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(1.五糧液股份有限公司,四川宜賓 644007;2.固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室,四川宜賓 644007)

濃香型大曲儲藏過程中細菌菌群差異性分析

施思1,彭智輔1,喬宗偉1,2,劉多濤1,羅青春1,涂福明1

(1.五糧液股份有限公司,四川宜賓644007;2.固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室,四川宜賓644007)

為了探究不同陳化曲庫中大曲細菌群落差異變化,采用高通量測序技術分析了細菌16S rDNA V3～V4區(qū),并結合主成分和判別效應分析方法進一步揭示不同大曲與細菌多樣性關系。實驗選取A和B兩組大曲,由車間跟蹤數(shù)據所知,A組出庫曲糖化力平均值約為B組的二分之一,具有明顯差異。結果表明儲藏過程中大曲細菌群落結構不斷調整,乳球菌和賽巴爾德氏菌成為A組大曲最終的優(yōu)勢菌群,而B組大曲的優(yōu)勢菌為芽孢桿菌;A組大曲樣品的細菌多樣性差異較大,高溫放線菌屬是差異最為顯著的微生物,而芽孢桿菌則是B組大曲樣品中的特征性細菌類群。

濃香型大曲,儲藏,細菌,差異性

Abstract:To explore the change of bacterial communities of Daqu in different storage rooms,the V3 and V4 regions of bacterial 16S rDNA were analyzed by high-throughput sequencing,the relationship between different Daqu and bacterial diversity was revealed combining the methods of principal co-ordinates analysis and linear discriminant analysis. The groups of A and B were selected in this experiment,according to the tracking data of the department,the mean value of saccharifying power of group A was a half of group B,which indicated obvious difference. The results showed that bacterial community structure was constantly adjusted,LactococcusandSebaldellabecame the dominant genera of group A in the end of storage,while the dominant genera wasBacillusin group B. The bacterial diversity of Daqu had a great difference in group A,in whichThermoctinomyceswere the significantly different microbes,whileBacilluswere the specific bacterium in group B.

Keywords:Luzhou-flavor Daqu;storage;bacterium;difference

中溫制曲工藝是釀制濃香型白酒普遍采用的制曲方式。小麥經粉碎加水拌合制成曲塊,先經過30 d左右的發(fā)酵,其品溫達到55～58 ℃,然后經過6個月左右的儲藏才能使用。而在長達數(shù)月的儲藏過程中,大曲微生物區(qū)系結構發(fā)生相應變化,發(fā)酵代謝產生部分風味物質或風味前體物質,對白酒風格的影響至關重要。在實際生產過程中,車間陳化曲庫由于所處地勢高低不同,造成曲庫溫度、通風情況等因素存在一定差異,而這些差異會在一定程度上影響微生物生長變化,最終造成出庫曲質量不一。因此,探討不同曲庫環(huán)境對大曲儲藏期微生物群落結構變化影響,弄清微生物多樣性的構成差異與不同曲庫環(huán)境大曲質量的關系具有重要意義。

目前,針對不同大曲微生物差異性比較分析,許多科研工作者也做了不少探索。葉光斌等人通過構建細菌16S rRNA基因文庫、RFLP指紋圖譜分析了清香型三類大曲的細菌群落結構,初步弄清了清茬曲、后火曲和紅心曲的優(yōu)勢細菌菌群[1]。王曉丹等人利用454FLX+平臺進行測序,比較分析了遵義地區(qū)3個醬香型大曲細菌群落,并且通過主成分分析探討了棒狀桿菌屬,魏斯氏菌屬與三類大曲樣品的關系遠近[2]。炊偉強等人通過傳統(tǒng)微生物學方法探討了瀘州老窖普通大曲、優(yōu)質大曲的感官指標與微生物、理化指標等的關系,揭示了優(yōu)質大曲中細菌、芽孢桿菌、霉菌和酵母菌的總數(shù)均高于普通大曲[3]。此外,潭映月[4]、黃小寧[5]、王海燕[6]及李艷[7]等人利用PCR-DGGE技術對不同類型的大曲微生物多樣性進行了相關比較分析及探討。趙金松則利用磷脂脂肪酸技術(PLAF)對清香型、濃香型和醬香型大曲微生物群落結構進行了比較研究[8]。隨著測序技術的迅猛發(fā)展,測序結果中往往包含大量序列數(shù)據需要分析處理,以便直觀明了地揭示其中規(guī)律所在。梁晨等人將大曲中已知屬的微生物進行Spearman相關性分析,并且利用SPSS軟件解析微生物與風味物質的相關性,為大曲儲存的科學合理性提供了一定依據[9]。作為中國傳統(tǒng)濃香型白酒大曲,需要運用更為高效直觀的技術方法去探索大曲中極為豐富的微生物菌群,并且結合相關數(shù)據分析技術直觀展示大曲樣品以及復雜的微生物群落關系,抓住主要矛盾進行分析,使復雜的問題簡單化。

