張 靖 偉， 姚 英 俊， 梁 媛， 王 晗， 王 際 輝

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

油酸對(duì)C57/BL6J小鼠脂肪干細(xì)胞體外成脂分化的影響

張 靖 偉1， 姚 英 俊2， 梁 媛1， 王 晗2， 王 際 輝2

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

對(duì)C57/BL6J小鼠脂肪干細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物。體外培養(yǎng)條件下，在成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中加入不同濃度的油酸處理小鼠ADSCs 3 d，倒置顯微鏡下觀察ADSCs的形態(tài)變化，油紅O染色觀察胞質(zhì)中脂滴的聚集，并測(cè)定細(xì)胞中甘油三酯總量。結(jié)果表明，誘導(dǎo)3 d后，油酸處理組細(xì)胞胞體顯著增大，形態(tài)由梭形變?yōu)閳A形，胞質(zhì)內(nèi)脂滴顯著增多；油紅O染色細(xì)胞中可見(jiàn)大量紅色的脂滴染色。各濃度油酸處理組細(xì)胞胞漿內(nèi)甘油三酯總量增多，顯著高于對(duì)照組，并呈劑量效應(yīng)關(guān)系。說(shuō)明油酸可促進(jìn)小鼠ADSCs體外成脂分化。

油酸；脂肪干細(xì)胞；成脂分化

Abstract: Adipose-derived stem cells (ADSCs) from C57/BL6J mice were primary cultured and cell surface antigen markers were identificated by flow cytometry. ADSCs were treated with different concentration of oleic acid for 3 d. The morphological changes of ADSCs were observed and the differentiation level was assayed by oil red O staining and cellular triglyceride content was detected to confirm the degree of adipogenic differentiation. The cells increased in volume and lipid droplets in cytoplasm became round after stimulating for 3 d at different oleic acid concentrations. The cellular TG content was significant higher in oleic acid-treated cells than that in control group. The cells treated with oleic acid augmented cellular TG content in a dose dependent manner. The results suggested that oleic acid could promote adipogenic differentiation of C57/BL6J mice adipose-derived stem cellsinvitro.

Keywords: oleic acid; adipose-derived stem cells; adipogenic differentiation

0 引 言

日常膳食中的脂肪酸是一種重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。脂肪酸在攝入人體后可以形成甘油三酯儲(chǔ)存起來(lái)，為人體提供能量。脂肪酸在體內(nèi)還能以磷脂的形式參與細(xì)胞膜系統(tǒng)的組成[1]。此外，部分脂肪酸及其代謝產(chǎn)物具有重要的生物活性，可以參與形成類(lèi)固醇激素等信號(hào)分子來(lái)發(fā)揮重要的生理調(diào)控作用[2]，如調(diào)節(jié)代謝、抗腫瘤以及與肥胖的發(fā)生密切相關(guān)。

肥胖是由多種因素引起的一種慢性代謝疾病[3]。對(duì)于兒童和青少年來(lái)說(shuō)，肥胖的發(fā)生往往伴隨著脂肪細(xì)胞數(shù)目的增多和體積的增大[4]。脂肪細(xì)胞的數(shù)目增多是脂肪前體細(xì)胞成脂分化的結(jié)果，成脂分化在肥胖的發(fā)生過(guò)程中扮演著重要角色。脂肪干細(xì)胞(Adipose-derived stem cells，ADSCs)是一類(lèi)存在于脂肪組織中的干細(xì)胞，Zuk等[5]于2001年首次在人脂肪組織抽提物中發(fā)現(xiàn)。脂肪干細(xì)胞具有容易獲取、增殖迅速和多向分化潛能等明顯優(yōu)勢(shì)，因而被廣泛應(yīng)用于成脂分化研究中[6]。

