,,,*

(1.錦州醫(yī)科大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121000;2.錦州醫(yī)科大學畜牧獸醫(yī)學院,遼寧錦州 121000)

豆腐酸漿中干酪乳桿菌的分離、鑒定及作為豆腐凝固劑的應用

葉青1,許云賀2,張莉力1,*

(1.錦州醫(yī)科大學食品科學與工程學院,遼寧錦州121000;2.錦州醫(yī)科大學畜牧獸醫(yī)學院,遼寧錦州121000)

通過平板涂布法和高效液相色譜法,以pH和產(chǎn)乳酸量為指標,從自然發(fā)酵酸漿中分離篩選出一株乳酸菌YQ336,對其進行菌株形態(tài)觀察、菌落形態(tài)觀察、生理生化鑒定以及16S rDNA序列分析,結果表明,該乳酸菌屬于乳桿菌屬的干酪乳桿菌。將分離出的干酪乳桿菌YQ336接種于豆腐黃漿水中純種發(fā)酵制成豆腐凝固劑點制豆腐,與自然發(fā)酵酸漿點制的豆腐進行比較,發(fā)現(xiàn)兩者的感官評分差異不顯著(p>0.05),說明干酪乳桿菌YQ336可以作為新型豆腐凝固劑開發(fā)并使用。

黃漿水,干酪乳桿菌,高效液相色譜,豆腐凝固劑,分離鑒定,酸漿豆腐

Abstract:A strain of lactic acid bacteria was screened out from the tofu acid pulp by the plate coating method and high performance liquid chromatography with the pH and lactic acid yield as indexes. The morphological observation,colony morphological observation,physiological and biochemical identification and 16S rDNA sequence analysis of the strain were carried out,and the results showed that the lactic acid bacteria belonged toLactobacilluscasei. The isolatedLactobacilluscaseiYQ336 was inoculated into bean curd water and fermented into tofu coagulant to make tofu,compared with tofu made from natural fermented acid pulp,it was found that there was no significant difference between the two sensory scores(p>0.05). The result indicated thatLactobacilluscaseiYQ336 can be developed and used as a new tofu coagulant.

Keywords:bean curd water;Lactobacilluscasei;high performance liquid chromatography(HPLC);tofu coagulant;isolation and identification;acid slurry bean curd

黃漿水是豆腐生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物,含有豐富的蛋白質、脂肪、糖類、鹽類等物質,通常被直接排放,既浪費資源又污染環(huán)境[1]。近年來,黃漿廢水的利用主要有功能性成分的回收和直接利用[2-3]兩種方式。Xijun Chai[4]等利用膜處理法過濾黃漿廢水,使?jié)饪s物可以回到生產(chǎn)線重新利用,過濾后的水可以直接排放。而我國傳統(tǒng)酸漿豆腐是利用黃漿水直接自然發(fā)酵,形成酸漿作為豆腐凝固劑[5-6],并進行循環(huán)使用。酸漿豆腐口感細膩,味甘甜,是純綠色食品[7-8]。但是,傳統(tǒng)酸漿都是由小作坊自然發(fā)酵制成,容易受外界因素影響,導致酸漿的酸度不易控制。外界溫度足夠時,微生物繁殖迅速,酸漿可以很快達到點豆腐所需的酸度,而外界溫度過低時,酸度則需要很長時間才能達到。而且由于環(huán)境不穩(wěn)定,酸漿的酸度就不容易控制,造成生產(chǎn)的酸漿豆腐品質不穩(wěn)定。另一方面,酸漿在自然發(fā)酵過程中,除有益菌外,還有許多腐敗雜菌的存在,從而會導致所生產(chǎn)的酸漿豆腐貨架期短[9]。若將酸漿的生產(chǎn)由自然發(fā)酵改為純種發(fā)酵,將會解決以上兩方面的問題。