本研究立足生產實際,選取不同工段里兩個陳化曲庫中的10個大曲樣本進行針對16S rDNA V3～V4區(qū)高通量測序,并結合PCoA(主成分分析,principal co-ordinates analysis)及LEfSe(線性判別分析及影響因子,Linear discriminant analysis effect size)分析方法,揭示儲藏過程中大曲樣本間細菌結構變化差異,探討不同大曲與微生物群落關系,并對相關差異顯著的細菌微生物給予確認。希望能夠從微生物的角度提供一些分析思路,不斷完善濃香型大曲制曲工藝理論。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

曲樣 根據生產提供的跟蹤數(shù)據顯示,A組所在的曲房出庫曲糖化力平均值僅為B組出庫曲的相應指標的二分之一，結合車間要求,選取A和B兩組樣本進行分析；細菌宏基因組DNA抽提試劑盒 上海生工;Qubit2.0 DNA檢測試劑盒 Thermo ScientificTM;341F引物：CCCT ACACGACGCTCTTCCGATCTGCC TACGGGNGGCWGCAG;805R引物：GACTGGAGTT CCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATC TAATCC 上海生工;UNIVERSAL 320R冷凍離心機 德國Hettich;HWS26型電熱恒溫數(shù)字水浴鍋 上海一恒科技;T100TMThermal Cyeler PCR儀 BIO-RAD;DYCZ-21電泳槽 北京六一儀器;凝膠成像系統(tǒng) 美國UVP。

1.2 實驗方法

1.2.1 取樣 在儲存過程中定點跟蹤取樣,每月一次,共計兩組10個樣品。樣品破碎成粉后用無菌袋密封,樣品按組及時間順序分別標記為A組:1、2、3、4、5;B組:6、7、8、9、10。

1.2.2 宏基因組提取 采用差速離心法收集微生物細胞沉淀,采取反復凍融[9]與試劑盒相結合的方法,收集DNA,置于-20 ℃保存。利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量,以確定PCR反應加入的DNA量。

1.2.3 PCR擴增 利用引物341F和805R對大曲細菌基因組16S rDNA V3～V4進行擴增。擴增體系(50 μL):10×PCR buffer 5μL,dNTP(10 mmol/L each)0.5 μL,DNA 10 ng,引物F(50 μmol/L)0.5 μL,引物R(50 μmol/L)0.5 μL,Plantium Taq(5 U/μL)0.5 μL。

擴增程序:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,45 ℃ 20 s,65 ℃ 30 s,共5個循環(huán);94 ℃ 20 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s,共20個循環(huán);72 ℃ 5 min。

1.2.4 DNA純化及Miseq高通量測序 DNA純化及高通量測序由上海生工有限公司完成。利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量,以方便按照1∶1的等量混合后測序。等量混合時,每個樣品DNA量取10 ng,最終上機測序濃度為20 pmol。對測序得到的原始數(shù)據進行質控過濾,最終獲得可供分析的優(yōu)質序列。利用Usearch(Version 5.2.236)按照97%的相似度聚類生成OTU(操作分類單元,operational taxonomic)[10],與RDP(核糖體數(shù)據庫項目,ribosomal database project)數(shù)據庫比對得到物種分類信息,并計算每個樣品的香濃指數(shù)(Shannon index)等。利用R(Version 3.2)繪制稀釋曲線,制作群落結構組分圖。

1.2.5 基于UniFrac的主成分(PCoA)分析 使用MUSCLE(Version 3.8.31)對所有OTU代表序列進行多序列比對得到alignment文件,使用Mothur(Version 1.30.1)得到樣品間距離矩陣。利用UniFrac分析得到的距離矩陣可用于PCoA分析,使用R的vegan包對大曲樣品進行PCoA分析[11-12]。

