張 靜，紀(jì)曉玲，楊 斌，白曉霞

(榆林學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，陜西榆林 719000)

野生二粒小麥根中干旱響應(yīng)蛋白的分離與鑒定

張 靜，紀(jì)曉玲，楊 斌，白曉霞

(榆林學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，陜西榆林 719000)

為了解野生二粒小麥響應(yīng)干旱脅迫的調(diào)控機(jī)制，分析了干旱脅迫下小麥根的相對含水量、丙二醛、脯氨酸和過氧化氫含量，采用雙向電泳(2-DE)結(jié)合MALDI-TOF-TOF-MS方法分離和鑒定了野生二粒小麥根中干旱響應(yīng)蛋白的變化。結(jié)果表明，隨著干旱處理時間的延長，野生二粒小麥根的相對含水量下降，脯氨酸含量先上升后降低，過氧化氫含量和丙二醛含量上升；復(fù)水后的野生二粒小麥根的相對含水量、脯氨酸含量有所升高，但未達(dá)到對照的水平。通過對干旱處理6 d后根系的總蛋白進(jìn)行雙向電泳分離和MALDI-TOF-TOF生物質(zhì)譜鑒定，成功鑒定出26個差異表達(dá)蛋白，13個上調(diào)表達(dá)，13個下調(diào)表達(dá)。26個差異表達(dá)蛋白的功能主要涉及信號傳導(dǎo)、氧化解毒、碳代謝、能量代謝、蛋白質(zhì)生物合成及細(xì)胞骨架穩(wěn)定。推測野生二粒小麥為適應(yīng)干旱脅迫，通過根部感應(yīng)脅迫信號，并傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，影響小麥根中蛋白質(zhì)的生物合成、氨基酸代謝、碳水化合物代謝、細(xì)胞骨架形成；通過抗氧化酶系統(tǒng)和抗氧化物質(zhì)的作用，將過多活性氧加以清除；通過增加胞內(nèi)脯氨酸含量，降低根中水分損失。

野生二粒小麥；根；蛋白質(zhì)組；干旱脅迫

Abstract: To understand the complex drought response mechanism inTriticumDicoccoides,the relative water,malondialdehyde(MDA),proline and hydrogen peroxide content changes in the root under drought stress were analyzed. 2-dimentional electrophoresis(2-DE) combined with MALDI-TOF-TOF analysis were adopted to isolate and identify drought responsive proteins in root ofTriticumDicoccoides. The results showed that the relative water content of roots was inhibited with the stress time prolonged. The proline content in root increased firstly,and then decreased while the increase of stress time. On the other hand,the H2O2and MDA content in root under drought stress were increased,indicating reactive oxygen species(ROS) resulted in the membrane lipid peroxidation or membrane breakup,thereafter lead to the increase of MDA,and the decrease of proline. Although the relative water content and proline content in root under rewatering was increased,it still could not recover to the control level. About 26 protein spots were successfully identified by 2-DE and MALDI-TOF-TOF analyses between control and stressed samples,including 13 up-regulated and 13 down-regulated proteins. Further analysis of these differential expressed proteins revealed that these proteins were mainly associated with signal transduction,oxidative detoxification,carbon metabolism,energy metabolism,protein synthesis and cytoskeleton stable. It was speculated that to response the drought,the root ofTriticumDicoccoidesfirstly sensed the drought signal,and then affected protein synthesis,amino metabolism,carbohydrate metabolism and cell cytoskeleton. The plus reactive oxygen species were eliminated by oxidative detoxification associated proteins. The water loss in root was decreased by enhancing proline content.

Keywords:TriticumDicoccoides; Root; Proteome; Drought stress

干旱是困擾世界農(nóng)業(yè)發(fā)展的最主要的脅迫因子，特別是在干旱或半干旱地區(qū)。據(jù)紐約大學(xué)國家環(huán)境預(yù)報中心報道，隨著地球表面變暖，16 ℃閾值溫度帶向極地方向移動，導(dǎo)致干旱地區(qū)面積自1948年以來已經(jīng)增加了6%，預(yù)計到2050年，這一數(shù)值將至少增加8%[1]。大約50%的農(nóng)業(yè)減產(chǎn)與水資源短缺有關(guān)[2]。植物為在干旱環(huán)境中求得生存、保持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，將會開啟植物體自我保護(hù)機(jī)制，如過氧化物酶活性提高以清除過多的活性氧(Reactive Oxygen species，ROS)；提升細(xì)胞內(nèi)脯氨酸含量、可溶性糖含量，以提高胞內(nèi)滲透勢，降低胞內(nèi)水分損失；氣孔關(guān)閉、降低光合活性、改變細(xì)胞壁彈性等[3]。在分子水平上看，植物響應(yīng)干旱脅迫主要是改變一些基因的表達(dá)水平，從而使相應(yīng)的功能蛋白表達(dá)水平發(fā)生變化，最終使其生物學(xué)功能發(fā)生改變以應(yīng)對干旱脅迫[4]。由于植物大部分基因的功能未得到完全確定，干旱響應(yīng)相關(guān)的基因信息仍然有限。