本研究是利用豆腐生產(chǎn)后剩余的黃漿水加適量碳源為培養(yǎng)基[10],通過平板涂布法從自然發(fā)酵黃漿水中分離乳酸菌,再以pH為指標篩選出pH較低的菌株利用高效液相色譜法(HPLC)測菌株發(fā)酵液的乳酸量,最終篩選出產(chǎn)乳酸能力強的菌株,對其進行形態(tài)學觀察,生理生化實驗以及16S rDNA序列分析鑒定其菌種,然后用該菌種進行純種發(fā)酵制作成豆腐凝固劑進行點制豆腐,以感官評分為指標,與自然發(fā)酵酸漿點制的豆腐進行比較[11],分析兩種豆腐的優(yōu)缺點,旨在研究本文所篩菌株是否可以作為新型酸漿豆腐凝固劑進行推廣使用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

食品級大豆 錦州新瑪特超市;黃漿水 酸漿豆腐制作過程中的副產(chǎn)物,實驗室自制;黃漿水培養(yǎng)基 新鮮黃漿水添加2%葡萄糖;黃漿水固體培養(yǎng)基 黃漿水培養(yǎng)基添加2%瓊脂;AxyPrep細菌基因組DNA小量制備試劑盒 Axygen,AP-MN-BT-GDNA-50;DNA凝膠回收試劑盒 上海桑尼生物科技有限公司;TaqDNA 聚合酶 上海桑尼生物科技有限公司;DNAmarker 上海桑尼生物科技有限公司。

FA2104N型分析天平 蘭州中西儀器;BOXUN立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;JB-VS-1300超凈工作臺 金壇市鑫鑫實驗儀器廠;DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 蘇州佳寶凈化工程設備有限公司;PHS-3B精密pH計 上海雷磁儀器廠;YH-3880樂創(chuàng)多功能料理機 錦州新瑪特超市;數(shù)碼生物顯微鏡 OLYMPUS;720型Thermal Cycler PCR儀、3730-XL型測序儀 美國ABI公司；5804R型離心機 Eppendorf公司；Tanon2500凝膠成像系統(tǒng) 天能公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗黃漿水的制備 首先在實驗室以醋酸為凝固劑點制豆腐,留壓制豆腐后剩余的黃漿水200 mL,加2%葡萄糖,調pH6.0,37 ℃自然發(fā)酵72 h左右,待黃漿水pH降至3.8以下時為一代酸漿,由于一代酸漿未接種,酸漿在自然發(fā)酵過程中其內菌種生長緩慢,故達到點豆腐所需酸度時間較長,后續(xù)實驗黃漿水均發(fā)酵24 h。以一代酸漿為豆腐凝固劑點制豆腐,留壓制豆腐后剩余的黃漿水200 mL,加2%葡萄糖,調pH6.0,接種3%一代酸漿,37 ℃自然發(fā)酵24 h為二代酸漿。以二代酸漿為豆腐凝固劑點制豆腐,留壓制豆腐后剩余的黃漿水200 mL,加2%葡萄糖,調pH6.0,接種3%二代酸漿,37 ℃自然發(fā)酵24 h為三代酸漿,如此可以消除醋酸對后續(xù)實驗的影響[12]。三代后的酸漿即可作為本實驗所用的豆腐凝固劑,用三代后的酸漿點制豆腐后剩余的黃漿水即為本實驗所用的黃漿水。自制黃漿水pH在5.4～5.8之間,在大豆蛋白的等電點附近,蛋白質含量在0.9%～1.5%之間。

1.2.2 菌株篩選

1.2.2.1 初篩 采用平板涂布法,分離純化樣品中的細菌。將樣品以3%的接種量接入黃漿水培養(yǎng)基中進行富集培養(yǎng),37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。然后將富集培養(yǎng)的菌液稀釋成10-1～10-77個梯度,各取10-5、10-6、10-7三個稀釋梯度樣品的0.1 mL涂布到含有2% CaCO3的黃漿水固體培養(yǎng)基[13]上,37 ℃恒溫發(fā)酵48 h。挑取溶鈣圈較大的菌落在滅菌后的黃漿水固體培養(yǎng)基上劃線分離,于37 ℃培養(yǎng)48 h,如此反復劃線分離2～3次,顯微鏡觀察各菌落形態(tài),直到確定為單菌落后編號[14]。