1.2.6 線性判別及影響因子(LEfSe)分析 采用軟件LEfSe(Version 1.1.0)使用非參數(shù)系數(shù)的Kruskal-Wallis sum-rank test檢測組間豐度顯著差異的特征,運用LDA(線性判別分析,Linear discriminant analysis)估計這些差異特征對組間區(qū)別的影響大小[13]。

2 結果與分析

2.1 測序序列數(shù)目和多樣性指數(shù)分析

覆蓋率越高,則樣本中序列沒有被檢出的概率越低。由圖1及表1可知,取樣覆蓋率均超過90%以上,樣品隨著測序序列數(shù)的增加,多樣性指數(shù)(基于香濃指數(shù))曲線趨于平坦,說明本次實驗取樣合理,結果能代表樣本的真實情況,更多的取樣僅會產生少量的OTU。

表1 OTU和多樣性指數(shù)分析Table 1 OTU and diversity indexes

圖1 樣品稀釋曲線(基于香濃指數(shù))Fig.1 Rarefaction curve of samples(based on Shannon index)

根據barcode將序列按照樣品來源進行分揀,對各樣本數(shù)據進行質控過濾、去嵌合后,得到有效數(shù)據如表1所示。A組樣本測序共得到114762條序列,聚類分析產生12345個分類單元;B組樣本測序共得到74418條序列,聚類分析產生7559個分類單元。A組香濃指數(shù)普遍高于B組,不過兩組多樣性指數(shù)變化規(guī)律一致。在中期,兩組樣品細菌多樣性(基于香濃指數(shù))降到最低,而后又同時達到最大值。

2.2 大曲儲藏過程中細菌群落結構變化分析

對樣品中物種多樣性進行分類分析,可以得到以下兩個信息:樣品中含有何種微生物;各微生物的相對豐度。為了展示效果,一般只顯示相對豐度前50的物種分類,剩余物種合并為“其它”。如圖2所示,在屬水平上大曲儲藏過程中細菌多樣性有較為明顯的差異。A組大曲儲藏初始階段,芽孢桿菌屬(Bacillus)及魏斯氏屬(Weissella)為優(yōu)勢菌,占比分別為29.86%和26.83%;隨著時間的推移,Bacillus和Weissella逐漸減少,比例分別降至2.25%和2.6%,而與此同時高溫放線菌屬(Thermoctinomyces)相對數(shù)量增至最大,占比為38.73%;儲藏末期,細菌群落結構進一步調整,物種分布相對均勻,乳球菌(Lactococcus)和賽巴爾德氏菌(Sebaldella)成為主要優(yōu)勢菌,比例分別為21.54%和18.15%。其次,芽孢桿菌屬、不動桿菌屬、高溫放線菌屬及Kroppenstedtia依次檢測到的比例為11.03%、8.43%、7.18%和6.17%。

圖2 各樣本在屬水平上的細菌群落結構柱狀圖Fig.2 The histogram of bacterial communities structure of all samples in the genus level

與A組相比,B組大曲儲藏過程中最顯而易見的不同是高溫放線菌一直沒有被檢測到。在該儲存期中,芽孢桿菌屬一直處于主要優(yōu)勢地位,儲藏最后階段的優(yōu)勢細菌為芽孢桿菌屬和乳球菌屬,占比分別是40.86%和16.68%。

2.3 基于UniFrac的主成分(PCoA)分析

如圖3所示,通過對UniFrac距離的聚類,A、B兩組樣品基本分散在了不同區(qū)域,分布規(guī)律不明顯。從儲藏時間推移來看,A組中大曲儲藏初期樣品1與樣品2距離較遠,說明在這段時期內細菌菌群變化較大,而中期樣品2和3分布在了同一象限,表明這兩個細菌群落結構差別不大,中期儲存過程相對穩(wěn)定,向后期過渡時,群落結構波動明顯增大;B組中大曲儲藏前期樣品6和7距離較近,說明這兩個群落中細菌物種獨立進化較少,前期儲存過程相對穩(wěn)定,而中后期波動較大。

圖3 不同大曲樣品細菌群落PCoA分析Fig.3 PCoA analysis of different bacterial communities based on the weighted UniFrac

