張 璐， 邢 德 峰， 蔣 青 青， 孫 睿， 任 南 琪

( 哈爾濱工業(yè)大學 市政環(huán)境工程學院， 黑龍江 哈爾濱 150090 )

不同pH下瘤胃液中纖維素降解產(chǎn)氫菌群的性能

張 璐， 邢 德 峰， 蔣 青 青， 孫 睿， 任 南 琪

( 哈爾濱工業(yè)大學 市政環(huán)境工程學院， 黑龍江 哈爾濱 150090 )

為了提高纖維素類有機質(zhì)的降解率并了解牛瘤胃內(nèi)微生物的種類及功能，從瘤胃液中以不同初始pH為基礎定向培育穩(wěn)定高效的降解群落，利用PCR-DGGE技術(shù)對菌落結(jié)構(gòu)及菌種功能進行分析。結(jié)果表明，該菌群對以5 g/L微晶纖維素為碳源的發(fā)酵液的利用率最高，達到83%；在pH 6.5時獲得了較高的產(chǎn)氫量(178.2 mL/L)，此降解效率及產(chǎn)氫量均高于已報道的纖維素降解菌群。對群落結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，傳代馴化4次后群落結(jié)構(gòu)基本穩(wěn)定，此群落中含有的菌種主要包括：具有纖維素降解功能的瘤胃菌(Ruminococcaceae)，具有產(chǎn)氫能力細桿菌(Anaerofilum)以及降解纖維素并產(chǎn)生氫氣的腸球菌(Enterococcus)、梭菌類(Clostridium)和腸桿菌(Enterobactercloacae)。

纖維素降解；瘤胃液；產(chǎn)氫菌群

Abstract: A stable and efficient degradation community was developed based on different initial pH to improve the degradation rate of cellulose and study types and function of bovine rumen microorganisms. The structure and function of bacteria were analyzed by PCR-DGGE. The result showed that the utilization rate of fermentation broth with 5 g/L microcrystalline cellulose as carbon source could reach to the maximum of 81.3%. The hydrogen production at pH 6.5 could reach to 178.2 mL/L. Its degradation rate and hydrogen production were higher than those reported in cellulose degrading bacteria. The community structure analysis showed that it was basically stable after 4 times of domestication. The community is consist of cellulolytic bacteria such asRuminococcaceae, hydrogen producers such asAnaerofilum,Enterococcus,ClostridiumandEnterobactercloacaeproducing H2from cellulose.

Keywords: cellulose degradation; rumen fluid; hydrogen-producing bacteria flora

0 引 言

生物制氫是一種利用微生物代謝產(chǎn)生氫氣的可持續(xù)能源技術(shù)[1]，其中一種方式是使用廉價的可再生原料以降低產(chǎn)氫的成本。纖維素是地球上分布最廣、含量最豐富的碳水化合物，降解纖維素生產(chǎn)可再生能源已成為近年來生物質(zhì)研究方向的熱點[2]。纖維素的晶體結(jié)構(gòu)極其復雜有序，使得其很難溶解和降解。與物理和化學方法相比，生物的方法具有減少環(huán)境污染和降低成本的優(yōu)點。瘤胃微生物具有較高的纖維素分解活性且廢棄物可轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性脂肪酸(VFA)或氣體的優(yōu)點，因此，構(gòu)建穩(wěn)定高效的瘤胃纖維素降解菌具有重要的研究意義。

目前，對于產(chǎn)氫細菌的篩選主要借助傳統(tǒng)的微生物篩選方法，即采用特定的底物對菌源進行富集，再利用厭氧技術(shù)逐步純化分離獲得純種。厭氧菌分解纖維素體系復雜，需要多種酶的協(xié)同作用。許多菌株產(chǎn)生的酶活性較低，且不能產(chǎn)生所有種類的纖維素酶，因此單純通過微生物培養(yǎng)難以完全降解纖維素原材料。另一方面，代謝過程中，促進降解的協(xié)同作用不僅包括不同的纖維素降解菌之間纖維素酶的協(xié)同，還包含了纖維素降解菌和其他非纖維素降解菌之間的共同協(xié)作[3]。本研究利用富集培養(yǎng)對不同初始pH下的瘤胃液進行傳代馴化，并對其過程中的發(fā)酵效能及群落結(jié)構(gòu)進行了分析研究，以期為獲得穩(wěn)定高效的纖維素降解菌群提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

