布的《食品安全抽檢實施細則(2016年版)》中明確要求醬鹵肉制品必須檢測酸性橙Ⅱ。

圖1 酸性橙Ⅱ化學結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of acid orange Ⅱ

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鴨翅根、雞塊、雞腿、野山椒鳳爪、香鹵豬唇、醬肉火腿 均為真空包裝,購于超市;酸性橙Ⅱ 純度98.0%,德國Dr. Ehrenstorfer公司;甲醇 色譜純,美國Dikma公司;石油醚、甲酸、氨水、無水乙醇、檸檬酸 均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司;A柱:Cleanert PWAX混合型弱陰離子交換固相萃取柱(60 mg/3 mL) 天津博納艾杰爾科技有限公司;B柱:Oasis WAX混合型弱陰離子交換固相萃取柱(60 mg/3 mL) 美國Waters公司;C柱:CNW poly-sery PWAX弱陰離子交換固相萃取柱(60 mg/3 mL) 上海安譜實驗科技股份有限公司;D柱:Cleanert NH2氨基固相萃取柱(500 mg/3 mL) 天津博納艾杰爾科技有限公司;E柱:Sep-Pak Vac NH2氨基固相萃取柱(500 mg/3 mL) 美國Waters公司;F柱:CNWBOND NH2氨基固相萃取柱(200 mg/3 mL) 上海安譜實驗科技股份有限公司。

DIONEX UltiMate 3000高效液相色譜儀串聯(lián)二極管陣列檢測器 美國Thermo Fisher Scientific公司;XS204電子天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;Milli-Q Reference超純水機 美國Millipore公司;VORTEX 2旋渦混勻器 德國IKA公司;JP-100結(jié)盟牌超聲波清洗機 深圳市結(jié)盟清洗設(shè)備有限公司;LD5-2B低速離心機 北京雷勃爾醫(yī)療器械有限公司;HHS-6S電子恒溫不銹鋼水浴鍋 上海光地儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準工作溶液配制 準確稱取酸性橙Ⅱ標準品10 mg,用水溶解并定容至100 mL,配制成100 μg/mL的標準貯備液。用水稀釋標準貯備液,配成濃度依次為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/mL的標準工作液。

1.2.2 樣品前處理 稱取粉碎并攪拌均勻的樣品2 g于50 mL具塞離心管中,加入20 mL石油醚(沸程30～60 ℃),渦旋1 min后超聲提取5 min,5000 r/min離心5 min,棄去上清液。加入20 mL氨水-乙醇-水提取溶液(體積比20∶70∶10),渦旋1 min后超聲提取10 min,5000 r/min離心5 min,將上清液倒入小燒杯,重復提取殘渣一次,合并上清液于燒杯中,將燒杯置于70 ℃水浴濃縮提取液至約10 mL,取少量水沖洗燒杯內(nèi)壁,用20 g/L檸檬酸溶液調(diào)節(jié)提取液pH至5～6。將樣品提取液加入已依次用3 mL甲醇、3 mL 2%甲酸水溶液活化的固相萃取柱中,待全部上樣后用3 mL 2%甲酸水溶液、3 mL甲醇淋洗,負壓抽干固相萃取柱,用6 mL 10%氨水甲醇溶液洗脫,收集洗脫液于燒杯中,將燒杯置于60 ℃水浴揮干,準確加入2 mL水溶解殘渣,樣品溶液過0.22 μm水系纖維素針式濾膜,待進樣。

1.2.3 提取溶液的比較 按照1.2.2處理樣品,分別選用超純水、乙醇-水溶液(體積比70∶30)、甲酸-乙醇-水溶液(體積比1∶70∶29)、氨水-乙醇-水溶液(體積比20∶70∶10)提取加標水平為0.5、1.0、1.5、2.0 mg/kg的鴨翅樣品,提取液經(jīng)過濃縮、調(diào)節(jié)pH后通過Cleanert PWAX柱處理,經(jīng)液相色譜檢測比較不同提取溶液處理組的加標回收率。

1.2.4 濃縮條件的比較 按照1.2.2處理樣品,將氨水-乙醇-水溶液(體積比20∶70∶10)提取的樣品提取液分別采用真空常溫水浴旋蒸、常壓60 ℃水浴加熱、70 ℃水浴加熱、80 ℃水浴加熱的方法濃縮,比較不同濃縮條件下的液體揮發(fā)情況。

1.2.5 固相萃取柱的比較 按照1.2.2處理樣品,用氨水-乙醇-水溶液提取4個加標水平的鴨翅樣品,提取液經(jīng)過濃縮、調(diào)節(jié)pH后,分別借助A～F固相萃取柱凈化和富集,經(jīng)液相色譜檢測比較不同固相萃取柱處理組的加標回收率。