在組成人體的脂肪酸中，十八碳烯酸是一類(lèi)含量豐富的脂肪酸。在十八碳烯酸中，油酸(順9-十八碳一烯酸)是一種主要的脂肪酸。此外，油酸也同樣廣泛存在于動(dòng)植物來(lái)源的食用油中，是食用油主要的組成成分[7]。目前一些研究結(jié)果表明，油酸可以有效保護(hù)心腦血管系統(tǒng)[8-9]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，與魚(yú)油相比，長(zhǎng)期攝入油酸豐富的橄欖油會(huì)引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肥胖[10]。但是，油酸引起肥胖的作用機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用C57/BL6J小鼠脂肪干細(xì)胞，以不同濃度的油酸干預(yù)脂肪干細(xì)胞成脂分化，探究了油酸對(duì)脂肪干細(xì)胞成脂分化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

8周齡雄性C57/BL6J小鼠，大連醫(yī)科大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

油酸、硬脂酸，美國(guó)Cayman化學(xué)公司；DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液，美國(guó)Thermo Fisher公司；胎牛血清(FBS)，天津?yàn)笊镏破酚邢薰?；MTT、牛胰島素，上海源葉生物科技有限公司；油紅O，美國(guó)Sigma公司；地塞米松，北京索萊寶科技有限公司；吲哚美辛，上海阿拉丁試劑；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)，百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀，Multiskan GO，美國(guó)Thermo Fisher公司；倒置顯微鏡，IX81，日本奧林巴斯公司；流式細(xì)胞儀，F(xiàn)ACSAria Ⅲ，美國(guó)BD。

1.3 方 法

1.3.1 脂肪干細(xì)胞原代培養(yǎng)

脂肪干細(xì)胞的分離操作參考Zuk等[11]的方法并稍加改動(dòng)。取8周齡雄性C57/BL6J小鼠，斷頸法處死，將鼠體浸入75%酒精消毒，無(wú)菌操作下取腹股溝脂肪墊，放在含有2%青鏈霉素的PBS中清洗多次，剔除肉眼可見(jiàn)的筋膜和血管，將組織盡量剪碎，將等體積的0.1%的Ⅰ型膠原酶加入組織塊中，37 ℃下恒溫消化40 min，每隔10 min用膠頭滴管吹打組織塊若干次，最后加入等體積的細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化。400g離心5 min，棄去上層的脂肪細(xì)胞，沉淀物用PBS洗2次，最后用含10%胎牛血清重懸，70 μm細(xì)胞過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾，接種細(xì)胞于T-25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中，每隔3 d更換培養(yǎng)基。

1.3.2 脂肪干細(xì)胞的鑒定

采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞的表面抗原標(biāo)志。待細(xì)胞傳至第三代，用0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，用含有2% CD29和CD34一抗的PBS在4 ℃ 下孵育細(xì)胞30 min。孵育結(jié)束后，用PBS洗細(xì)胞2次，調(diào)整細(xì)胞量至1×106個(gè)/mL，將細(xì)胞用0.2 mL 的PBS重懸，最后用70 μm尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾后上機(jī)分析。

1.3.3 油酸的濃度篩選

收集三代以后的細(xì)胞，在96孔板以1×105個(gè)/孔的密度接種細(xì)胞。待細(xì)胞融合至90%，將細(xì)胞培養(yǎng)基換成含1 μmol/L地塞米松、10 μg/mL胰島素、100 μmol/L吲哚美辛、0.5 μmol/L IBMX、10% FBS的DMEM/F12的成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，分別用20、40、60、80 μmol/L油酸作用細(xì)胞3 d，以同樣濃度的硬脂酸為對(duì)照。誘導(dǎo)3 d 后，每孔加入5 mg/mL的MTT，于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育4 h后吸棄液體，每孔加入150 μL DMSO，靜置10 min后，在酶標(biāo)板中于570 nm下測(cè)量吸光度。

