王良群 劉勇 郝艷芳

摘要選用幼穗為外植體并進(jìn)行勻漿，將勻漿物進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，獲得顆粒狀培養(yǎng)物。再把這些顆粒狀培養(yǎng)物接入到液體分化培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)后有些顆粒會(huì)萌發(fā)出新芽，然后把這些已長(zhǎng)出芽的培養(yǎng)物接入到固體分化培養(yǎng)基中可獲得完整的苗。研究還將幼穗固體培養(yǎng)模式獲取的愈傷組織接入到液體分化培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，結(jié)果獲取了相互分離能生根發(fā)芽的胚狀體。該研究豐富了高粱再生培養(yǎng)技術(shù)手段。

關(guān)鍵詞高粱；液體再生系統(tǒng)；靜止培養(yǎng)；振蕩培養(yǎng)

中圖分類號(hào)S514文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）22-0034-02

AbstractThe immature inflorescences was used as explant and homogenized.The homogenate was cultured with shaking.The granular calluslike culture was obtained and accessed into liquid differentiation edium.After further culturing， germination of sprouts will occur on some granules and then these geminated granules were added into solid regeneration culture medium.Lastly， complete seedlings can be obtained.In the study， the callus of the immature inflorescences was cultured in the liquid differentiation medium .As a result， the embryoid bodies isolated from each other were obtained.The sorghum liquid regeneration culture was explored to enrich the sorghum tissue culture technology.

Key wordsSorghum；Liquid regeneration system；Static culture；Shaking culture

植物組培是一項(xiàng)重要的基礎(chǔ)生物技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和科學(xué)技術(shù)研究等諸多行業(yè)領(lǐng)域。植物組培涵蓋許多內(nèi)容，其中組培再生系統(tǒng)的建立是重要的研究?jī)?nèi)容之一。由于組培再生技術(shù)對(duì)作物轉(zhuǎn)基因研究應(yīng)用非常重要，所以隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)快速發(fā)展，建立有效的不同作物的組培再生系統(tǒng)顯得越來(lái)越重要。

高粱是全球第五大農(nóng)作物，具有食用、飼用和釀造用等多種用途。但是與玉米等作物相比，高粱生產(chǎn)水平和育種水平都相對(duì)落后。造成高粱生物技術(shù)育種落后的原因很多，高粱組培再分化難從而限制高粱組培轉(zhuǎn)基因研究應(yīng)用是其重要原因之一[1-2]。

高粱屬于較早開(kāi)展離體培養(yǎng)技術(shù)研究的作物之一，早在1968年，就有研究者利用高粱根和分蘗節(jié)在添加2.4-D和KT的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出高粱愈傷組織。1970年，Masteller等[3]、Brettell等[4]以高粱芽原基為外植體進(jìn)行了愈傷組織培養(yǎng)，并分化產(chǎn)生了再生苗。之后的多年里，國(guó)內(nèi)外研究者以幼穗、幼胚、莖尖等多種器官組織為外植體進(jìn)行了廣泛的研究。目前，已能將幼穗、幼胚、莖尖、幼葉、成熟胚等多種外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)出愈傷組織，且誘導(dǎo)率較高，在70%以上。至于再生苗分化培養(yǎng)，不同外植體差異較大，其中幼穗和幼胚分化率較高，其他外植體愈傷則再生出苗困難，分化率很低[5-7]。

高粱組培固體再生系統(tǒng)的基本流程是選取某一種外植體，消毒后接種于固體培養(yǎng)基上，28 d左右誘導(dǎo)出愈傷組織，然后轉(zhuǎn)接到新固體培養(yǎng)基上進(jìn)行21～35 d的繼代培養(yǎng)，最后轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)基進(jìn)行再生苗分化培養(yǎng)。目前高粱組培再生普遍采用這種單一化的固體培養(yǎng)基再生培養(yǎng)模式。為了克服高粱分化難這一公認(rèn)的難題，豐富高粱再生培養(yǎng)技術(shù)手段，近年來(lái)嘗試采用高粱液體培養(yǎng)技術(shù)來(lái)研究高粱組培分化培養(yǎng)。

