王冬東，張輝靠，孫程，呂曉敏，胡榮（揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，江蘇揚(yáng)州225001）

Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化水溶性殼聚糖對黃莪凝膠水提液的除雜工藝

王冬東＊，張輝靠，孫程，呂曉敏，胡榮#（揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，江蘇揚(yáng)州225001）

目的：優(yōu)化水溶性殼聚糖對黃莪凝膠水提液除雜的工藝條件。方法：以透光率比、雜質(zhì)去除率、柚皮苷保留率的綜合評分為指標(biāo)，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化除雜工藝中水溶性殼聚糖用量、振蕩時間和溫度，并進(jìn)行驗證。結(jié)果：比重≥1.3的中藥水提液與0.01 g/mL水溶性殼聚糖溶液用量的體積比為2.2，70℃下振蕩100 min除雜效果最佳；驗證試驗中3批樣品的平均透光率比為87.3%、雜質(zhì)去除率為41.50%、柚皮苷保留率為131.38%，綜合評分的實測值分別為97.35%、98.92%、98.04%，與預(yù)測值（98.27%）的相對誤差分別為－0.87%、0.73%、－0.16%。結(jié)論：該方法可有效優(yōu)化水溶性殼聚糖對黃莪凝膠水提液的除雜工藝參數(shù)。

響應(yīng)面法；水溶性殼聚糖；中藥水提液；柚皮苷

黃莪凝膠是根據(jù)《雜病源流犀濁》書中的“接骨紫金丹”和《中醫(yī)傷科學(xué)》中的“損傷風(fēng)濕膏”，結(jié)合中醫(yī)藥活血散瘀、舒筋接骨的用藥原理，由黃瓜籽、莪術(shù)、骨碎補(bǔ)、細(xì)辛、桑枝、梔子、乳香、沒藥組成。黃瓜籽有補(bǔ)鈣、壯骨、調(diào)節(jié)經(jīng)絡(luò)、促進(jìn)人體細(xì)胞再生等作用；莪術(shù)行氣破血、消積止痛、抗病毒；細(xì)辛鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、抗菌消炎；梔子可止血消腫；桑枝有活血化瘀的作用；骨碎補(bǔ)活血止血；乳香、沒藥均具有活血止痛、消腫生肌的作用。

提取藥材中有效成分是制備黃莪凝膠的關(guān)鍵工藝，因中藥水提液都含有較多的蛋白、鞣酸和果膠等雜質(zhì)，持續(xù)的陳化對制劑質(zhì)量影響很大。中藥水提液的除雜方法中，常用的醇沉法[1]使有效成分損失大、成本高且不環(huán)保；對明膠、果膠酶、硅藻土等的除雜效果褒貶不一。而殼聚糖用于除雜時需加酸溶解，而低pH對不同中藥提取液影響差異較大，故多用于中藥口服制劑的初步研究。水溶性殼聚糖可直接溶于水，對中藥提取液影響小，但用于中藥水提液除雜目前國內(nèi)外未見報道；水溶性殼聚糖有效澄清黃莪凝膠水提液并兼作外用凝膠劑基質(zhì)的應(yīng)用也未見報道。因此，本試驗以透光率比、雜質(zhì)去除率、柚皮苷保留率為指標(biāo)，考察水溶性殼聚糖用量、反應(yīng)時間和溫度對除雜效果的影響；在單因素考察基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面[2-4]設(shè)計，確定水溶性殼聚糖對黃莪凝膠水提液除雜的最佳工藝條件。

1 材料

1.1 儀器

UV-9200紫外-可見分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）；TDL-5離心機(jī)（昆山飛鴿離心機(jī)有限公司）；e2695高效液相色譜（HPLC）儀、包含2998二極管陣列檢測器（美國Waters公司）。

1.2 藥材與試劑

水溶性殼聚糖（濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司，批號：150310，純度：95%）；黃瓜籽（亳州市中藥飲片廠，批號：150614）；莪術(shù)、細(xì)辛、梔子、骨碎補(bǔ)、桑枝、乳香、沒藥（安徽普仁中藥飲片有限公司，批號：150414、140411、140722、150121、140922、141014、150405），經(jīng)揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院丁圣清副主任中藥師鑒定為真品；柚皮苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110722-201111，純度：98%）；甲醇為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃莪凝膠水提液的制備