蛋白質(zhì)是各種細(xì)胞功能的直接執(zhí)行者，比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于植物抗逆脅迫機(jī)制的研究。前人在干旱脅迫下的小麥[5]、野生一粒小麥(Triticumboeoticum)[6]、一粒小麥(Triticummonococcum)[7]差異蛋白質(zhì)組的研究中，已經(jīng)分離鑒定出一些信號傳導(dǎo)蛋白、氧化還原調(diào)控蛋白、氧脅迫解毒相關(guān)蛋白、蛋白質(zhì)折疊與降解相關(guān)蛋白。野生二粒小麥?zhǔn)橇扼w普通小麥A、B 染色體組的供體，是改良普通小麥農(nóng)藝性狀的重要種質(zhì)資源庫[8]。研究發(fā)現(xiàn)，野生二粒小麥的抗旱性強(qiáng)于普通小麥[9]。Peleg等[10]發(fā)現(xiàn)，野生二粒小麥的抗旱性具有遺傳多樣性，存在多態(tài)性的抗旱等位基因，且這種多態(tài)性與地域有關(guān)，某些地域(如以色列、中國西北部)來源的野生二粒小麥具有較強(qiáng)的耐旱性能。Kantar等[11]通過microRNA array技術(shù)分別分離鑒定了205和438個野生二粒小麥葉片、根部microRNA。然而，對野生二粒小麥耐旱相關(guān)蛋白質(zhì)的研究較少。

本研究擬對干旱脅迫下的野生二粒小麥根部差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行探究，分析干旱脅迫3 d和6 d 以及復(fù)水后6 d根的過氧化氫含量、脯氨酸含量、丙二醛含量和相對含水量，以了解野生二粒小麥響應(yīng)干旱脅迫的分子機(jī)制，為利用野生二粒小麥的優(yōu)質(zhì)抗旱基因提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)計

供試材料為野生二粒小麥(TriticumDicoccoides，種質(zhì)編號：AS846)，由西北農(nóng)林科技大學(xué)小麥研究中心提供。將種子放于墊有圓形濾紙的培養(yǎng)皿(直徑20 cm)中，加適量水浸種2～3 d，使之萌發(fā)。將萌發(fā)一致的種子放于底部鋪有塑料網(wǎng)的孔狀泡沫中，移植于裝有水的白色塑料盆中，置于16 h光/8 h暗、白天20℃/晚上8℃、相對濕度為65%～75%的溫室中。在第三天，將長勢一致的幼苗移栽至裝有營養(yǎng)土的塑料盆中，充分供水。待長至兩葉一心期(三葉期)分為四組進(jìn)行不同處理，分別為對照組(正常澆水)、干旱處理3 d、干旱處理6 d、復(fù)水6 d(干旱處理6 d后正常供水6 d)，每組30盆，每盆10棵植株。用剪刀剪取不同處理材料根，并用蒸餾水快速浸洗干凈，用濾紙將根部表面水吸干，部分用于相對含水量的測定，其余部分密封保存于-80 ℃冰箱備用。每個生理指標(biāo)的測定及2-DE分析均至少3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2 測定項目與方法

相對含水量的測定：參照Smart 等[12]的方法。丙二醛含量測定：參照 Hodges等[13]的方法。 脯氨酸含量測定：參照Bates等[14]的方法。H2O2含量測定：參照Hung等[15]的方法。