菌種采自哈爾濱郊區(qū)某屠宰場新鮮宰殺的水牛胃取出裝入無菌瓶中，4 ℃厭氧保存，快速運往實驗室。

富集培養(yǎng)基：NH4Cl，1 g/L；NaCl，1 g/L；K2HPO4，1 g/L；KH2PO4，1 g/L；半胱氨酸，0.5 g/L；MgCl2·6H2O，0.5 g/L；KCl，0.2 g/L；微晶纖維素，5 g/L；酵母粉，2 g/L；蛋白胨，2 g/L；微量金屬元素貯液，1 mL/L；維生素貯液，1 mL/L；0.1%刃天青，1 mL/L；磷酸緩沖液，50 mmol/L。微量金屬元素貯液及維生素貯液成分參考文獻[4]。

1.2 方 法

1.2.1 纖維素降解產(chǎn)氫菌的富集

將4.0～6.0 g菌源樣品放入裝有玻璃珠的滅菌血清瓶中，以140 r/min在37 ℃恒溫搖床中培養(yǎng)6～8 h。取10 mL懸濁液至葡萄糖為碳源的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～6 d。以結(jié)晶纖維素為底物，在不同初始pH下對混合溶液進行厭氧富集培養(yǎng)，富集培養(yǎng)2 d后轉(zhuǎn)接至50 mL新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，選擇纖維素降解效果較好的富集菌液轉(zhuǎn)接幾次以獲取高效穩(wěn)定的纖維素降解菌群。

1.2.2 DNA提取

取對數(shù)生長期中層液體2 mL，離心收集菌體進行基因組DNA提取，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 變性梯度凝膠電泳

1.2.3.1 PCR擴增16S rRNA基因

按文獻[5]的方法進行變形梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)擴增。取PCR樣品6 μL和10×loading buffer混合均勻緩慢加入上樣孔。加樣后在電壓75 V下60 ℃ 運行12 h。染色后的凝膠樣品經(jīng)UMAX PowerLook 1000透射掃描儀成像，并在凝膠成像圖上按順序標注優(yōu)勢條帶。

1.2.3.2 目的基因的克隆和測序

采用小量膠回收試劑盒回收凝膠中標記的DNA優(yōu)勢條帶，將膠回收的DNA用pMD19-T Vector試劑盒連接。對連接轉(zhuǎn)化后菌落進行藍白斑篩選，挑取4個白色單菌落，利用通用引物M13(-47)和M13(-48)對樣品進行PCR反應[9]。產(chǎn)物采用0.8%的瓊脂糖進行凝膠電泳，含有目的基因的陽性轉(zhuǎn)化子送至上海生工生物工程有限公司采用ABI 3730測序儀進行測序。

1.2.4 產(chǎn)物的測定方法

1.2.4.1 微晶纖維素質(zhì)量分數(shù)的測定

將不同時期的混合溶液在3 000 r/min下離心，沖洗多次去除菌體后離心，烘干后測定剩余纖維素質(zhì)量分數(shù)。

1.2.4.2 氫氣體積分數(shù)的測定

利用GC-122型氣相色譜儀對氣體成分進行測定。色譜柱為2 m不銹鋼柱，內(nèi)部是分子篩填料(Alltech Molesieve 5A 60/80)，采用熱導池作為檢測器。以氮氣作為載氣測定氫氣的體積分數(shù)，氣體體積流量在測定過程中為70 mL/min。柱溫、進樣器和檢測器溫度分別為110、205和300 ℃。樣品進樣量為200 μL，氫氣體積分數(shù)根據(jù)外標法進行計算。

1.2.4.3 液相末端產(chǎn)物的測定

液相末端產(chǎn)物中主要含有各種揮發(fā)酸及乙醇等。將發(fā)酵液樣品在10 000 r/min下離心10 min，取上清液，用0.22 μm濾膜過濾，取1 mL樣品加入色譜瓶中后，加入30 μL甲酸酸化，混合均勻后取2 μL樣品采用安捷倫GC-7890氣相色譜測定液相末端產(chǎn)物成分及含量，以氮氣作為載氣，體積流量為60 mL/min，控制氫火焰檢測器、汽化室、色譜柱室溫度分別為185、220和185 ℃。1.2.4.4 可溶性還原糖含量的測定

