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(湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院,湖北恩施 445000)

華中枸骨葉抑菌物質(zhì)提取工藝優(yōu)化及其抑菌作用研究

杜銀香,胡澤華*

(湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院,湖北恩施445000)

本文以抑菌圈直徑為指標(biāo),以金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌為指示菌,比較煎煮法、超聲提取、回流提取三種方法所得提取物的抑菌效果,確定最佳的提取方法。在此基礎(chǔ)上通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化該方法的提取工藝,最終測定優(yōu)化工藝條件下的提取物對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、產(chǎn)氣腸桿菌、銅綠假單胞菌、宋內(nèi)志賀菌、白假絲酵母菌的抑菌效果。結(jié)果表明:最佳提取方法為超聲波法水提,優(yōu)化的工藝條件:在超聲功率250 W,室溫下提取,料液比1∶25 (g∶mL),每次30 min,提取2次,此條件下的提取物(原液)對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的抑菌圈直徑分別為24.67、15.67 mm,對產(chǎn)氣腸桿菌、銅綠假單胞菌、宋內(nèi)志賀菌的抑菌圈直徑為13.67～17.33 mm,對白假絲酵母菌無抑菌作用。

華中枸骨葉,正交實(shí)驗(yàn),抑菌作用

Abstract:The size of inhibition zone was the index,S.aureusandE.coliwere the indicator bacteria,to determine the best extraction method by comparing the bacteriostatic effect of extracts from water extraction,ultrasonic extraction,reflux extraction.Basis on the single-factor experiment,orthogonal experiment was used to optimize the extraction process.The effect of extracts from the optimal process onS.aureus,E.coli,E.aerogenes,P.aeruginosa,S.sonnei,C.albicanswas determined. The results showed that the best extraction process was the use of water as solvent,ultrasound extraction,ultrasonic power 250 W,at room-temperature,material liquid ratio of 1∶25,extraction for 30 minutes,extracted 2 times. Under these condition of extraction,the diameter of bacteriostatic rings againstS.aureus,E.coliwere 24.67 mm and 15.67 mm,and the diameter of bacteriostatic rings againstE.aerogenes,P.aeruginosa,S.sonneiwere 13.67～17.33 mm,and the extraction had no inhibitory effect onC.albicans.

Keywords:leaf ofIlexcentrochinensisS. Y. Hu;orthogonal test;antimicrobial effect

華中枸骨(IlexcentrochinensisS. Y. Hu)為冬青科冬青屬植物,別名為針齒冬青,生長在海拔300～1000 m的山坡灌叢中。華中枸骨在湖北恩施地區(qū)植物資源豐富,因其具有清熱解毒功效,在恩施民間常用其葉來治療燙火傷[1],并且效果較好。在我國某些地區(qū)其葉常被用作苦丁茶的原料[2-4]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),華中枸骨葉中含有黃酮類、三萜類等物質(zhì)[5-7],這些成分均具有很好的抑菌作用。國內(nèi)外對冬青科冬青屬植物的研究表明,該屬植物有抗菌、抗病毒等作用[8-10]。但是,目前對華中枸骨的研究主要集中在醫(yī)療保健方面[11-12],尚無其抑菌作用方面的研究報(bào)道。

中草藥由于提取工藝不同,得到的化學(xué)成分不同,藥效也各異,不同的中草藥都有其最適宜的提取工藝[13-14]。為了更好的提取出華中枸骨葉中有效抑菌物質(zhì),本實(shí)驗(yàn)以抑菌圈大小為指標(biāo),以金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌為指示菌,通過比較煎煮法、超聲提取、回流提取三種方法所得提取物的抑菌效果,確定最佳的提取方式,并在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝,同時(shí)測定優(yōu)化工藝條件下的提取物對常見細(xì)菌的抑菌效果,旨在為華中枸骨這一土家資源在抑菌方面的研究開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