野生二粒小麥根總蛋白提取參照李鮮花等[16]的方法進(jìn)行，將獲得的蛋白干粉溶解于適量的裂解緩沖液[7 M尿素、2 M硫脲、4% CHAPS、65 mM Dithiothreitol( DTT )、微量蛋白質(zhì)抑制劑]中，置于冰上2 h，然后在4 ℃、19 000 r·min-1離心1 h，取上清。采用Bradford[17]法對上清液進(jìn)行蛋白濃度測定。對已測定濃度的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行雙向電泳分離，并對差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行生物質(zhì)譜鑒定，操作步驟參考Liu 等[6]的方法進(jìn)行。參考的數(shù)據(jù)庫為NCBI綠色植物庫(taxid:33090；336070 protein sequences；20170113)，蛋白質(zhì)評分C.I.%超過95%以上的蛋白質(zhì)認(rèn)定為鑒定成功的蛋白。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計并作圖，采用Duncan’s多重比較法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對野生二粒小麥根中生理生化指標(biāo)的影響

由圖1可知，野生二粒小麥根的相對含水量在對照、干旱脅迫3 d、6 d后分別為93.41%、74.01%、59.23%，干旱處理3 d和6 d后分別下降了19.30%和34.18%，根據(jù)Hsiao[18]對植物脅迫程度的劃分，當(dāng)植物組織相對含水量降低8%～10%左右時，屬輕度干旱脅迫，降低10%～20%時，屬中度干旱脅迫，而降低20%以上的則屬重度干旱脅迫。說明隨著處理時間的延長，對野生二粒小麥所造成的干旱脅迫程度由中度轉(zhuǎn)為重度。在復(fù)水后6 d，野生二粒小麥根的相對含水量得到提升，為83.38%，但仍顯著低于對照。

野生二粒小麥根中H2O2、MDA的含量隨著干旱處理時間的延長而升高，在復(fù)水后，兩者含量均有所下降(圖1)。推測長時間干旱脅迫對野生二粒小麥根造成氧化脅迫，并使細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛增加，影響根細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。

野生二粒小麥根中的脯氨酸含量，在干旱處理3 d后由16.33 μg·g-1FW上升至31.51 μg·g-1FW，而在干旱處理6 d后，又下降至23.27 μg·g-1FW。推測在干旱處理早期，野生二粒小麥根可以通過提高細(xì)胞內(nèi)脯氨酸含量抵抗干旱脅迫，隨著干旱處理時間的延長，小麥根系統(tǒng)對干旱脅迫有所適應(yīng)，胞內(nèi)脯氨酸含量下降。

圖柱上不同字母代表處理間差異在0.05水平顯著。CK：正常澆水。

Letters above column indicates significant difference among treatments(P≤0.05).CK:Normal water.

圖1不同處理下野生二粒小麥根相對含水量、脯氨酸含量、丙二醛含量與過氧化氫含量的變化

Fig.1Changesofcontentofrelativewater,proline,MDAandH2O2contentintherootofTriticumDicoccoidesunderdifferenttreatments

2.2 干旱脅迫對野生二粒小麥根中蛋白質(zhì)組的影響

野生二粒小麥根蛋白質(zhì)2-DE及MALDI-TOF-TOF結(jié)果(圖2)表明，在對照和干旱處理組中，分別檢測到465、447個重復(fù)性較好的蛋白點(diǎn)，其中，1.5倍以上的差異表達(dá)蛋白點(diǎn)有28個。通過MALDI-TOF-TOF生物質(zhì)譜鑒定，共有26個差異蛋白點(diǎn)被鑒定成功，其中，有13個上調(diào)表達(dá)的蛋白，13個下調(diào)表達(dá)的蛋白(圖2，表1)。這些差異蛋白質(zhì)涉及干旱脅迫信號感應(yīng)和傳導(dǎo)、氧化解毒、蛋白質(zhì)的生物合成與折疊、物質(zhì)與能量代謝，以及細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，其中，上調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)主要涉及信號傳導(dǎo)、氧化解毒與細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，表明這些生物學(xué)過程在干旱脅迫下的野生二粒小麥根中得到增強(qiáng)；干旱脅迫影響了根細(xì)胞蛋白質(zhì)合成與折疊、物質(zhì)與能量代謝等過程。

圖2 干旱脅迫下野生二粒小麥根蛋白質(zhì)2-DE分離結(jié)果

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫可誘導(dǎo)植物組織細(xì)胞中ROS含量的上升，攻擊細(xì)胞膜、DNA、蛋白質(zhì)等，并使細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛含量上升[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，野生二粒小麥在干旱脅迫后，根系中過氧化氫與丙二醛含量隨著干旱處理時間的延長而上升，表明干旱處理可導(dǎo)致野生二粒小麥根部細(xì)胞膜因脂質(zhì)過氧化而受到損傷。