1.2.2.2 復篩 將編好號的菌株接種到黃漿水培養(yǎng)基中37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后,分別測各菌株的pH和產(chǎn)乳酸量。選擇pH較低的三株菌,利用HPLC法測其乳酸產(chǎn)量,選擇乳酸產(chǎn)量最多的一株菌進行革蘭氏染色,在顯微鏡下觀察菌體形態(tài),記錄結果。

1.2.2.3 產(chǎn)乳酸量的測定 用HPLC[15]法測定,色譜分析條件:色譜柱為WondaSil C18-WR(250 mm×4.6 mm,5 μL),色譜條件為:檢測波長210 nm,流動相為乙腈∶pH2.0磷酸=10∶90,柱溫為35 ℃,進樣量10 μL,流速0.8 mL/min。流動相配制好后分別過0.45 μm濾膜待用。乳酸標準品制備:經(jīng)過預實驗后,將標準品稀釋到0.5、1、2、3、4 mg/mL五個梯度,4 ℃保存。樣品處理:將樣品于50 ℃超聲提取20 min,稀釋10倍后過0.22 μm濾膜待用。

1.2.3 菌株鑒定

1.2.3.1 生理生化實驗 參照《伯杰細菌鑒定手冊》[16],對篩選出的菌株進行常規(guī)生理生化鑒定,包括觀察菌體運動性實驗、過氧化氫酶實驗、硫化氫實驗、硝酸鹽還原實驗、明膠液化實驗以及各種糖發(fā)酵實驗等。

1.2.3.2 16S rDNA鑒定 細菌基因組DNA的提取:采用CTAB 法提取供試菌株基因組DNA。

細菌基因組PCR擴增:引物設計:27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,1492R:5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。PCR擴增反應體系(50 μL):上下游引物各1.5 μL,基因組DNA(20 ng/μL)1 μL,10×Buffer 5 μL,dNTP 1 μL,超純水39 μL,Taq聚合酶 1 μL。確定PCR 擴增反應程序:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸1.5 min,循環(huán)35次;72 ℃終延伸7 min,4 ℃保溫。反應完成后,取3 μL PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂凝膠電泳檢測,確認PCR擴增片段。PCR產(chǎn)物的回收:PCR產(chǎn)物用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒回收,具體操作按試劑盒說明書進行。序列測定:取各個菌種純化后的PCR產(chǎn)物,使用測序儀ABI3730-XL進行DNA測序。序列分析:用 NCBI Blast 程序將拼接后的序列文件與NCBI ribosomal RNA sequence(Bacteria and Archaea)數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比對,得到與待測菌種序列相似性最大的菌種信息,即為16S rDNA的鑒定結果[17-18]。

1.2.4 菌株YQ336作為豆腐凝固劑的應用

1.2.4.1 純種豆腐凝固劑的制作 將菌種YQ336接種于黃漿水培養(yǎng)基中37 ℃恒溫發(fā)酵24 h,即為純種酸漿豆腐凝固劑。

1.2.4.2 豆腐的制作工藝 將食品級大豆25 ℃下蒸餾水浸泡10～16 h,豆水比1∶10打漿,用100目尼龍篩布除渣并收集生豆?jié){,電磁爐煮沸后持沸5 min,當豆?jié){溫度降至80～90 ℃時,輕攪下徐徐加入純種酸漿豆腐凝固劑,直至出現(xiàn)均勻腦花,90 ℃養(yǎng)漿10 min后加熱煮沸1 min,將豆花倒入豆腐模具中1000 Pa壓強下壓制30 min成型[12]。

1.2.4.3 微生物檢驗 分別按GB 4789.2-2010和GB 4789.3-2010方法測純種菌發(fā)酵漿與自然發(fā)酵酸漿的菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)。

1.2.4.4 感官評定 將純種豆腐凝固劑與自然發(fā)酵酸漿點制的豆腐成品進行色香味的粗比較。由10名感官鑒定人員對其色香味按百分制評分[12]。具體方法見表1。

表1 豆腐感官評定表Table 1 Tofu sensory evaluation table

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)標準曲線采用 Excel2007制作,數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 19.0 進行ANOVA單因素方差分析及LSD多重檢驗(p<0.05),數(shù)值以均值±標準差表示,利用Phylip 3.695軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 初篩