1材料與方法

1.1材料試驗(yàn)材料為高粱恢復(fù)系忻七、3642、三尺三等。

1.2幼穗等外植體取材方法該研究所用的外植體為幼穗、莖尖、成熟胚和籽粒。幼穗取材時(shí)，先從田間選取其幼穗長(zhǎng)為1～3 cm的植株，再分3次剝出。第1次剝離在一般條件下進(jìn)行，不露出幼穗，仍保留多層葉片。第2次在無(wú)菌條件下剝離，減少包埋葉片，最后用刀具剝出幼穗；制備莖尖時(shí)，先將無(wú)菌種子進(jìn)行發(fā)芽，待芽長(zhǎng)達(dá)0.5 cm，葉片展開(kāi)前，即可進(jìn)行莖尖截取，在無(wú)菌培養(yǎng)皿上把生長(zhǎng)點(diǎn)或者分生區(qū)兩端切去，剩余的包括生長(zhǎng)點(diǎn)在內(nèi)0.3～0.5 cm長(zhǎng)的切斷可用作外植體進(jìn)行接種。其中成熟胚是從消毒后浸泡12 h左右的籽粒中剝?nèi)〉?。從發(fā)育好、發(fā)芽率高的種子中挑選出飽滿的種子，滅菌后即可直接作為外植體。

1.3培養(yǎng)基選用

基本培養(yǎng)基為MS，蔗糖為3%，pH為5.8～6.0。愈傷常規(guī)誘導(dǎo)培養(yǎng)基附加的激素成分及用量主要為2，4-D 3 mg/L、KT 0.5 mg/L，繼代培養(yǎng)基附加相同種類的激素，但含量低，一般2，4-D為1～2 mg/L、KT為0.1～0.5 mg/L，分化培養(yǎng)基去除2，4-D，僅用0.5 mg/L的KT。當(dāng)培養(yǎng)基為常規(guī)固體時(shí)，加入0.8%的瓊脂，不加瓊脂則為液體培養(yǎng)基。該研究選用的幾種液體培養(yǎng)基為 Y1（2，4-D 1 mg、KT 0.5 mg）、Y2（2，4-D 3 mg、KT 0.5 mg）、Y3（KT 0.5 mg）。

1.4靜止與振蕩液培方法及光溫條件

液體培養(yǎng)分靜止培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)，靜止培養(yǎng)就是把已接種的液體培養(yǎng)瓶放置在培養(yǎng)室的固定培養(yǎng)架上；振蕩培養(yǎng)是把培養(yǎng)瓶置于搖床上，轉(zhuǎn)速為100～150 r/min。該研究中，靜止培養(yǎng)僅用于與振蕩培養(yǎng)的比較試驗(yàn)，其余培養(yǎng)均為振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)主要在安裝空調(diào)的培養(yǎng)室進(jìn)行，溫度在22～25 ℃。高粱再生苗分化培養(yǎng)人工輔助光照強(qiáng)度為2 000 lx，時(shí)間為12 h，愈傷誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)在自然光照條件下就可以。

1.5幼穗勻漿物液培方法

勻漿培養(yǎng)法是把幼穗等外植體進(jìn)行勻漿，勻漿時(shí)加入2～3 mL液體培養(yǎng)基，然后直接加入Y2液體培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)10 d后，如果培養(yǎng)物直徑達(dá)3 mm，可直接將培養(yǎng)物接入液體分化培養(yǎng)基Y3中。如果培養(yǎng)物直徑未達(dá)3 mm，則需將培養(yǎng)物接入到Y(jié)1或Y2中繼續(xù)培養(yǎng)，直到培養(yǎng)物直徑達(dá)3 mm再接入到Y(jié)3中培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)物在Y3中發(fā)芽后可轉(zhuǎn)接到固體分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)獲取完整組培苗。

1.6幼穗愈傷組織常規(guī)誘導(dǎo)培養(yǎng)與液體分化培養(yǎng)

愈傷組織常規(guī)培養(yǎng)方法是將選用的外植體接種到固體培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)28 d左右的培養(yǎng)，即可誘導(dǎo)生成愈傷組織。愈傷組織液體分化培養(yǎng)是把固體培養(yǎng)獲取的愈傷組織接入到Y(jié)3液體培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。

