張雪鈺，武軍凱，劉建珍，肖 嘯，張立彬

(河北科技師范學院園藝科技學院，河北 秦皇島，066600)

桃樹抗寒相關的葉綠體新基因PpRBD1的克隆及特征分析

張雪鈺，武軍凱，劉建珍，肖 嘯，張立彬*

(河北科技師范學院園藝科技學院，河北 秦皇島，066600)

為確定桃樹細胞質(zhì)抗寒相關基因，依據(jù)模式植物擬南芥中抗寒相關的RBD1基因，結(jié)合桃基因組數(shù)據(jù)設計并克隆到一個桃PpRBD1基因。該基因全長2 230 bp，編碼513個氨基酸；結(jié)構(gòu)域分析顯示，該氨基酸序列含有RRM(RNA recognition motif)保守結(jié)構(gòu)域，是與擬南芥RBD1同源的蛋白；亞細胞定位預測表明，該基因編碼的蛋白可能在葉綠體中表達。該基因可能在桃抵抗寒冷脅迫中發(fā)揮重要作用。

桃；抗寒性；葉綠體；ppRBD1；RRM

我國桃樹栽培北線是北緯39°～40°地區(qū)，溫度是限制其地理分布的主要因素，桃樹在這些地區(qū)周期性發(fā)生凍害，給果樹生產(chǎn)造成了嚴重的損失。實踐證明，采用傳統(tǒng)的育種手段很難解決這一問題。因此，研究抗寒性的相關基因并將其用于抗寒新品種的培育具有十分重要的意義[1]。目前，對于桃樹抗寒性相關基因的研究主要集中在細胞核上。在桃上已經(jīng)研究的比較清楚的有CBF冷誘導途徑[2]、抗凍蛋白[3]等。對于桃樹細胞質(zhì)抗寒相關基因的研究鮮有報道。細胞質(zhì)抗寒性的研究多集中在模式植物上。研究表明，定位于線粒體和葉綠體中的RNA結(jié)合蛋白與植物的抗寒性有關。Kim等[4]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)一種定位于線粒體的甘氨酸富集RNA結(jié)合蛋白，在低溫下含量顯著提高。Wang等[5]通過T-DNA插入的方式篩選擬南芥中的冷敏感突變體，得到在抗寒方面具有重要作用的基因RBD1，該基因是細胞核編碼的，而由其編碼的蛋白質(zhì)定位于葉綠體，是一種RNA結(jié)合蛋白，具有RRM基序。

模式植物細胞質(zhì)抗寒相關基因的研究為桃樹抗寒性的研究提供了重要理論依據(jù)。遺傳學研究發(fā)現(xiàn)，抗寒與不抗寒親本的正交與反交組合在F1代的抗寒程度的加權(quán)平均值具有顯著差異[6]。筆者試圖以桃為材料，通過生物信息學和分子生物學的方法克隆桃中與擬南芥抗寒性密切相關的同源PpRBD1基因，比較不同品種桃該基因的序列并進行相關的生物信息學分析，為進一步研究其功能和探索RNA結(jié)合蛋白對抗寒性的影響奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

表1 6個桃品種抗寒性及來源

注：抗寒性強品種用“+”表示；抗寒性差品種用“-”表示。

選用3個抗寒性強桃品種和3個抗寒性差桃品種為試驗材料。其中，中華壽桃、琿春桃和21世紀桃取自河北省秦皇島市昌黎縣河北科技師范學院園藝試驗站，雪桃取自河北省保定市滿城縣苗圃場，懷來毛桃和早霞露桃取自北京農(nóng)林科學院林業(yè)果樹研究所(表1)。

pEASY-T5 Zero Cloning Kit，Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell引自北京全式金生物技術(shù)有限公司。質(zhì)量濃度20 g/L的CTAB裂解液，1 mol/L Tris-HCl，0.5 mol/L EDTA，5 mol/L NaCl，β-巰基乙醇，乙醇，冰乙酸引自北京博邁德公司。DNA膠回收試劑盒引自Axygen。其余試劑均為北京化工廠的產(chǎn)品(分析純)。引物合成和測序工作由中美泰和生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 DNA的提取

采用改良的CTAB法提取葉片DNA[7]。具體步驟如下：

(1)向已預冷的研缽中加入0.5 g幼葉，加入液氮進行充分研磨至粉末發(fā)白，立即用預冷的勺子轉(zhuǎn)入已加入700 μL CTAB提取液(0.5 mmol/L EDTA，1 mol/L pH 8.0 Tris-HCl，20 g/L CTAB，體積分數(shù)為0.01的巰基乙醇)的1.5 mL離心管中。