還原糖含量采用3，5-二硝基水楊酸比色法進行測定[6]，繪制標準曲線。取波長540 nm在分光光度計上進行比色。所測標準曲線公式為y=0.739x+0.331 2，R2=0.999 4。

2 結(jié)果與討論

2.1 初始pH對富集產(chǎn)氫菌群結(jié)構(gòu)的影響

采用磷酸鹽緩沖液穩(wěn)定發(fā)酵液中的pH，將發(fā)酵液維持在比較適于微生物菌體生長的溶液酸堿度內(nèi)，此方法能有效減弱樣品在發(fā)酵過程中由于溶液pH的不穩(wěn)定而對產(chǎn)氫菌群造成不必要的影響。

2.1.1 纖維素降解產(chǎn)氫菌的傳代

采用每隔48 h傳代一次的方式進行傳代。研究表明，纖維素降解開始的標志是氣體的產(chǎn)生以及黃色素的生成[7]。從圖1中可以看出，在發(fā)酵代謝過程中，微晶纖維素逐漸變?yōu)辄S色，這主要是由于有一些生黃瘤胃細菌R.flavefaciens的出現(xiàn)[8]。隨著發(fā)酵的進行，發(fā)酵液逐漸渾濁，白色的微晶纖維素幾乎全部代謝完全。

2.1.2 基于PCR-DGGE的產(chǎn)氫菌群結(jié)構(gòu)

瘤胃內(nèi)的微生物群落具有很復雜的結(jié)構(gòu)，利用變性梯度凝膠電泳對微生物群落結(jié)構(gòu)在傳代轉(zhuǎn)接過程中的變化進行動態(tài)解析。如圖2所示，富集菌群傳代到第4次時，每種發(fā)酵液中的微生物群落都已基本達到相對穩(wěn)定。在不同初始pH的發(fā)酵體系中，微生物的群落結(jié)構(gòu)之間存在很大的差異。

圖1 初始溶液pH 6.5時混合發(fā)酵0～48 h 的菌群

Fig.1 Fermentation of mixed bacteria from 0 to 48 h at initial pH of 6.5

圖2 不同初始pH下富集培養(yǎng)纖維素產(chǎn)氫菌群落16S rRNA的DGGE圖譜Fig.2 DGGE profiles of 16S rRNA in the microbial communities at different initial pH

2.1.3 PCR-DGGE條帶信息比對及功能分析

將所得條帶的克隆測序結(jié)果利用Blast軟件進行基因序列比對分析，獲得了各條帶最相近的微生物種屬信息，結(jié)果如表1所示。條帶1、9、13所指代的種群始終存在于各個不同的群落體系中，與之最相近的是擬桿菌(Bacteroidesgraminisolvens)[9]的部分基因，該菌屬是從處理牛糞的產(chǎn)甲烷反應器中分離出來的，它是能夠利用包括木聚糖、木糖、纖維二糖在內(nèi)的多種有機質(zhì)的厭氧菌。與條帶3、10相近的細桿菌(Anaerofilum)是依賴氫化酶中的鐵氫化酶為主要產(chǎn)氫功能酶的厚壁厭氧菌[10]。pH為5.5時，較明顯的條帶4為真桿菌(Eubacterium)[11]，是一種可以廣泛利用碳源進行嚴格厭氧發(fā)酵并產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸的異養(yǎng)菌。pH為6.0中的明顯優(yōu)勢條帶5、6是腸球菌(Enterococcus)，該菌種不但可以發(fā)酵產(chǎn)氫，還能夠降解纖維素[12]。同時具有利用纖維素為底物降解，并且產(chǎn)氫氣的還有條帶8、14、19、20所代表的梭菌類(Clostridium)[13]，以及能夠利用多種有機底物產(chǎn)氫的腸桿菌(Enterobactercloacae)[14](條帶11)。圖譜中還有一些具有單一功能的菌種，例如利用糖蜜發(fā)酵產(chǎn)氫的乳桿菌(Lactobacillales)[15](條帶16)以及富含β-1，4木聚糖內(nèi)切酶和纖維素酶[16]，能夠降解纖維素的瘤胃菌(Ruminococcaceae)(條帶12)。

表1 與優(yōu)勢條帶序列的DGGE條帶具有最大相似性的種屬Tab.1 Most closely related bacterial species and strains with DGGE bands in predominant bands