1.2.6 液相色譜條件 色譜柱:Thermo Hypersil Gold C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫:30 ℃;流動相:甲醇-20 mmol/L乙酸銨(體積比65∶35);流速:1.0 mL/min;進樣量:10 μL;二極管陣列檢測器:檢測波長484 nm,掃描波長190～800 nm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個處理做6次平行。借助Thermo Scientific Dionex Chromeleon 7色譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)對樣品色譜圖進行定性和定量分析,相同處理組數(shù)據(jù)通過Excel軟件計算平均值和相對標準偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長確定

二極管陣列檢測器采集酸性橙Ⅱ的190～800 nm光譜圖,由圖2可見,酸性橙Ⅱ因呈現(xiàn)鮮艷的金黃色,在可見光區(qū)484.90 nm有最大吸收;此外,200.85 nm和228.62 nm也有強吸收,為避免低波長段雜質(zhì)吸收峰和溶劑峰的干擾,并且考慮到紫外檢測器越接近末端吸收,基線越不平穩(wěn)[13],確定檢測波長為484 nm。

圖2 酸性橙Ⅱ標準溶液光譜圖Fig.2 Spectrum of acid orange Ⅱstandard solution

2.2 線性關(guān)系、檢出限和重復性

將配制的標準工作液0.1～5 μg/mL按照濃度從低到高依次進樣,其中0.5 μg/mL酸性橙Ⅱ溶液色譜圖見圖3。以標準溶液峰面積(mAu·min)Y對其濃度(μg/mL)X進行線性回歸,得方程Y=0.4178X+0.0024,r=0.99998。酸性橙Ⅱ檢出限(S/N=3)為0.01 mg/kg,低于SN/T 3536-2013的測定低限。重復進0.5 μg/mL標準溶液6次,保留時間平均為6.251 min,峰面積平均值為0.2165 mAu·min,RSD分別為0.1%和2.3%,定性和定量的重復性均較理想。

圖3 酸性橙Ⅱ標準溶液色譜圖Fig.3 Chromatogram of acid orange Ⅱ standard solution

2.3 樣品提取溶液的選擇

比較圖4各處理的加標回收率,提取效果為:氨水-乙醇-水溶液>乙醇-水溶液>甲酸-乙醇-水溶液>超純水。其中,氨水-乙醇-水溶液處理組的平均回收率為80.8%～86.3%,RSD為2.1%～4.7%;超純水提取組的平均回收率僅為10.2%～11.1%,RSD為5.0%～6.7%。

實驗發(fā)現(xiàn),超純水提取鴨翅樣品,離心后提取液仍偏渾濁,經(jīng)水浴濃縮的液體含有較多雜質(zhì)。有研究認為純水提取不利于蛋白質(zhì)等沉淀,基質(zhì)干擾嚴重[5]。加入乙醇-水溶液提取所得的離心液較澄清,而澄清的提取液有利于液體通過固相萃取柱。酸性橙Ⅱ化學結(jié)構(gòu)中含有磺酸基團,溶于水后主體帶有磺酸根離子。在乙醇-水溶液中加入氨水,溶液呈堿性,依靠酸堿結(jié)合,可以更有效地從樣品中提取出酸性橙Ⅱ,并穩(wěn)定地存在于提取液中。李晶等研究發(fā)現(xiàn)氨水的添加可以較大地提高酸性橙Ⅱ的回收率[14]。相反,含有甲酸的乙醇-水溶液呈酸性,降低了對酸性橙Ⅱ的提取率,并且較乙醇-水溶液的提取率小。

圖4 不同溶液提取加標樣品中酸性橙Ⅱ的回收率Fig.4 Recoveries of acid orange Ⅱin spiked samples extracted by different solutions

2.4 濃縮條件的選擇

濃縮提取液一般采用真空或常壓水浴[15-17]。為合理安排實驗步驟,將約20 mL的首次提取液先濃縮。實驗發(fā)現(xiàn)若采用真空常溫水浴旋蒸濃縮,含有氨水的濃縮液易產(chǎn)生大量氣泡,噴出旋蒸瓶造成損失。若采用常壓80 ℃水浴加熱濃縮[16-17],待將第二次的提取液并入燒杯時,首次提取液已提前揮干,因此選用70 ℃加熱,以減緩提取液的揮發(fā)速度。而在揮干約6 mL的洗脫液時,降低水浴溫度至60 ℃,可在15～20 min后完成,盡量減少高溫對目標物的破壞程度。