按處方量稱取黃瓜籽、莪術(shù)、骨碎補(bǔ)、細(xì)辛、桑枝、梔子、乳香、沒藥，加5倍量水煎煮3次，每次1 h，合并煎煮液，過濾，濃縮至比重≥1.3，即得精濾液。

2.2 水溶性殼聚糖溶液的制備

精密稱取水溶性殼聚糖適量，加蒸餾水浸透，磁力慢速攪勻，稀釋至質(zhì)量濃度為0.01 g/mL，備用。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取柚皮苷對照品0.003 1 g，加甲醇50 mL，超聲10 min，制成質(zhì)量濃度為62 μg/mL的對照品溶液。

2.3.2 陰性對照溶液的制備 按處方量稱取除骨碎補(bǔ)外其他藥材，按“2.1”項下方法處理后，取精濾液10 mL置于坩堝中，于紅外線快速干燥器中紅外燈照射除水后，研磨成粉末，加甲醇超聲10 min，備用。

2.3.3 對照藥材溶液的制備 稱取骨碎補(bǔ)藥材5 g，加甲醇超聲提取10 min，濾除藥渣備用。

2.3.4 供試品溶液的制備 精密吸取黃莪凝膠水提液10 mL置于坩堝中，于紅外線快速干燥器中紅外燈照射除水后，研磨成粉末，加甲醇超聲10 min，備用。

2.4 黃莪凝膠水提液中柚皮苷鑒別

取“2.3.1”～“2.3.4”項下溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，分別定量點于同一硅膠G254薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-88%甲酸-水（1∶12∶2.5∶3，V/V/V/V）為展開劑，展開后晾干，分別在254、365 nm波長下觀察。結(jié)果，供試品、對照品和對照藥材在同一位置上顯示柚皮苷斑點，提示水提液中保留了藥液有效成分，薄層色譜圖見圖1。

2.5 黃莪凝膠水提液柚皮苷含量的測定

2.5.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱：Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-3%醋酸（40∶60，V/V）；流速：0.8 mL/min；檢測波長：283 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。在此色譜條件下，取“2.3.1”“2.3.2”“2.3.4”項下溶液進(jìn)樣測定，結(jié)果表明其余色譜峰不干擾柚皮苷的測定，色譜圖見圖2。2.5.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取柚皮苷對照品溶液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋，定容，按“2.5.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定。以峰面積為縱坐標(biāo)（y）、柚皮苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y＝8 590.3x+1 609（r＝0.999 5），表明柚皮苷在質(zhì)量濃度為1.55～18.6 μg/mL與峰面積呈良好線性關(guān)系。

圖1 薄層色譜圖Fig 1 TLC chromatograms

圖2 高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms

2.5.3 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率試驗 按照相關(guān)要求進(jìn)行操作，考察本方法的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率。結(jié)果，精密度試驗的RSD＝0.93%（n＝5），24 h穩(wěn)定性試驗的RSD＝1.30%（n＝6），重復(fù)性試驗的RSD＝1.76%（n＝5），平均加樣回收率為98.92%（RSD＝1.47%，n＝9），均符合相關(guān)規(guī)定。

2.6 水溶性殼聚糖除雜評價指標(biāo)的選擇

2.6.1 透光率比 以蒸餾水為空白，在650 nm波長下測定除雜前后黃莪凝膠水提液透光率比。透光率比（T，%）＝除雜前透光率/除雜后透光率×100%。

2.6.2 雜質(zhì)去除率 精密量取除雜前后黃莪凝膠水提液各10 mL，置于干燥至恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，105℃恒溫2 h，冷卻1 h后精密稱定，計算雜質(zhì)去除率。雜質(zhì)去除率（Z，%）＝（除雜前黃莪凝膠水提液蒸發(fā)后精密稱定的質(zhì)量－除雜后黃莪凝膠水提液蒸發(fā)后精密稱定的質(zhì)量）/除雜前黃莪凝膠水提液蒸發(fā)后精密稱定的質(zhì)量×100%。2.6.3 柚皮苷保留率 HPLC法測定除雜前后黃莪凝膠水提液中柚皮苷含量，計算保留率。柚皮苷保留率（U，%）＝除雜后柚皮苷質(zhì)量/除雜前柚皮苷質(zhì)量×100%。

