蔣飛黔（四川大學(xué)，生物治療國家重點實驗室，四川 成都 610041）

Plackett-Burman和響應(yīng)面法優(yōu)化CHO細胞無血清培養(yǎng)基中關(guān)鍵營養(yǎng)成分

蔣飛黔（四川大學(xué)，生物治療國家重點實驗室，四川 成都 610041）

為了提高CHO細胞在無血清培養(yǎng)基中的生長和蛋白表達能力。通過文獻選擇16種物質(zhì)，利用Plackett-Burman實驗法篩選有出顯著影響的4種營養(yǎng)物質(zhì)，再使用中心復(fù)合設(shè)計響應(yīng)面法優(yōu)化各成分含量，得到最優(yōu)配比為腐胺0.07mg/L、檸檬酸鐵132.5mg/L、磷酸二氫鈉0.84mg/L和煙酰胺2mg/L，優(yōu)化后獲得無血清培養(yǎng)基性能優(yōu)于同類商品化培養(yǎng)基。

Plackett-Burman；響應(yīng)面；CHO細胞；無血清培養(yǎng)基

中國倉鼠卵巢細胞（Chinese Hamster Ovary，CHO）是目前生產(chǎn)重組蛋白的主要宿主細胞，廣泛應(yīng)用于藥物生產(chǎn)領(lǐng)域。CHO細胞表達系統(tǒng)能很好的指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊，提供復(fù)雜的糖基化等修飾和加工；其表達蛋白的理化性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)及生物學(xué)活性等接近天然的生物蛋白分子[1]。CHO細胞無血清培養(yǎng)基是在DMEM∕F12基礎(chǔ)上添加生長因子、氨基酸、維生素和微量元素等組成[2]，能減少生產(chǎn)難度也能穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量。

本研究目的是開發(fā)CHO細胞無血清培養(yǎng)基用于表達VEG?FR-FC融合蛋白，其作用為抑制腫瘤部位的血管新生而達到治療目的。本實驗以細胞生長狀態(tài)和表達量為評價指標，通過Plackett-Burman法篩選關(guān)鍵成分再使用響應(yīng)面法優(yōu)化其中含量[3-4]。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞

CHO細胞，表達VEGFR-FC。

1.1.2 試劑

DMEM∕F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基購自Gbico公司；營養(yǎng)物質(zhì)購自Sig?ma-Aldrich公司。

1.1.3 設(shè)備與儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱，Kuhner公司ISF1-X；細胞計數(shù)儀，Beck?man公司ViCell Counter；高效液相色譜儀，Agilent公司1200。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

細胞復(fù)蘇后離心重懸至搖瓶培養(yǎng)，每培養(yǎng)72h時取樣計數(shù)，按稀釋密度3-5×105cells∕mL再次傳代；隨后按實驗設(shè)計接種至250mL搖瓶，每瓶培養(yǎng)體積50mL，培養(yǎng)條件：溫度36.5℃、CO2濃度5%。

1.2.2 Plackett-Burman實驗設(shè)計

通過查閱文獻匯總了對細胞生長與表達影響較大的16個主要營養(yǎng)成分，增加2個虛擬變量考察誤差，各因子信息見表1。采用Plackett-Burman實驗設(shè)計方法安排20次實驗。

表1 Plackett-Burman設(shè)計因子及濃度

1.2.3 響應(yīng)面設(shè)計

經(jīng)篩選實驗后分析結(jié)果，采取蛋白產(chǎn)量優(yōu)先，活細胞密度其次的選擇策略共得到4個關(guān)鍵因子：腐胺、檸檬酸鐵、磷酸二氫鈉和煙酰胺，參考表1中因子含量水平并擴大±0.5倍濃度進行響應(yīng)面分析。采用中心復(fù)合設(shè)計方法共設(shè)計30次實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 主要營養(yǎng)物質(zhì)篩選