2.5 固相萃取柱的比較

樣品提取液分別借助A～F固相萃取柱凈化和富集后,進行液相色譜分析。由圖5可見,有兩種品牌的混合型弱陰離子交換固相萃取柱(A、B柱)處理組平均回收率較理想,分別為80.8%～86.3%、83.3%～89.2%,RSD均小于5%,對于酸性橙Ⅱ有良好的富集能力。三種品牌的氨基固相萃取柱(D、E、F柱)處理組平均回收率均低于60%,表明該種類型的填料對酸性橙Ⅱ的富集能力欠缺,造成了目標物的損失。

圖5 不同種類固相萃取柱處理加標樣品的回收率Fig.5 Recoveries of spiked samples treated by different kinds of solid phase cartridges

實驗選用的PWAX柱、WAX柱和NH2柱均具有極性吸附和弱陰離子交換的雙重作用,酸性條件下弱陰離子固相萃取填料的活性位點能與酸性橙Ⅱ中的磺酸根發(fā)生離子交換[18],從而達到吸附酸性橙Ⅱ和去除雜質(zhì)的目的；在堿性條件下電性中和,酸性橙Ⅱ被洗脫下來。通過比較發(fā)現(xiàn),Cleanert PWAX柱(A柱)和Oasis WAX柱(B柱)上樣時,樣液可順利通過填料流下;同樣規(guī)格的CNW poly-sery PWAX柱(C柱)在上樣時卻容易發(fā)生堵塞,延緩了實驗進度,加標回收率也不及前兩種品牌的混合型弱陰離子固相萃取柱高。國家標準SN/T 3536-2013推薦使用氨基陰離子交換固相萃取柱(NH2柱)[4],但在本實驗中發(fā)現(xiàn),選用的三種品牌的NH2柱(D、E、F柱)在上樣過程中,均需加壓才能使樣品溶液流出,若提取液渾濁,則易造成堵塞,前處理耗時較Cleanert PWAX柱和Oasis WAX柱長;加標樣品經(jīng)過NH2柱處理,回收率均明顯低于Cleanert PWAX柱和Oasis WAX柱。結(jié)果表明,使用Cleanert PWAX柱和Oasis WAX柱進行樣品的凈化和酸性橙Ⅱ的富集,實驗效率和加標回收率均優(yōu)于其他處理。

2.6 樣品測定

分別對6種醬鹵肉制品和加標樣品按1.2.2進行處理,固相萃取柱采用A柱,每個添加水平平行測定6次,經(jīng)檢測,選用的醬鹵肉制品中均未檢出酸性橙Ⅱ,樣品色譜圖中目標峰周圍無雜質(zhì)干擾峰,其中鴨翅空白樣品和加標樣品色譜圖如圖6所示。加標樣品中酸性橙Ⅱ的回收率如表1所示。結(jié)果表明,以本地區(qū)居民常食用的雞、鴨、豬為原料的醬鹵肉制品的平均加標回收率達到80.7%～89.3%,RSD為2.1%～6.1%,該檢驗方法的回收率和重現(xiàn)性均較好。

圖6 空白樣品和加標樣品色譜圖Fig.6 Chromatogram of blank sample and spiked sample

表1 不同種類醬鹵肉制品的加標回收率(n=6)Table 1 Recoveries of different spiked soy sauce and pot-roast meat products(n=6)

3 結(jié)論

在本文的液相條件下,酸性橙Ⅱ在0.1～5 μg/mL內(nèi)線性良好,相關(guān)系數(shù)(r)為0.99998,檢出限(S/N=3)為0.01 mg/kg。通過比較各處理組的平均加標回收率,氨水-乙醇-水溶液(體積比20∶70∶10)能更有效地提取醬鹵肉制品中的酸性橙Ⅱ;在樣品凈化和富集階段,采用Cleanert PWAX柱或Oasis WAX柱,樣品的平均加標回收率均在80%以上,RSD在10%以內(nèi),適用于多種醬鹵肉制品中酸性橙Ⅱ的檢測。其中Oasis WAX柱處理組的平均加標回收率略高于Cleanert PWAX柱處理組。若不考慮價格因素,可選用Oasis WAX柱;若考慮日常大批量實驗的成本,選用Cleanert PWAX柱性價比更高。

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OptimizationofthedeterminationofacidorangeⅡinsoysauceandpot-roastmeatproducts

FENGYin-jie,QIAOYong-sheng,JIChen,CHENWei

(Taizhou Institute for Food and Drug Control,Taizhou 225300,China)

TS251.7

A

1002-0306(2017)18-0237-05

2017-02-23

馮寅潔(1986-)，女，碩士，工程師，主要從事食品質(zhì)量監(jiān)督與檢驗方面的研究，E-mail:fengyj0126@163.com。

10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.045