華中枸骨葉 采自湖北省恩施州建始縣,經(jīng)湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院藥用植物與鑒定學(xué)教研室鑒定為冬青科冬青屬植物華中枸骨(IlexcentrochinensisS.Y.Hu)的葉,自然曬干后,粉碎成粗粉,過40目篩后備用;供試菌種金黃色葡萄球菌(S.aureus)、大腸埃希菌(E.coli)、產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes)、銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)、宋內(nèi)志賀菌(S.sonnei)、白假絲酵母菌(C.albicans) 由湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供;MH瓊脂培養(yǎng)基、沙保氏培養(yǎng)基 杭州微生物試劑有限公司;無水乙醇 分析純,天津市福晨化學(xué)試劑廠。

NU-425-400S生物安全柜 美國NuAire公司;CL-32L高壓蒸汽滅菌器 日本ALP公司;XMT-9017電熱恒溫恒濕培養(yǎng)箱 重慶永恒實(shí)驗(yàn)儀器廠;SSW微電腦電熱恒溫水槽 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SHZ-D循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司;CQ-250超聲波清洗器 上海弘興超聲電子儀器有限公司;RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 華中枸骨葉提取物的制備 煎煮法[15]:稱取華中枸骨葉粗粉10 g,以料液比1∶10 (g∶mL)加入蒸餾水,沸水提取3次,每次煎煮60 min,合并3次的提取液,抽濾,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至剩少許液體時(shí),再在水浴鍋上蒸發(fā)至剩10 mL液體為止,即得到提取液原液1 g/mL(相對于生藥),0.22 μm薄膜濾菌器過濾后備用。

超聲提取[16]:稱取華中枸骨葉粗粉10 g兩份,分別以料液比1∶10 (g∶mL)加入蒸餾水或55%乙醇,在室溫、超聲功率250 W下,超聲提取30 min,提取3次,合并3次的提取液,抽濾,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至剩少許液體時(shí),再在水浴鍋上蒸發(fā)干,加10 mL蒸餾水溶解,即得到提取原液1 g/mL(相對于生藥),0.22 μm薄膜濾菌器過濾后備用。

回流提取[16]:稱取華中枸骨葉粗粉10 g,以料液比1∶10 (g∶mL)加入55%乙醇,在75 ℃水浴中加熱提取60 min,提取3次,合并3次的提取液,其它操作同超聲提取。

1.2.2 抑菌實(shí)驗(yàn) 采用牛津杯法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)[17]。在直徑90 mm MH瓊脂平板上(真菌用沙保氏培養(yǎng)基)加入0.1 mL菌液(取對數(shù)期的細(xì)菌用生理鹽水配成細(xì)菌含量為107cfu/mL的菌懸液),用無菌L型玻璃棒涂布均勻,在涂菌后的平板上均勻放置牛津杯,每個(gè)小杯中加入藥液100 μL(其中1個(gè)小杯中加入無菌蒸餾水作陰性對照),最后放入37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h(白假絲酵母菌培養(yǎng)48 h)后觀察結(jié)果。十字交叉法測量抑菌圈直徑[18]。

1.2.3 超聲提取的單因素實(shí)驗(yàn) 以蒸餾水作為提取溶劑,在超聲功率250 W,室溫下,分別以料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)為單因素,以抑菌圈直徑為指標(biāo),以金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌為指示菌,考察各因素對華中枸骨葉提取物抑菌效果的影響。

料液比的影響:在確定超聲提取時(shí)間30 min,提取2次的條件下,以1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 (g∶mL)的料液比加入蒸餾水,比較不同料液比對提取物抑菌活性的影響。

超聲提取時(shí)間的影響:在上述實(shí)驗(yàn)確定的適宜料液比條件下,提取2次,分別提取10、20、30、40、50、60 min,比較不同提取時(shí)間對提取物抑菌活性的影響。