2.6.4 綜合評分（OD） 權(quán)重系數(shù)的設(shè)定[14-15]：T為0.1，Z為0.3，U為0.6；OD＝Ti/Tmax×0.1+Zi/Zmax×0.3+Ui/Umax×0.6×100%（i為1～17組各項數(shù)值，max為各項的最大值）。

2.7 除雜工藝單因素考察

2.7.1 水溶性殼聚糖的用量對除雜效果的影響 取比重為1.3的黃莪凝膠水提液25 mL，各5份，加0.01 g/mL水溶性殼聚糖溶液適量，使中藥水提液與1%水溶性殼聚糖溶液用量的體積比（S/K）分別為1.6、1.8、2.0、2.2、2.4，60℃下恒溫振蕩1 h，4℃冰箱靜置24 h，過濾。取濾液分別測定T、Z、U，并計算OD值。結(jié)果顯示，隨著S/K的增大，OD值先增大，S/K為2.2時達(dá)到最大，隨后呈下降趨勢，詳見表1。因此選擇S/K 1.8～2.2進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

表1 水溶性殼聚糖用量對除雜效果的影響Tab 1 Effects of the amount of water-soluble chitosan on clarification effect

2.7.2 振蕩時間對除雜效果的影響 取比重為1.3的黃莪凝膠水提液25 mL，共5份，固定S/K為2.0，60℃下分別恒溫振蕩20、40、60、80、100 min，4 ℃冰箱靜置24 h，過濾。取濾液分別測定T、Z、U，并計算OD值。結(jié)果顯示，隨著振蕩時間的延長，OD值先變小，再增大，振蕩時間為100 min時達(dá)到最大，隨后呈下降趨勢，詳見表

2。因此選擇振蕩時間為60～100 min進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

表2 振蕩時間對除雜效果的影響Tab 2 Effects of shocking time on clarification effect

2.7.3 溫度對除雜效果的影響 取比重為1.3的黃莪凝膠水提液25 mL，共5份，固定S/K為2.0，分別在40、50、60、70、80 ℃條件下振蕩60 min，4 ℃冰箱靜置24 h，過濾。取濾液分別測定T、Z、U，并計算OD值。結(jié)果顯示，隨著溫度的增加，OD值先變小，再增大，溫度70℃時達(dá)到最大，隨后呈下降趨勢，詳見表3。因此擇振蕩時間為50～70℃進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

2.8 響應(yīng)面法優(yōu)選除雜工藝條件

2.8.1 Box-Behnken設(shè)計 采用Box-Behnken響應(yīng)面法，以T、Z、U、OD為評價指標(biāo)，溫度（X1）、振蕩時間（X2）、S/K（X3）為影響因素，進(jìn)行試驗設(shè)計。Box-Behnken設(shè)計因素與水平見表4；Box-Behnken設(shè)計安排與結(jié)果見表5。

表3 溫度對除雜效果的影響Tab 3 Effects of temperature on clarification effect

表4 Box-Behnken設(shè)計因素與水平Tab 4 Box-Behnken design factors and levels

表5 Box-Behnken設(shè)計安排與結(jié)果Tab 5 Box-Behnken design arrangement and results

2.8.2 方差分析及回歸方程 用Design Expert 7.0.0軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得到以響應(yīng)值（y）為目標(biāo)函數(shù)的二次多項回歸方程y＝83.09+2.95X1+3.24X2+4.41X3+1.36X1X2+1.29X1X3－0.12X2X3－1.14X12+0.24X22+3.14X32（R2＝0.966 0）。對模型進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗，結(jié)果見表6。

由表6可知，該模型F值為51.49（P＜0.000 1），說明模型具有統(tǒng)計學(xué)意義；模型的確定系數(shù)R2為0.966 0、變異系數(shù)為1.03%，提示模型擬合度較好，可用其進(jìn)行初步分析和預(yù)測。回歸方程的失擬項F值為1.87，P＝0.275 0＞0.05，表明失擬項不顯著，無失擬因素存在，說明方程擬合度良好，可用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結(jié)果進(jìn)行分析。一次項X1、X2、X3（P＜0.000 1），交互項 X1X2（P＝0.016 5）、X1X3（P＝0.021 2），二次項 X12（P＝0.031 0）、X32（P＝0.000 1）對響應(yīng)值作用顯著，且X1X2、X1X3對響應(yīng)值有較強(qiáng)的交互作用。