經(jīng)過挑取在黃漿水固體培養(yǎng)基上溶鈣圈較大的菌落,對其進行純培養(yǎng),顯微鏡觀察發(fā)酵液中菌體形態(tài),直到確定為單菌落后,共選出10株產(chǎn)酸較多菌株,并進行編號。

2.2 復篩

將初篩選出的10株菌接種于黃漿水培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后,進行pH測定,結果見表2。

由表2可以看出,經(jīng)24 h發(fā)酵后,菌株114、336、116的pH較低,與其他各組菌株pH差異顯著(p<0.05),因此,將這三株菌接種于黃漿水培養(yǎng)基發(fā)酵24 h后,分別對其發(fā)酵液進行乳酸含量的測定,乳酸標準品色譜圖見圖1,乳酸標樣的標準曲線見圖2,三菌株發(fā)酵液乳酸色譜圖見圖3～圖5。

表2 10株菌發(fā)酵24 h的pHTable 2 The pH of 10 strains fermented for 24 h

注:小寫字母不同表示各組之間pH呈顯著性差異(p<0.05)。

圖1 乳酸標準樣品的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of lactic acid standard samples

圖2 乳酸標準樣品的標準曲線Fig.2 Standard curve of lactic acid standard sample

圖3 細菌114發(fā)酵液的乳酸色譜圖Fig.3 Lactic acid chromatogram of bacteria 114 fermentation broth

圖4 細菌116發(fā)酵液的乳酸色譜圖Fig.4 Lactic acid chromatogram of bacteria 116 fermentation broth

圖5 細菌336發(fā)酵液的乳酸色譜圖Fig.5 Lactic acid chromatogram of bacteria 336 fermentation broth

由圖1可以看出,乳酸標樣出峰時間為2.776 min,根據(jù)乳酸標樣各濃度梯度的峰面積做出如圖2所示的標準曲線Y=281.1X-124.4,R2=0.9998,結果表明這種色譜條件下測出的乳酸線性關系很好。根據(jù)三株菌色譜圖的峰面積計算出其產(chǎn)乳酸量見表3。

表3 三株菌發(fā)酵液的乳酸含量Table 3 The lactic acid content of fermentation broth of three strains

注:小寫字母不同表示各組之間產(chǎn)乳酸量呈顯著差異(p<0.05)。

從表3可以看出,菌株336的產(chǎn)乳酸量顯著高于其他兩株菌，為24.48 g/L,是劉冬梅[19]等人測定干酪乳桿菌在泡菜液中發(fā)酵24 h后產(chǎn)乳酸量13.64 g/L的1.79倍。

2.3 形態(tài)特征

通過油鏡觀察,菌株336大小為(0.7～1.1 μm)×(2.0～4.0 μm),呈桿狀或長桿狀,細胞分裂后的排布方式為鏈狀,革蘭氏染色結果為陽性,無芽孢,不運動,其菌落大小為1～3 mm,呈乳白色圓形低凸不透明,邊緣整齊,表面光滑有光澤。菌株形態(tài)特征見圖6,菌株鏡檢特征見圖7。

圖6 菌株336的菌落特征Fig.6 The colony characteristics of strain 336

圖7 菌株336的革蘭染色形態(tài)(100×)Fig.7 Gram stain morphology of strain 336(100×)

2.4 生化實驗結果

參照《伯杰細菌鑒定手冊》,菌株336的生理生化鑒定結果見表4。

從表4可以看出,菌株336不運動,不含過氧化氫酶,不能產(chǎn)生硫化氫,不能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽,不能分解明膠,15～45 ℃范圍內均能生長,能利用大多數(shù)糖進行發(fā)酵。

表4 菌株生理生化特性Table 4 Strain physiological and biochemical characteristics

注:+:陽性;-:陰性。

2.5 16S rDNA鑒定

原核生物的核糖體DNA有23S、16S和5S 3種,由于16S rDNA 的信息量大,序列大小適中(15 kbp),因而被選為生物進化過程的標尺,用于生物的系統(tǒng)分類,是目前所知系統(tǒng)發(fā)育研究中最好的標記。目前,細菌學家普遍認為,當16S rDNA 序列同源性高于97%時,可以認為是屬內的同種[20]。