Plackett-Burman實驗結(jié)果見圖1并利用Minitab統(tǒng)計軟件進行方差分析，由于實驗設(shè)計中包含混雜和搖瓶實驗存在誤差，故顯著性水平設(shè)定為0.1。分別以蛋白表達量和最高活細胞密度為響應(yīng)，初篩得到關(guān)鍵影響營養(yǎng)因子為：腐胺、檸檬酸鐵、磷酸二氫鈉和煙酰胺。

圖1 Plackett-Burman實驗結(jié)果

圖2 響應(yīng)面實驗設(shè)計和結(jié)果

2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果分析

響應(yīng)面實驗結(jié)果見圖2，利用Minitab統(tǒng)計軟件進行GLM擬合和方差分析。結(jié)果中以活細胞密度為響應(yīng)的模型失擬項PValue=0.893，以蛋白表達量為響應(yīng)的模型失擬項P-Value=0.815，說明擬合結(jié)果均可用。

得到活細胞密度和蛋白表達量的擬合二次方程如下：

圖3 各組分對活細胞密度的響應(yīng)圖

圖4 各組分對蛋白表達量的響應(yīng)圖

對兩組回歸方程做等高線響應(yīng)圖分別見圖3、圖4。圖3顯示B、C項對活細胞密度有顯著影響，A與C項存在較強的交互作用；圖4顯示A、B、D和C依次對蛋白表達有顯著影響，A與D項存在較強的交互作用。

組合兩組回歸方程以最大值為目標求解可得，當(dāng)A（腐胺）=0.07mg∕L、B（檸檬酸鐵）=132.5mg∕L、C（磷酸二氫鈉）=0.84mg∕L、D（煙酰胺）=2mg∕L時活細胞密度和蛋白產(chǎn)量最高，其預(yù)測值為活細胞密度38.23×105cells∕mL，蛋白表達量236.85mg∕L。

3 結(jié)語

無血清培養(yǎng)基中通常以商業(yè)化DMEM∕F12作為基礎(chǔ)，組合不同營養(yǎng)成分取代血清來滿足細胞生長。但由于成分眾多且復(fù)雜對細胞生長和代謝的影響是不同的，通過文獻選取其中16種物質(zhì)，經(jīng)過篩選和評估實驗后發(fā)現(xiàn)其中腐胺、檸檬酸鐵對細胞生長有顯著的促進作用，而腐胺、檸檬酸鐵、煙酰胺和磷酸二氫鈉對細胞蛋白表達促進作用依次增大。優(yōu)化含量后所獲得的自研無血清培養(yǎng)基能較好的滿足CHO細胞生長和表達，其性能可達到或優(yōu)于商品化培養(yǎng)基。

結(jié)果證明，Plackett-Burman實驗設(shè)計和響應(yīng)面優(yōu)化法相結(jié)合的統(tǒng)計方法能快速、有效地篩選出能影響CHO細胞生長與表達的營養(yǎng)因子，并能通過優(yōu)化得到最佳成分配比。最終能增加CHO細胞蛋白表達量也有利于減低生產(chǎn)成本。

[1]劉定燮周曉巍黃培堂.哺乳動物細胞表達系統(tǒng)及其研究進展[J].生物技術(shù)通訊,2003,04:308-311.

[2]Huang Y M,Hu W,Rustandi E,et al.Maximizing produc?tivity of CHO cell-based fed-batch culture using chemically de?fined media conditions and typical manufacturing equipment.[J].Biotechnology Progress,2010,26(5):1400.

[3]Chun C,Heineken K,Szeto D,et al.Application of Factori?al Design to Accelerate Identification of CHO Growth Factor Re?quirements[J].Biotechnology Progress,2003,19(1):52-7.

[4]Vohra A,Satyanarayana T.Statistical optimization of the medium components by response surface methodology to enhance phytase production by Pichia anomala[J].Process Biochemistry,2002,37(9):999-1004.