(2)在漩渦振蕩器上充分混合后65 ℃水浴60 min，水浴過程中不斷輕輕晃動直至搖勻。

(3)加入等體積的氯仿/異戊醇(24：1)，輕輕旋轉(zhuǎn)搖動至充分混勻，室溫下12 000 r/min離心10 min。

(4)上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管。

(5)重復步驟3和步驟4。

(6)加入2倍體積預冷的無水乙醇，上下輕輕翻轉(zhuǎn)至充分混合，-20 ℃放置30 min后，12 000 r/min離心5 min，棄上清。

(7)得到的DNA沉淀用體積分數(shù)為0.70的乙醇沖洗3次后，再加入無水乙醇沖洗1次，吸干殘存乙醇，超凈工作臺上晾干。

(8)干燥后加入100 μL RNase Free ddH2O水，彈起DNA使其充分溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 目的基因的克隆

根據(jù)Wang等[5]的相關研究，搜索擬南芥中該RNA結(jié)合蛋白的編碼基因(登錄號：BT005155)，根據(jù)相近物種保守區(qū)域的序列，設計特異性引物。由于目標序列過長，分2段進行克隆測序。

P1:5’-GGAACTGACTCATTTTGCTCAGTAG-3’

P2:5’-TGCACTTTCTCATCAATCACTACC-3’

P3:5’-AGCAGGATGCAACTAGGTATGT-3’

P4:5’-GGGAAGAAGAGCATATTTCATTCAT-3’

對6個不同的桃品種進行PCR擴增。PCR擴增體系：①2×Es Taq MasterMix 10 μL,P1(10 pmol/L) 0.5 μL, P2(10 pmol/L) 0.5 μL, DNA模板(50 ng/μL) 0.5 μL, RNase Free ddH2O 8.5 μL；②2×Es Taq MasterMix 10 μL,P3(10 pmol/L) 0.5 μL, P4(10 pmol/L) 0.5 μL, DNA模板(50 ng/μL) 0.5 μL, RNase Free ddH2O 8.5 μL。

擴增程序為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，34個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保持[8]。

回收擴增片段并連接pEASY-T5載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)Trans1-T1。PCR鑒定陽性菌由中美泰和生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.4 生物信息分析

利用NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的BLAST程序進行序列比對，并尋找同源基因和蛋白序列[9]。

利用DNAMAN軟件進行桃不同品種的核酸序列拼接、分析和多序列比對。

利用ExPASy網(wǎng)站(http://www.expasy.org/)的在線工具ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對蛋白質(zhì)的分子量和理論等電點進行分析[10]。

利用LOCASIZER 1.0網(wǎng)站(http://localizer.csiro.au/)進行蛋白質(zhì)的亞細胞定位。

蛋白質(zhì)序列預測，并利用NCBI網(wǎng)站的CDD在線分析軟件對蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域進行預測。

利用SWISS-MODEL在線分析工具(https://swissmodel.expasy.org/)對保守結(jié)構(gòu)域進行三級結(jié)構(gòu)預測。

利用MEGA5對13個物種的RNA結(jié)合蛋白進行進化樹的構(gòu)建，各蛋白氨基酸的比對在ClustalW上進行。進化樹的構(gòu)建使用鄰接法(Neighbor-Joining)進行，并用Bootstrap進行可靠性檢驗，重復次數(shù)設為500，其它參數(shù)選擇默認值。

2 結(jié) 果

2.1 RBD基因的克隆

通過PCR擴增，得到兩段PCR擴增產(chǎn)物，引物P1和P2的PCR擴增產(chǎn)物約1 000 bp，引物P3和P4的PCR擴增產(chǎn)物約1 500 bp(圖1)。將測得的序列拼接分析，得到2 230 bp的序列，將其提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(登錄號：KY744742)。

2.2 RBD基因及其編碼蛋白的生物信息學分析

2.2.1RBD基因序列的BLAST結(jié)果 利用NCBI網(wǎng)站的BLAST進行序列比對，得到桃假定蛋白的mRNA序列(登錄號：XM_007222655)，全長819 bp與本實驗的部分序列一致。通過編碼蛋白序列的預測分析，該序列與NCBI中的桃假定蛋白(登錄號：ONI30572.1)的氨基酸序列高度相似(圖2)。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖2 PpRBD1基因結(jié)構(gòu)示意圖