2.4 線性判別及影響因子(LEfSe)分析

LEfSe分析的目的是找出對A組與B組劃分產生顯著性差異影響的特定微生物,它不僅注重統(tǒng)計學意義,還注重生物相關性分析[14-15]。圖4中,LEfSe分析結果用LDA值(Linear Discriminant Analysis)做分布柱狀圖,其中橫軸的長度代表差異物種的影響值大小,縱軸標記的為具有統(tǒng)計學差異的細菌物種。結果顯示,共有13個差異顯著的細菌類群。與A組大曲微生物相比,B組中差異顯著的細菌微生物分別是Cytophagales、Cytophagia、Xanthomonadales、Xanthomonadaceae、Paenibacillaceae_1、Brevibacillus、Kroppenstedtia、Thermoctinomyces和Thermoctinomycetaceae,其中高溫放線菌影響值最大;而A組中差異顯著的細菌微生物有Bacillaceae_1、Bacillus、Allobacillus和Bacillaceae_2共4類,芽孢桿菌影響值最大。

圖4 A、B兩組大曲樣品中差異特定微生物LEfSe分析Fig.4 LEfSe analysis of differently specific microorganisms for A and B groups

3 結論

本研究采用MiSeq測序方法,對大曲樣品中細菌16S rDNA(V3～V4)進行測序,將優(yōu)質序列按照97%的相似度進行聚類分析,計算細菌類群的相對含量,通過群落結構柱狀圖發(fā)現(xiàn),來源于不同陳化曲庫的大曲細菌微生物群落結構變化差異較為明顯。B組大曲中的主要優(yōu)勢菌為芽孢桿菌,它可以降解蛋白質、淀粉等大分子物質,是濃香型大曲中不可或缺的功能細菌[16-18];B組大曲中一直未被檢測到的高溫放線菌是A組大曲儲藏中期的主要優(yōu)勢菌,該菌屬在系統(tǒng)進化中接近芽孢桿菌[19],具有較強的耐高溫能力,常在高溫醬曲或中高溫大曲中被檢測出[20-22]。

對兩組樣本的10個樣品進行主成分分析,可以反映不同大曲樣品在物種多樣性方面存在的差異大小,在生態(tài)學研究中具有重要意義。目前,UniFrac分析方法中,加權(weighted UniFrac)與非加權(unweighted UniFrac)的應用非常廣泛,其中加權考慮了物種豐度,而非加權則沒有考慮物種豐度[23]。本研究采用加權計算方式分析了不同大曲細菌多樣性差異大小,發(fā)現(xiàn)與B組相比,A組樣品分布較為離散,進行獨立進化的細菌物種相對較多。

LEfSe分析中,LDA分布柱狀圖展現(xiàn)了兩組大曲樣品中具有統(tǒng)計學差異的微生物標記。結合PCoA分析,由于A組大曲細菌多樣性較之B組差異較大,因此,A組中具有特征差異的細菌微生物種類也較B組多出一半有余。其中,高溫放線菌是A組大曲儲存過程中的特征性微生物,芽孢桿菌則是B組大曲儲藏期內的特征微生物。

綜上所述,初步推斷B組大曲細菌群落結構與生產工藝要求較為吻合,A組大曲在儲藏過程中由于受到高溫放線菌屬的活動影響,使得芽孢桿菌的生長繁殖受到了一定抑制,可能是造成其出庫曲指標長期低于A組的原因之一。車間可根據班組操作記錄,比較兩個工段的品溫及室溫變化情況,及時調整通風排潮,為微生物的生長代謝提供更為有利的環(huán)境條件。

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Differenceanalysisofbacterialcommunity
forLuzhou-flavorDaquduringstorage

SHISi1,PENGZhi-fu1,QIAOZong-wei1,2,LIUDuo-tao1,LUOQing-chun1,TUFu-ming1

(1.Wuliangye Group Co.,Ltd.,Yibin 644007,China;2.Solid-state Fermentation Resource Utilization Key Laboratory of Sichuan Province,Yibin 644007,China)

TS262.3+1

A

1002-0306(2017)18-0151-05

2017-01-09

施思(1986-)，女，碩士，工程師，研究方向：釀酒微生物，E-mail：sstype@sina.com。

固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室開放基金項目(2015GTJ004)。

10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.029