脯氨酸是植物體內(nèi)一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，高含量脯氨酸可維持逆境脅迫下植物細(xì)胞水勢平衡，提升植物抗逆能力[20]。野生二粒小麥根的脯氨酸含量在干旱脅迫3 d后上升，在干旱6 d后下降，其原因可能是隨著干旱脅迫時間的延長，野生二粒小麥通過調(diào)節(jié)自身代謝適應(yīng)以干旱脅迫，也可能因干旱程度由中度向重度轉(zhuǎn)變，膜脂質(zhì)過氧化程度過高使根細(xì)胞遭到破壞，導(dǎo)致胞內(nèi)脯氨酸、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)流失，從而導(dǎo)致干旱處理6 d后的野生二粒小麥根中脯氨酸含量下降。

本研究中，有些蛋白點(diǎn)，如凝集素(蛋白點(diǎn)1和2)、肌動蛋白(蛋白點(diǎn)14和15)，在2-DE膠圖中顯示的位置不同，但是鑒定結(jié)果為同種蛋白。類似的結(jié)果在干旱處理后的野生一粒小麥[6]中也有發(fā)現(xiàn)，推測這些蛋白質(zhì)在干旱脅迫后發(fā)生轉(zhuǎn)錄后修飾或者降解。

本研究中分離的2個凝集素蛋白(表1，蛋白點(diǎn)1和2)在干旱脅迫后6 d的野生二粒小麥根中顯著上調(diào)表達(dá)。研究表明，植物凝集素可能參與信號傳導(dǎo)過程[21]。因此，推測凝集素在野生二粒干旱脅迫響應(yīng)過程中的作用是通過調(diào)控細(xì)胞學(xué)過程或信號傳導(dǎo)，調(diào)控干旱響應(yīng)相關(guān)蛋白的表達(dá)，以維持植物細(xì)胞的正常生長、發(fā)育和代謝，從而緩解干旱處理對野生二粒小麥所造成的危害。

干旱脅迫下植物中活性醛含量會顯著上升，進(jìn)而破壞細(xì)胞膜，使之脂質(zhì)過氧化，引起丙二醛含量的上升[22]。為抵御干旱脅迫，植物通常會采取兩種措施對活性氧、活性醛加以清除，即酶促反應(yīng)和非酶促反應(yīng)[23]。

本研究中，干旱脅迫下的野生二粒小麥根中，Cu/Zn SOD(蛋白點(diǎn)5和蛋白點(diǎn)8)和乙醛還原酶(蛋白點(diǎn)3)顯著上調(diào)表達(dá)。Hegeds等[24]研究表明，Cu/Zn SOD可解除低溫、鎘、干旱、紫外脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的劇毒性，如4-羥基壬烯醛。因此，Cu/Zn SOD和乙醛還原酶在干旱脅迫下的野生二粒小麥根中的上調(diào)表達(dá)，表明酶促反應(yīng)在野生二粒小麥根干旱響應(yīng)過程中發(fā)揮了作用。

黃酮類物質(zhì)是一類多酚類次級代謝物質(zhì)，可促進(jìn)植物體內(nèi)活性氧的清除。查爾酮異構(gòu)酶是黃酮類物質(zhì)合成過程中的關(guān)鍵酶，可將查爾酮異構(gòu)化形成類黃酮柚苷配基[25]。本研究中，在干旱脅迫下查爾酮異構(gòu)酶(蛋白點(diǎn)11)顯著下調(diào)表達(dá)，表明非酶促清除ROS過程在重度干旱脅迫的野生二粒小麥根中受到影響。

氧化還原酶可催化許多參與細(xì)胞學(xué)過程的底物的氧化還原反應(yīng)，這些過程包括信號傳導(dǎo)、代謝通路、脅迫防御反應(yīng)等[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫可導(dǎo)致氧化還原酶X1亞型(蛋白點(diǎn)9)的表達(dá)量上升，這種酶含有NADB Rossmann 結(jié)構(gòu)域和Gfo_IDH_MocA_C (葡萄糖、果糖氧化還原酶)結(jié)構(gòu)域，含有這兩種結(jié)構(gòu)域的蛋白在碳代謝和能量代謝過程中具有重要作用，因此，它的上調(diào)表達(dá)表明干旱脅迫對野生二粒小麥根的代謝通路產(chǎn)生了影響。