2.2 不同初始pH下的富集產(chǎn)氫菌群發(fā)酵效能

以微晶纖維素為唯一碳源富集的微生物經(jīng)多次轉(zhuǎn)接馴化，并測定各初始pH轉(zhuǎn)接過程中的微生物的代謝特性。

2.2.1 不同初始pH下連續(xù)富集纖維素降解產(chǎn)氫群落的末端pH

從表2可以看出，緩沖液的加入使溶液的pH變化得到了有效控制，其pH基本穩(wěn)定在弱酸環(huán)境，非常適宜瘤胃中的功能菌群，可以降低由于發(fā)酵產(chǎn)物如揮發(fā)酸的產(chǎn)生導致pH大幅變化，給微生物帶來代謝抑制作用。

表2 不同初始pH條件下連續(xù)富集產(chǎn)氫群落的末端pH

Tab.2 Terminal pH of hydrogen-producing microbial communities enriched continuously at different initial pH

傳代次數(shù)初始pH5.56.06.57.07.5Ⅰ6.516.626.486.747.21Ⅱ6.406.546.516.587.34Ⅲ6.356.426.446.627.29Ⅳ6.316.446.456.427.14

2.2.2 不同初始pH下連續(xù)富集纖維素降解產(chǎn)氫群落的產(chǎn)糖量及產(chǎn)氫量

由于初始酸堿度的不同，不同群落的優(yōu)勢菌群差別各異產(chǎn)生了差異性較大的代謝方式。由于在較高的pH下出現(xiàn)了如Ruminococcaceaebacterium一類降解纖維素的瘤胃菌，因此出現(xiàn)了糖類的累積。而對于pH較低情況下出現(xiàn)的一些產(chǎn)氫菌如Enterococcus、Enterobacter，還原糖得到了很好的利用，因此剩余量較少。

表3 不同初始pH條件下連續(xù)富集產(chǎn)氫群落的產(chǎn)糖量及產(chǎn)氫量

Tab.3 Production of reducing sugar and hydrogen of microbial communities at different initial pH

傳代次數(shù)初始pH5.56.06.57.07.5ρ(產(chǎn)糖)/(g·L-1)Ⅰ0.0790.0950.0980.6111.498Ⅱ0.1350.1250.1071.0921.542Ⅲ0.1970.1470.0320.7621.298Ⅳ0.3270.1540.0240.9451.162φ(產(chǎn)氫)/(mL·L-1)Ⅰ75.6115.9157.2131.128.8Ⅱ35.498.9174.3126.222.9Ⅲ59.7140.7162.794.530.4Ⅳ66.3148.6178.2118.532.7

2.3 穩(wěn)定菌群的底物發(fā)酵利用比較

如圖3所示，微生物群落在初始pH為6.5時，具有最好的纖維素降解率81.3%。經(jīng)過傳代培養(yǎng)，菌群已具備穩(wěn)定高效的降解功能，在發(fā)酵液pH 6.0～7.0檢測到如Enterococcus、Enterobacter、Ruminococcaceae等具有纖維素降解功能的菌種，因此降解效率較高。

圖3 不同初始pH下的纖維素降解率Fig.3 Cellulose degradation rate at different initial pH

3 結(jié) 論

本實驗對不同初始pH下的瘤胃液進行定向培養(yǎng)，在富集培養(yǎng)4次后微生物群落結(jié)構(gòu)基本穩(wěn)定，但不同群落中的優(yōu)勢菌群差異很大。在初始pH為6.5時，產(chǎn)氫量和纖維素降解率均較高，氫氣產(chǎn)量可達到178.2 mL/L培養(yǎng)基，降解率為81.3%；pH為7.5時獲得了較高產(chǎn)糖量(1.162 g/L)。結(jié)果表明，富集的群落中含有多種功能菌屬，包括降解纖維素的擬桿菌、瘤胃菌；發(fā)酵產(chǎn)氫的細桿菌、乳桿菌以及降解纖維素同時產(chǎn)生氫氣的腸球菌、梭菌和腸桿菌。

[1] ZHANG L, CHUNG J S, REN N Q, et al. Effects of the ecological factors on hydrogen production and [Fe-Fe]-hydrogenase activity inEthanoligenensharbinenseYUAN-3[J]. International Journal of Hydrogen Energy, 2015, 40(21): 6792-6797.