2結(jié)果與分析

2.1幼穗、莖尖等外植體勻漿物液培

該研究選用高粱幼穗和莖尖進(jìn)行了勻漿物液培再生系統(tǒng)研究，結(jié)果表明莖尖相關(guān)研究無(wú)法達(dá)到預(yù)期的結(jié)果，而幼穗勻漿物液培結(jié)果超出預(yù)期。

幼穗勻漿液培研究分別選用恢復(fù)系忻七和3642進(jìn)行試驗(yàn)。其中忻七幼穗勻漿物培養(yǎng)10 d后，

培養(yǎng)物直徑未達(dá)3 mm，可能是由于勻漿力度過(guò)大導(dǎo)致勻漿物太細(xì)小，因而倒出上清液留下沉淀物，加入新鮮起始培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，再培養(yǎng)10 d后仍發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)物不夠大，用同樣的方法換培養(yǎng)液Y1進(jìn)行繼代培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)10 d后，培養(yǎng)物直徑達(dá)3 mm，這時(shí)把沉淀物接入到含有25 mL液體分化培養(yǎng)基Y3三角瓶中，在搖床上振蕩培養(yǎng)，7 d后發(fā)現(xiàn)有些顆粒已萌發(fā)出新芽，然后將這些已長(zhǎng)出芽的培養(yǎng)物接入到固體分化培養(yǎng)基中置于固定不動(dòng)的培養(yǎng)架上培養(yǎng)，15 d后可獲得完整的苗。

高粱恢復(fù)系3642培養(yǎng)10 d后培養(yǎng)物都比較大，直徑在3 mm以上，不需要繼代培養(yǎng)。培養(yǎng)13 d后，直接把粒狀培養(yǎng)物接入到25 mL液體分化培養(yǎng)基中，在搖床上振蕩培養(yǎng)，10 d后發(fā)現(xiàn)有些顆粒已萌發(fā)出新芽，把這些已長(zhǎng)出芽的培養(yǎng)物接入到固體分化培養(yǎng)基中置于培養(yǎng)架上培養(yǎng)，15 d后可獲得完整的苗。

2.2幼穗、莖尖等愈傷組織液培

選用高粱恢復(fù)系三尺三的幼穗和莖尖進(jìn)行愈傷常規(guī)培養(yǎng)，2種外植體都容易誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，但二者愈傷胚性相差很大。固體常規(guī)分化培養(yǎng)時(shí)，莖尖愈傷很難分化產(chǎn)生再生苗。將莖尖愈傷接入到液體分化培養(yǎng)基后，只能產(chǎn)生許多絲狀體或根狀體，很難觀察到發(fā)芽現(xiàn)象，且愈傷組織會(huì)逐漸變黑。幼穗愈傷組織胚性很好，固體分化培養(yǎng)效果好，容易獲得再生苗，將胚性狀況好的幼穗愈傷組織接入到液體分化培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)10余天的培養(yǎng)，會(huì)形成許多相互分離的有芽有根的獨(dú)立結(jié)構(gòu)，這也就是萌發(fā)了的胚狀體。把這些發(fā)了芽具有胚狀體結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)物接種到固體培養(yǎng)基中也可得到完整的組培苗。說(shuō)明幼穗愈傷是通過(guò)胚狀體途徑產(chǎn)生再生苗的，這一現(xiàn)象在常規(guī)培養(yǎng)中是看不到的。

2.3莖尖、籽粒、成熟胚等外植體液體靜止培養(yǎng)與振蕩培養(yǎng)