提取次數(shù)的影響:在上述實(shí)驗(yàn)確定的適宜料液比、提取時(shí)間的條件下,分別提取1～5次,比較不同提取次數(shù)對提取物抑菌活性的影響。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,綜合考慮料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)對抑菌效果的影響,按L9(34)正交實(shí)驗(yàn)表安排實(shí)驗(yàn),來確定最佳提取工藝參數(shù)[19]。

表1 因素與水平Table 1 Factors and levels

1.2.5 不同濃度的提取物對常見菌的抑菌作用 將在最佳工藝條件得到的提取物稀釋至濃度為500、100 mg/mL,比較不同濃度的提取物對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣腸桿菌、宋內(nèi)志賀菌、白假絲酵母菌的抑菌作用。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理,用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多樣本均數(shù)用方差分析,以p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方式選擇

表2 不同方式得到的提取物對細(xì)菌的抑菌效果(n=6)Table 2 The antibacterial activities of extracts in different ways(n=6)

注:同列數(shù)據(jù)中標(biāo)有不同的小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

由表2可知,以金黃色葡萄球菌為指示菌,以水為溶劑超聲法得到的提取物與其他三種提取物的抑菌效果比較差異顯著(p<0.05)。以大腸埃希菌為指示菌,以水為溶劑超聲法得到的提取物與水煎煮法得到的提取物抑菌效果比較差異顯著(p<0.05),但與另外兩種提取物抑菌效果比較差異不顯著(p>0.05)。因?yàn)槌曁崛》ň哂刑崛r(shí)間短、提取效率高、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)[20],同時(shí)所用溶劑為水，比55%乙醇成本低,因此選擇以水為溶劑的超聲法來提取華中枸骨葉中的抑菌物質(zhì)。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 料液比對抑菌效果的影響 由圖1可知,在料液比1∶10～1∶25的范圍內(nèi),隨著料液比增加,抑菌圈越來越大,當(dāng)料液比為1∶25時(shí),抑菌圈直徑達(dá)到最大。但隨著料液比的繼續(xù)增加,抑菌圈直徑并沒有增加。這可能是由于隨著料液比的增加,植物細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的濃度差越大,越利于抑菌活性物質(zhì)的溶出;但當(dāng)料液比過大時(shí),分散了超聲波對華中枸骨葉粉末的作用,使得在相同提取條件下胞內(nèi)抑菌物質(zhì)的擴(kuò)散及溶解都減少[21-22]。同時(shí),溶劑用量加大,也會(huì)給后續(xù)的提取濃縮工作造成困難,提高生產(chǎn)成本。因此,正交實(shí)驗(yàn)時(shí)料液比選擇1∶25左右。

圖1 料液比對提取物抑菌效果的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on antibacterial activity of extract

2.2.2 提取時(shí)間對抑菌效果的影響 由圖2可知,在10～30 min時(shí),隨著提取時(shí)間的增加,抑菌圈直徑逐漸增加,可能是隨著提取時(shí)間延長,越來越多的抑菌活性物質(zhì)溶解到提取液中。當(dāng)提取30 min時(shí),其抑菌圈直徑最大。但隨著超聲提取時(shí)間的進(jìn)一步延長,抑菌圈直徑卻逐漸減少,可能是超聲波作用時(shí)間過長,使其中有效抑菌成分的結(jié)構(gòu)發(fā)生了破壞。因此,正交實(shí)驗(yàn)時(shí)提取時(shí)間選擇30 min左右。

圖2 提取時(shí)間對提取物抑菌效果的影響Fig.2 Effect of extraction time on antibacterial activity of extract

2.2.3 提取次數(shù)對抑菌效果的影響 提取次數(shù)對抑菌效果的影響如圖3所示,隨著提取次數(shù)的增加,抑菌圈直徑先增加后減少,提取2次時(shí),抑菌圈直徑最大?？赡茈S著提取次數(shù)的增加,其他物質(zhì)也逐漸溶解出來,影響了提取液的抑菌效果。因此,正交實(shí)驗(yàn)時(shí)提取次數(shù)選擇2次左右。