2.2.2不同桃品種比較 用DNAMAN對6個桃品種進行基因序列和翻譯氨基酸序列的比較，發(fā)現(xiàn)琿春桃、21世紀桃、雪桃和早霞露桃在基因序列上與假定蛋白的mRNA完全一致。與這些品種的基因序列相比，中華壽桃和懷來毛桃在外顯子1區(qū)域的①158 bp(T→G)，②280 bp(A→C)，③465 bp(A→G)等3位點和內(nèi)含子2區(qū)域的④1 063 bp(T→A)以及外顯子3區(qū)域的⑤1 325 bp(C→T)和⑥1 761 bp(G→A)有單堿基差異。對應的氨基酸在①52位(L→W)、②93位(A→C)和③305位(T→I)有單個氨基酸的差異。④位于內(nèi)含子區(qū)域，不編碼氨基酸，③和⑥處氨基酸發(fā)生簡并。結(jié)果表明，該基因在同一物種中保守性較強。2.2.3理化性質(zhì)分析 利用ExPASy網(wǎng)站的ProtParam對PpRBD1編碼蛋白的理化性質(zhì)進行了分析[11]。結(jié)果表明，該蛋白的理論分子量為56.547 kD，理論等電點為5.23，分子式為C2465H3956N678O815S13，脂肪族氨基酸指數(shù)74.09，親水性平均系數(shù)(GRAVY)-0.675，可能為親水性蛋白。不穩(wěn)定系數(shù)44.61，根據(jù)Guruprasad方法表明該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。2.2.4LOCALIZER1.0蛋白質(zhì)亞細胞定位預測 LOCALIZER 1.0是一種基于葉綠體和線粒體的轉(zhuǎn)運肽以及細胞核的NLSs(nuclear localization signals)特征預測蛋白的亞細胞定位的工具[12]。植物細胞中有許多由細胞核基因編碼的，在不同的細胞區(qū)室執(zhí)行特定功能的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)往往具有專門的轉(zhuǎn)運肽。預測結(jié)果顯示，PpRBD1基因編碼的氨基酸序列中，1～28位為cTP(chloroplast transit peptides，葉綠體轉(zhuǎn)運肽)，可信度0.919；還有2個NLS。

2.2.5CDD鑒定 利用DNAMAN對擬南芥RBD1基因和桃的PpRBD1基因編碼的蛋白序列進行比對，氨基酸全序列相似性僅32.43%，但是202～288位相似性達71.26%。

選擇保守性較高的區(qū)域，利用NCBI中的CDD工具對保守結(jié)構(gòu)域進行預測。鑒定結(jié)果顯示，該基因編碼的蛋白在202～288位具有RRM結(jié)構(gòu)域，可能屬于RRM超家族。

2.2.6預測蛋白的保守結(jié)構(gòu)域的SWISS-MODEL同源建模 利用SWISS-MODEL對該基因的預測蛋白保守結(jié)構(gòu)域進行同源建模，在202～288位得到預測的三維結(jié)構(gòu)(圖3)。該結(jié)構(gòu)為β折疊和α螺旋形成的β1α1β2β3α2β4三明治結(jié)構(gòu)，空間上4個反向平行的β折疊按照β4β1β3β2的順序排列，與RRM結(jié)構(gòu)域一致[13]。

2.2.7進化樹的構(gòu)建 利用MEGA5軟件，通過構(gòu)建RNA結(jié)合蛋白與其他生物中相關蛋白的系統(tǒng)進化樹，以擬南芥作根，構(gòu)建有根樹(圖 4)。發(fā)現(xiàn)該蛋白的進化與生物演化的方向一致，近源物種的遺傳距離較近，遠源物種的遺傳距離較遠，與桃(prunuspersica)同屬薔薇科的prunusmume、Malusdomestica和Fragariavesca在同一分支上。表明這些蛋白具有相同的起源，在生物漫長的演化過程中，在不斷地趨異進化。