1.3.4 油酸對(duì)脂肪干細(xì)胞的干預(yù)處理

將細(xì)胞接種于96孔板中，待細(xì)胞融合至90%，更換培養(yǎng)基為成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以終濃度為0、20、40、60 μmol/L的油酸干預(yù)脂肪干細(xì)胞分化3 d，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3.5 脂滴油紅O染色

取出終止誘導(dǎo)的細(xì)胞，在每孔中加入適量10%中性甲醛，室溫下固定細(xì)胞30 min。向每孔中加入適量的2%油紅O，室溫下染色15 min。再將各孔加入0.3%的蘇木精染液，室溫下復(fù)染15 min。再向各孔中加入1%碳酸氫鈉返藍(lán)5 min。返藍(lán)結(jié)束后，吸棄各孔碳酸氫鈉溶液，用PBS清洗各孔后，在鏡下觀察細(xì)胞油紅O染色程度。

1.3.6 胞質(zhì)甘油三酯含量的測(cè)定

按照“1.3.4”的方法，用脂肪酸干預(yù)細(xì)胞成脂分化3 d，每孔中加入100 μL的SDS細(xì)胞裂解液，收集細(xì)胞，在冰上進(jìn)行超聲裂解(38 W，2 s/次，2 min)。按照甘油三酯測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作，37 ℃下孵育5 min，546 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。用甘油標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)所測(cè)樣品的吸光度，計(jì)算樣品甘油三酯的實(shí)際濃度。

1.3.7 細(xì)胞總蛋白測(cè)定

按照BCA法測(cè)定總蛋白試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法，將各試劑和樣品混合，37 ℃下孵育30 min，在562 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度。作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)所測(cè)樣品的吸光度，計(jì)算樣品蛋白的實(shí)際濃度。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，應(yīng)用SPSS 22.0對(duì)多組均數(shù)進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)胞鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)觀察

如圖1所示，從脂肪組織分離接種的細(xì)胞3 d后貼壁呈纖維細(xì)胞樣，培養(yǎng)7 d后細(xì)胞達(dá)到80%以上融合。經(jīng)過(guò)若干次傳代后細(xì)胞仍為梭形，增殖迅速，生長(zhǎng)排列呈漩渦狀，部分細(xì)胞集落出現(xiàn)層疊交錯(cuò)生長(zhǎng)，未出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明，分離出的細(xì)胞符合脂肪干細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征。

圖1 C57/BL6J小鼠脂肪干細(xì)胞Fig.1 Adipose-derived stem cells of C57/BL6J mice

2.1.2 細(xì)胞表面抗原標(biāo)志鑒定

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，分離出的細(xì)胞高表達(dá)CD29，未表達(dá)CD34。說(shuō)明分離出的細(xì)胞表面抗原標(biāo)志符合脂肪干細(xì)胞的表面標(biāo)志特征。

(a) CD29直方圖

(b) CD34直方圖

(c) CD29散點(diǎn)圖

(d) CD34散點(diǎn)圖

圖2 細(xì)胞表面抗原標(biāo)志鑒定

Fig.2 Identification of cell surface marker

2.2 脂肪酸濃度的篩選

應(yīng)用MTT法確定合適的脂肪酸作用濃度，結(jié)果如圖3所示，在20、40、60 μmol/L的油酸濃度作用下，各濃度組間吸光度沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，但在80 μmol/L，吸光度有顯著下降(P<0.01)；在相同濃度的硬脂酸作用下，各濃度組間吸光度有顯著差異(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，油酸在20、40、60 μmol/L下，對(duì)分化期間的細(xì)胞沒(méi)有毒性作用；相同濃度的硬脂酸對(duì)分化細(xì)胞的有毒性作用，并且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。

圖3 油酸和硬脂酸對(duì)細(xì)胞活力的影響Fig.3 Effects of oleic acid and stearic acid on cell viabilities