經(jīng)16S rDNA鑒定,菌株336的16S rDNA序列全長為1483 bp,經(jīng)Genbank比對與Lactobacilluscasei相似性達到99%。利用Phylip 3.695軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹,菌株YQ336與Lb.caseiNR_113333.1親緣關系最近,結果如圖8所示。

圖8 利用 16S rDNA序列進行構建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence

結合其菌體的群體形態(tài)特征、個體形態(tài)特征、生理生化實驗結果及菌株的16S rDNA 序列比對,確定細菌336為干酪乳桿菌,命名為LactobacilluscaseiYQ336,現(xiàn)已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏編號為CGMCC No. 12796。

2.6 純種菌發(fā)酵漿與自然發(fā)酵酸漿點豆腐品質的比較

2.6.1 微生物檢驗 自然發(fā)酵酸漿的微生物檢驗結果為細菌總數(shù)6.4×109cfu/mL,大腸菌群檢出為4 cfu/100 mL。純種發(fā)酵酸漿的微生物檢驗結果為細菌總數(shù)5.2×109cfu/mL,大腸菌群未檢出。

2.6.2 感官評價 10名感官鑒定人員對兩種豆腐的色、香、味進行評分,結果見表5。

表5 兩種豆腐的感官評分Table 5 The sensory evaluation scores of the two tofu types

注:小寫字母不同表示同行感官評分之間差異顯著(p<0.05)。

由表5可知,用兩種酸漿點制出的豆腐其色澤均偏白,有明顯豆香味無明顯酸味,塊形完整軟硬適宜,質地較細膩,較有彈性表面不粘,細膩爽滑彈性好,斷面整齊表面光滑。純菌發(fā)酵酸漿點制的豆腐總感官評分結果略高于自然發(fā)酵酸漿點制的豆腐,但是兩種豆腐的各項感官評分結果均無顯著差異(p>0.05)。說明純種酸漿發(fā)酵豆腐既擁有傳統(tǒng)酸漿豆腐獨特的色香味,又無有害菌存在,綠色健康,保質期更長,可以作為新型酸漿豆腐凝固劑并廣泛使用。

3 結論

利用黃漿水添加少量葡萄糖為培養(yǎng)基,通過平板涂布法和高效液相色譜法,經(jīng)過初篩、復篩、菌落形態(tài)觀察、生理生化鑒定以及16S rDNA序列分析等步驟,從自然發(fā)酵豆腐黃漿水中分離純化出一株產(chǎn)乳酸能力強的干酪乳桿菌YQ336,該菌37 ℃恒溫發(fā)酵24 h可產(chǎn)乳酸24.48 g/L,pH可達3.55。然后利用其純種發(fā)酵制成豆腐凝固劑點制豆腐,與自然發(fā)酵酸漿點制的豆腐進行比較,發(fā)現(xiàn)前者感官評分優(yōu)于后者,但差異不顯著(p>0.05)。此外,自然發(fā)酵酸漿中有大腸桿菌和腐敗菌存在[9],導致生產(chǎn)的酸漿豆腐保質期短且存在危害人體健康的隱患,而純種發(fā)酵酸漿不含腐敗菌,經(jīng)過實驗比對,本文篩選出的干酪乳桿菌YQ336純種發(fā)酵酸漿可以作為一種新型豆腐凝固劑并廣泛使用。

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IsolationandidentificationofLactobacilluscaseiintofuacidpulpanditsapplicationastofucoagulant

YEQing1,XUYun-he2,ZHANGLi-li1,*

(1.College of Food Science and Engineering,Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000,China;2.College of Animal Science and Veterinary Medicine,Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000,China)

TS201.3

A

1002-0306(2017)18-0094-06

2017-04-05

葉青(1993-)，女，碩士研究生，研究方向：食品微生物，E-mail：18741650927@163.com。

*通訊作者:張莉力(1977-)，女，博士，副教授，研究方向：食品微生物，E-mail：lilyzhang1977@163.com。

國家自然科學基金項目(31301499)；遼寧省自然科學基金項目(2014022052)；遼寧省自然科學基金項目(2014022046)。

10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.019