選用高粱恢復(fù)系三尺三的莖尖、成熟胚和籽粒3種外植體進(jìn)行液體靜止培養(yǎng)與振蕩培養(yǎng)比較試驗(yàn)，結(jié)果表明培養(yǎng)28 d后，籽粒在靜止培養(yǎng)條件下，萌發(fā)率為8%，振蕩培養(yǎng)條件下萌發(fā)率為80%，這和種子實(shí)際發(fā)芽率基本一致，說(shuō)明靜止培養(yǎng)對(duì)籽粒萌發(fā)有很強(qiáng)的抑制作用。靜止培養(yǎng)的籽粒芽長(zhǎng)為0.7 cm，而振蕩培養(yǎng)的籽粒芽長(zhǎng)為4.0 cm。另外振蕩培養(yǎng)的籽粒能生成愈傷組織，液體中能觀察到大量細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)，而靜止培養(yǎng)細(xì)胞較少（表1）。在對(duì)籽粒進(jìn)行直接液體振蕩培養(yǎng)時(shí)，還觀察到1粒種子出8個(gè)苗的現(xiàn)象。

靜止培養(yǎng)的成熟胚萌發(fā)生成不超過(guò)0.7 cm長(zhǎng)的芽，并生成乳白色愈傷，能觀察到少量細(xì)胞，振蕩培養(yǎng)的胚芽長(zhǎng)為1.5 cm，其愈傷為黑褐色（表2），原因可能是振蕩培養(yǎng)時(shí)，生長(zhǎng)快，分泌色素多，培養(yǎng)物衰老快。靜止培養(yǎng)的莖尖形成的莖葉長(zhǎng)度為4 cm左右，莖基部可觀察到愈傷，液體透明，可觀察到數(shù)量很少的細(xì)胞，振蕩培養(yǎng)的莖尖則褐化死亡。

3結(jié)論與討論

在高粱幾種常用外植體中，幼穗是最適宜用于勻漿液培的，其他幾種外植體不太適合。該研究結(jié)果表明，當(dāng)采用同一試材時(shí)，勻漿力度大小、勻漿物粗細(xì)對(duì)培養(yǎng)結(jié)果（繼代培養(yǎng)次數(shù)和時(shí)間長(zhǎng)短）有明顯的影響。與常規(guī)固體愈傷分化模式相比，外植體勻漿液培有2個(gè)優(yōu)點(diǎn)：①培養(yǎng)周期明顯縮短。當(dāng)高粱材料3642勻漿物粗細(xì)合適時(shí)，只用30余天就得到了完整的組培苗，而常規(guī)固體愈傷再生系統(tǒng)一般需要60 d以上；②外植體勻漿液培系統(tǒng)是一種全新的再生模式，可以用于植物轉(zhuǎn)基因研究中，為植物遺傳轉(zhuǎn)化提供一種新的試驗(yàn)系統(tǒng)，特別是在高粱被公認(rèn)為分化難的情況下，多一種再生系統(tǒng)選擇，對(duì)高粱轉(zhuǎn)基因研究具有很重要的意義。幼穗勻漿液培再生系統(tǒng)完全不同于傳統(tǒng)固體愈傷培養(yǎng)模式，該研究只是初步的探索，需要對(duì)其影響因素進(jìn)行更多的研究分析，建立更加完善的技術(shù)體系。

高粱常規(guī)愈傷再生系統(tǒng)研究結(jié)果表明，幼穗是分化培養(yǎng)最適宜的外植體，其愈傷組培的胚性最好，愈傷液培結(jié)果也證明了這一點(diǎn)，當(dāng)把幼穗、莖尖等外植體的愈傷組織塊進(jìn)行液體分化培養(yǎng)時(shí)，只有幼穗愈傷會(huì)產(chǎn)生相互分離的胚狀體結(jié)構(gòu)。該結(jié)果說(shuō)明高粱幼穗愈傷分化出苗主要是通過(guò)胚狀體的途徑， 其意義在于這種愈傷液培方式可以用于轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究中。

由于液培時(shí)培養(yǎng)物完全浸沒(méi)在培養(yǎng)基里，不像固體培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)物與培養(yǎng)基只是局部接觸，所以會(huì)產(chǎn)生不同于常規(guī)固體培養(yǎng)時(shí)的效果，甚至出現(xiàn)意想不到的結(jié)果，可見(jiàn)液體培養(yǎng)是一種很有價(jià)值的離體培養(yǎng)手段。此外，通過(guò)靜止與振蕩液培比較試驗(yàn)，可以看出振蕩對(duì)許多液培來(lái)說(shuō)是非常必要的，振蕩可以加快培養(yǎng)物的生長(zhǎng)。

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