[2] WYMAN C E, SPINDLER D D, GROHMANN K. Simultaneous saccharification and fermentation of several lignocellulosic feedstocks to fuel ethanol[J]. Biomass and Bioenergy, 1992, 3(5): 301-307.

[3] LEWIS S M, MONTGOMERY L, GARLEB K A, et al. Effects of alkaline hydrogenperoxide treatment on in vitro degradation of cellulosic substrates by mixed ruminal microorganisms andBacteroidessuccinogenesS85[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1988, 54(5): 1163-1169.

[4] 孫云章,毛勝勇,姚文,等.瘤胃厭氧真菌和細菌對木質(zhì)素含量不同底物的發(fā)酵特性[J].福建農(nóng)林大學學報(自然版),2007,36(4):392-395.

[5] 許繼飛.同步代謝秸稈木糖和葡萄糖的產(chǎn)氫新菌種及其產(chǎn)氫特性[D].哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學,2010.

[6] MILLER G L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar[J]. Analytical Chemistry, 1959, 31(3): 426-428.

[7] 陳曉倩,殷浩文.微生物群落多樣性分析方法的進展[J].上海環(huán)境科學，2003，22(3):213-217.

[8] 曹廣麗.高效利用玉米秸稈的產(chǎn)氫菌種及其產(chǎn)氫性能研究[D].哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學,2010.

[9] NISHIYAMA T, UEKI A, KAKU N, et al.Bacteroidesgraminisolvenssp. nov., a xylanolytic anaerobe isolated from a methanogenic reactor treating cattle waste[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2009, 59(8): 1901-1907.

[10] MOHAN S V, AGARWAL L, MOHANAKRISHNA G, et al. Firmicutes with iron dependent hydrogenase drive hydrogen production in anaerobic bioreactor using distillery wastewater[J]. International Journal of Hydrogen Energy, 2011, 36(14): 8234-8242.

[11] NGUYEN T A D, HAN S J, KIM J P, et al. Hydrogen production by the hyperthermophilic eubacterium,Thermotoganeapolitana, using cellulose pretreated by ionic liquid[J]. International Journal of Hydrogen Energy, 2008, 33(19): 5161-5168.

[12] PéREZ C C, REYE C J, CELIS L B, et al. Inoculum pretreatment promotes differences in hydrogen production performance in EGSB reactors[J]. International Journal of Hydrogen Energy, 2015, 40(19): 6329-6339.

[13] ZHANG J N, LI Y H, ZHENG H Q, et al. Direct degradation of cellulosic biomass to bio-hydrogen from a newly isolated strainClostridiumsartagoformeFZ11[J]. Bioresource Technology, 2015, 192: 60-67.

[14] KUMAR N, DAS D. Enhancement of hydrogen production byEnterobactercloacaeIIT-BT 08[J]. Process Biochemistry, 2000, 35(6): 589-593.

[15] 張蕊，李永峰，包紅旭，等.甜菜廢蜜生物制氫的微生物學基礎[J].中國甜菜糖業(yè)，2004(1):8-11.

[16] BIDDLE A, STEWART L, BLANCHARD J, et al. Untangling the genetic basis of fibrolytic specialization byLachnospiraceaeandRuminococcaceaein diverse gut communities[J]. Diversity, 2013, 5(3): 627-640.

Propertiesofcellulose-degradingandhydrogen-producingbacteriaflorainrumenfluidatdifferentpH

ZHANG Lu, XING Defeng, JIANG Qingqing, SUN Rui, REN Nanqi

( School of Municipal and Environmental Engineering, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China )

Q815；X172

A

1674-1404(2017)05-0328-05

2017-07-06.

國家自然科學基金項目(31470233).

張 璐(1984-)，女，博士研究生；通信作者：任南琪(1959-)，男，教授.

張璐,邢德峰,蔣青青,孫睿,任南琪.不同pH下瘤胃液中纖維素降解產(chǎn)氫菌群的性能[J].大連工業(yè)大學學報,2017,36(5):328-332

ZHANG Lu, XING Defeng, JIANG Qingqing, SUN Rui, REN Nanqi. Properties of cellulose degrading hydrogen producing bacteria flora in rumen fluid at different pH[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2017, 36(5): 328-332.