圖3 提取次數(shù)對提取物抑菌效果的影響Fig.3 Effect of extraction time on antibacterial activity of extract

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表3、表4的結(jié)果可知,各因素對華中枸骨葉提取物的金黃色葡萄球菌抑菌效果影響的大小順序?yàn)樘崛〈螖?shù)(C)>料液比(A)>提取時(shí)間(B),三個(gè)因素各水平之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),從極差和方差分析結(jié)果得出,從華中枸骨葉中提取對G+金黃色葡萄球菌抑菌效果最好的條件為A2B2C2。

表4 方差分析結(jié)果(金黃色葡萄球菌)Table 4 Result of variance analysis(S. aureus)

表5 方差分析結(jié)果(大腸埃希菌)Table 5 Result of variance analysis(E. coli)

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 3 Results of orthogonal test(n=3)

表6 不同濃度的提取物對常見菌的抑菌作用Table 6 Bacteriostatic effect of extracts of different concentrations on common bacteria

注:-表示陰性。

由表3、表5的結(jié)果可知,各因素對華中枸骨葉提取物的大腸埃希菌抑菌效果影響的大小順序?yàn)樘崛r(shí)間(B)>料液比(A)>提取次數(shù)(C),三個(gè)因素各水平之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),從極差和方差分析結(jié)果得出,從華中枸骨葉中提取對G-大腸埃希菌抑菌效果最好的條件為A2B2C2。

以G+金黃色葡萄球菌、G-大腸埃希菌為指示菌,以抑菌效果為指標(biāo),超聲法提取華中枸骨葉中抑菌物質(zhì)的最佳工藝為A2B2C2,即為料液比1∶25 (g∶mL),提取時(shí)間30 min,提取2次,此工藝條件下的提取物抑菌效果最好。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在優(yōu)化工藝的條件下提取華中枸骨葉中的抑菌物質(zhì),按照1.2.2抑菌實(shí)驗(yàn)方法測定抑菌活性,測得金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為(24.67±0.94) mm,大腸埃希菌的抑菌圈直徑為(15.67±0.94) mm,結(jié)果顯示,在優(yōu)化工藝下提取的華中枸骨葉中的成分抑菌效果好,說明該工藝條件可以很好的提取出華中枸骨葉中的有效抑菌成分。

2.5 不同濃度的提取物對常見菌的抑菌作用

由表6可知,最佳工藝下的提取物除對白假絲酵母菌沒有抑菌效果外,對其他細(xì)菌均有抑菌作用,并且隨著提取物濃度的提高,抑菌效果逐漸增強(qiáng)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過對中草藥常用提取方法的比較,發(fā)現(xiàn)以水為溶劑,超聲提取得到的提取物抑菌效果優(yōu)于其它提取方法,故而選擇以水為溶劑,進(jìn)行超聲提取。通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化,得到的最佳提取工藝為在室溫下,超聲功率250 W,料液比1∶25 (g∶mL),提取2次,每次提取30 min,此工藝條件下的提取物(1 g/mL)對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣腸桿菌、宋內(nèi)志賀菌的抑菌圈直徑分別為24.67、15.67、13.67、17.33、14.33 mm,對白假絲酵母菌抑菌作用弱。

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OptimizingprocessofextractionandantibacterialactivitiesofantibacterialsubstancefromIlexcentrochinensisS.Y.Huleaf

DUYin-xiang,HUZe-hua*

(Medical College,Hubei University for Nationalities,Enshi 445000,China)

TS201.2

B

1002-0306(2017)18-0173-05

2017-02-23

杜銀香(1976-)，女，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：中草藥抗菌作用研究，E-mail:yinxiangdu@163.com。

*通訊作者:胡澤華(1975-)，男，博士，副教授,研究方向:中草藥化學(xué)成分與藥理研究,E-mail:hzh75418427@126.com。

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81560703)。

10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.033