圖3 RRM保守結(jié)構(gòu)域三維結(jié)構(gòu)預測

圖4 8個物種RNA結(jié)合蛋白進化樹

3 討 論

植物響應低溫脅迫的主要形式之一是通過形成穩(wěn)定的RNA二級結(jié)構(gòu)實現(xiàn)的[14]。RNA結(jié)合蛋白與低溫脅迫的關系研究最早見于對大腸桿菌冷激蛋白(CSP)的報道中。大腸桿菌CSP在低溫脅迫下產(chǎn)生RNA結(jié)合蛋白，這些蛋白的三級結(jié)構(gòu)包含兩個RNA冷激結(jié)合域(CSD)。低溫誘導下，mRNA和CSP蛋白水平升高，CSD和RNA結(jié)合，解開雙鏈DNA[15]。

植物上有些RNA結(jié)合蛋白對低溫誘導同樣有重要的作用。Kim等[4]研究表明在低溫脅迫下，擬南芥AtGRP2的含量顯著提高，有助于提高植物的抗寒性。該蛋白是甘氨酸富集RNA結(jié)合蛋白，定位于線粒體上。Kim等[16]研究擬南芥的RZ-1a，發(fā)現(xiàn)在低溫脅迫下其含量顯著提高。Wang等[5]對擬南芥的T-DNA插入的冷敏感突變體進行了篩選和研究，鑒定出一種RNA結(jié)合蛋白(暫命名為RBD1)基因缺失的突變體在低溫脅迫下與野生型的抗寒性表現(xiàn)出差異。該基因定位于細胞核，為組成型表達，但是其編碼的RBD1蛋白定位于葉綠體，結(jié)合23S rRNA前體的3個結(jié)構(gòu)域，并且在低溫下結(jié)合能力更強。因此，RBD1蛋白作用于23S rRNA的前提而影響葉綠體內(nèi)蛋白質(zhì)的翻譯過程。

擬南芥中的RBD1蛋白具有538個氨基酸殘基，并含有一個RNA識別基序。RNA識別基序(RNA recognition motif,RRM)，又稱為RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RNA-binding domain,RBD)或核糖體蛋白結(jié)構(gòu)域(ribonucleoprotein domain,RNP)，在生物界中廣泛存在，包括原核生物和病毒，但是在真核生物中豐度最高，是真核生物最豐富的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域之一[13]。在植物中，RRM蛋白存在于葉綠體，參與葉綠體mRNA 3’末端的加工[17]。植物線粒體中也有發(fā)現(xiàn)，但是功能還不清楚[18]。

本次研究克隆桃基因組得到的PpRBD1基因經(jīng)過生物信息學分析，結(jié)果顯示該基因編碼的蛋白由513個氨基酸殘基組成，具有RRM基序。根據(jù)模式植物擬南芥中相關的研究結(jié)論和蛋白質(zhì)亞細胞定位預測的結(jié)果，推測該基因編碼的蛋白由細胞核基因編碼后，表達在葉綠體中，在低溫下可能參與23S rRNA的剪切過程，進而影響葉綠體內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯的正常進行。

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(責任編輯：朱寶昌，陳于和)

Abstract: The objective of this study was to clone a novel chloroplast gene ofPpRBD1 in peach (Prunuspersica) according toArabidopsisthalianaand peach genome data, and to analyze its correlation with cold tolerance. The full length ofPpRBD1 gene was 2 230 bp sequence, which encoded a deduced protein including 513 amino acid residues. The domain analysis revealed that the amino acid sequence contained a conserved RRM (RNA recognition motif) domain, which was a protein homologous to RBD1 inArabidopsisthaliana. Subcellular localization showed that it expressed possible in chloroplast. And it might play an important role in plant tolerance.

Keywords: peach (Prunuspersica); cold tolerance; chloroplast;PpRBD1; RRM

CloningandCharacterizationofaNovelChloroplastGenePpRBD1AssociatedwithColdToleranceinPeach(Prunuspersica)

ZHANG Xueyu, WU Junkai, LIU Jianzhen, XIAO Xiao, ZHANG Libin

(College of Horticulture Science & Technology, Hebei Normal University of Science & Technology, Qinhuangdao Hebei, 066600, China)

S662.1

A

1672-7983(2017)02-0012-06

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2017.02.003

國家自然科學基金資助項目(項目編號：31572093)。

*通訊作者，男，教授，碩士，碩士研究生導師。主要研究方向：桃遺傳育種與分子生物學。E-mail:zhanglibin9364@163.com。

2017-05-08;修改稿收到日期2017-06-05

張雪鈺(1992-)，女，碩士研究生。主要研究方向：果樹遺傳育種與分子生物學。