烯醇酶可誘導(dǎo)碳代謝過程從氧化途徑(oxidative pathway)轉(zhuǎn)移至發(fā)酵途徑(fermentative pathway)，是一種糖酵解關(guān)鍵酶[27]。干旱脅迫下的野生二粒小麥根中，烯醇酶1(蛋白點(diǎn)10)和碳代謝過程中伴隨的能量代謝物質(zhì)ATP合成相關(guān)酶(蛋白點(diǎn)22與24)的表達(dá)量均顯著下調(diào)，表明干旱脅迫影響了小麥碳代謝和能量代謝過程。

蛋氨酸是S-腺苷甲硫氨酸的活性甲基供體，甲硫氨酸合酶是催化甲硫氨酸合成的關(guān)鍵蛋白酶，該蛋白在干旱脅迫下的野生一粒小麥根中被誘導(dǎo)表達(dá)，以供植物在逆境脅迫下的生長所需[6]。野生二粒小麥根中甲硫氨酸合酶(蛋白點(diǎn)18與19)在干旱脅迫后表達(dá)量顯著上升，表明干旱處理促進(jìn)了甲硫氨酸的合成，以供應(yīng)許多代謝反應(yīng)所需的基礎(chǔ)物質(zhì)。

蛋白質(zhì)合成是受干旱脅迫影響主要的代謝過程之一。干旱脅迫下野生二粒小麥根中的翻譯起始因子 IF-2(蛋白點(diǎn)17)的表達(dá)受到抑制，熱激蛋白90(蛋白點(diǎn)16)也下調(diào)表達(dá)。鹽脅迫處理的小麥根中，蛋白質(zhì)合成相關(guān)蛋白下調(diào)表達(dá)，而熱激蛋白的表達(dá)水平上升，以應(yīng)對逆境脅迫[28]。在干旱處理的野生一粒小麥根中蛋白質(zhì)合成相關(guān)蛋白與熱激蛋白均下調(diào)表達(dá)[6]。這兩類蛋白在逆境脅迫下的不同品種小麥中表達(dá)水平的差異，表明不同小麥品種對不同逆境脅迫的響應(yīng)機(jī)制存在一定差異。

高等植物液泡膜中的V-ATPase是一種復(fù)雜的多亞基酶，在逆境脅迫下的植物中，比如干旱脅迫下的綠豆根中，V-ATPas表達(dá)量有所上升，對跨膜電化學(xué)質(zhì)子梯度的建立和維持起著主要作用，為物質(zhì)在膜內(nèi)外的運(yùn)輸提供牽動力，以維持植物在逆境脅迫下的內(nèi)穩(wěn)態(tài)[29]。本研究中，共發(fā)現(xiàn)有2個V-ATPase亞基(蛋白點(diǎn)4和23)在干旱脅迫下的野生二粒小麥根中上調(diào)表達(dá)(表1)，從而提升了野生二粒小麥在干旱脅迫中的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)能力。

肌動蛋白和微管蛋白是重要的細(xì)胞骨架蛋白，在胞質(zhì)環(huán)流、細(xì)胞形狀、細(xì)胞分裂、細(xì)胞器移動以及細(xì)胞延伸生長過程中起著重要作用[30]。野生一粒小麥根在干旱處理后，actin-4的表達(dá)水平受到顯著抑制[6]。本試驗發(fā)現(xiàn)，有兩個微管發(fā)育相關(guān)蛋白(蛋白點(diǎn)12與13)和兩個肌動蛋白(蛋白點(diǎn)14與15)在干旱脅迫后野生二粒小麥根中下調(diào)表達(dá)(表1)，表明干旱脅迫導(dǎo)致野生二粒小麥的根細(xì)胞生長、分裂等過程受到抑制。

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IsolationandIdentificationofDroughtStressResponsiveProteinsinRootofTriticumDicoccoides

ZHANGJing，JIXiaoling,YANGBin,BAIXiaoxia
(College of Life Science,College of Yulin,Yulin,Shaanxi 719000,China)

時間：2017-09-13

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20170913.1138.008.html

S512.1；S330

A

1009-1041(2017)09-1167-07

2017-01-26

2017-04-08

榆林市科學(xué)技術(shù)局科技計劃項目(2014cxy-10)；榆林學(xué)院教改項目(JG1533)；陜西省科技廳重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊項目(2013KCT-29)；陜西省教育廳科研計劃項目(15JK1848)

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