2.3 油酸濃度對(duì)脂肪干細(xì)胞成脂分化的影響

在細(xì)胞分化的過(guò)程中，用不同濃度(20、40、60 μmol/L) 的油酸分別作用細(xì)胞3 d，應(yīng)用油紅O染色觀察細(xì)胞的成脂分化情況，結(jié)果如圖4所示。與未分化的細(xì)胞相比，處于分化階段的細(xì)胞胞體變大，開(kāi)始變圓，胞質(zhì)中開(kāi)始出現(xiàn)明顯的脂滴。經(jīng)過(guò)油酸處理后，胞質(zhì)中的脂滴顯著多于未經(jīng)油酸處理的細(xì)胞。隨著油酸濃度的增加，胞質(zhì)中脂滴的含量也隨之增加。油紅O染色結(jié)果表明，油酸能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞胞漿中脂質(zhì)的積累，促進(jìn)細(xì)胞成脂分化。

2.4 油酸對(duì)胞質(zhì)內(nèi)甘油三酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

以甘油三酯占細(xì)胞總蛋白的質(zhì)量摩爾濃度對(duì)細(xì)胞成脂分化程度進(jìn)行定量。如圖5所示，與油紅O染色的結(jié)果相似，經(jīng)過(guò)油酸處理后的細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)甘油三酯含量顯著提高，并呈現(xiàn)劑量效應(yīng)。與未處理組相比，油酸處理3 d后，20、40、60 μmol/L 濃度下的細(xì)胞胞漿內(nèi)甘油三酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別提高了95.9%、294.7%和341.2%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明，油酸能夠顯著促進(jìn)脂肪干細(xì)胞體外成脂分化，并呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。

圖5 油酸濃度對(duì)細(xì)胞中甘油三酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

Fig.5 Effect of oleic acid concentration on TG accumulation during cell differentiation

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)原代培養(yǎng)，獲得了可以穩(wěn)定傳代的脂肪干細(xì)胞，并在成脂分化期間用不同濃度的油酸處理脂肪干細(xì)胞，通過(guò)油紅O染色和胞內(nèi)甘油三酯測(cè)定法分析發(fā)現(xiàn)油酸可以在體外顯著地促進(jìn)脂肪干細(xì)胞成脂分化，并且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系，提示大量攝入油酸可能與肥胖有關(guān)。

脂肪細(xì)胞分化是一個(gè)由眾多轉(zhuǎn)錄因子參與的過(guò)程[14-17]。其中過(guò)氧化物酶體增殖激活受體γ(PPARγ) 是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，具有很強(qiáng)的脂肪細(xì)胞專(zhuān)一性，若被激活，則會(huì)發(fā)生強(qiáng)烈的成脂分化作用[18]。有文獻(xiàn)證實(shí)，棕櫚油酸可以以通過(guò)激活PPARγ來(lái)促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂分化[19]。此外，一些脂肪酸可以作為信號(hào)分子對(duì)Wnt/β-catenin[20]和Notch[21]等與成脂分化相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控來(lái)發(fā)揮相應(yīng)的作用。因此，油酸是否能夠通過(guò)激活PPARγ和調(diào)控上述相關(guān)信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)脂肪干細(xì)胞成脂分化有待進(jìn)一步研究。

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EffectofoleicacidonadipogenicdifferentiationofC57/BL6Jmiceadipose-derivedstemcellsinvitro

ZHANG Jingwei1, YAO Yingjun2, LIANG Yuan1, WANG Han2, WANG Jihui2

( 1.School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China；2.School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

TS201.4

A

1674-1404(2017)05-0333-05

2016-03-21.

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31371764, 31370554)；遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014026016).

張靖?jìng)?1989-)，男，碩士研究生；通信作者：王 晗(1972-)，女，副教授.

張靖?jìng)?姚英俊,梁媛,王晗,王際輝.油酸對(duì)C57/BL6J小鼠脂肪干細(xì)胞體外成脂分化的影響[J]. 大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2017,36(5):333-337.

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