2.8.3 響應(yīng)面圖分析 采用Design Expert 7.0.0軟件繪制等高線圖和響應(yīng)面圖，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，X1X2和X1X3交互對結(jié)果的影響較大，剩余指標(biāo)間影響不顯著。按此結(jié)果并結(jié)合模擬方程進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳除雜工藝為S/K 2.2、70℃振蕩100 min；OD預(yù)測值為98.2%。

表6 方差分析結(jié)果Tab 6 Analysis of variance results

圖3 X1、X2、X3對OD的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig 3 Contour plots and response surface of X1，X2，X3 to OD

2.8.4 驗證試驗 按處方量稱取藥材3份，按上述最優(yōu)條件進(jìn)行除雜，分別測定各指標(biāo)及OD。結(jié)果，3份樣品T、Z、U分別為87.3%、41.50%、131.38%，OD實測值分別為97.35%、98.92%、98.04%，與預(yù)測值的相對誤差分別為－0.87%、0.73%、－0.16%。驗證試驗結(jié)果詳見表7。

表7 驗證試驗結(jié)果Tab 7 Results of verification test

3 討論

3.1 選擇柚皮苷含量作為水提液除雜效率考察指標(biāo)的依據(jù)

2015年版《中國藥典》（一部）未收錄黃瓜籽，《中華本草》中記載其具有續(xù)筋接骨、祛風(fēng)、消痰的功效；其有效成分主要是揮發(fā)油，也含有黃酮類化合物[5-7]。莪術(shù)、細(xì)辛、乳香、沒藥有效成分主要是揮發(fā)油，《中國藥典》對這幾味藥材的質(zhì)控指標(biāo)都是揮發(fā)油的含量?！吨袊幍洹穼撬檠a(bǔ)、梔子和桑枝的質(zhì)控指標(biāo)分別是柚皮苷、梔子苷和乙醇浸膏，桑枝的有效成分主要是黃酮類化合物[8-11]。以《中國藥典》和《中華本草》為依據(jù)，確定由上述藥材組方制備的黃莪凝膠含量質(zhì)控指標(biāo)有兩項，一是總揮發(fā)油，二是以柚皮苷計的黃酮類化合物。

水提液除雜主要考察黃莪凝膠質(zhì)控指標(biāo)成分柚皮苷的含量變化情況。本文“2.1”項為黃莪凝膠水提液的制備，水煎煮在多功能提取罐中進(jìn)行，揮發(fā)油蒸發(fā)冷凝在接收器中，水提液由提取罐底部放出進(jìn)行除雜處理。主要由黃瓜籽、莪術(shù)、細(xì)辛、乳香、沒藥貢獻(xiàn)的揮發(fā)油部分不涉及水溶性殼聚糖除雜處理，故本文未涉及。

3.2 柚皮苷保留率超過了100%%的解釋

中草藥水提液都含有較多的蛋白、鞣酸和果膠、黏液質(zhì)等親水性雜質(zhì)，其分子表面形成很厚的水化膜，水化膜也包裹了柚皮苷等藥效成分，因這些高分子雜質(zhì)水化膜的高黏度和高滲透壓使被包裹的柚皮苷等有效成分不能釋放出來，即除雜前檢測到的是未被包裹的柚皮苷。

水溶性殼聚糖也是高分子化合物，其沉淀蛋白質(zhì)、鞣酸和果膠、黏液質(zhì)等高分子雜質(zhì)的主要機(jī)制包括結(jié)構(gòu)絮凝和電性中和。在較高溫度（70℃）下，高分子雜質(zhì)水化膜因黏度和滲透壓大幅度降低而變薄，溫度高使水分子熱運(yùn)動加劇也使水化膜變薄，電性中和也使水化膜變薄，加上100 min的70℃恒溫振蕩或攪拌，使舒展的高分子雜質(zhì)分子鏈卷曲纏繞成團(tuán)，擠壓變薄的水化膜使其破裂，失去水化膜的高分子雜質(zhì)水溶液穩(wěn)定性降低而沉淀下來；也有多個線團(tuán)狀高分子雜質(zhì)聚集搭在殼聚糖分子鏈上使比重進(jìn)一步增加，使該結(jié)構(gòu)絮凝聚沉下來。高分子雜質(zhì)水化膜破壞的同時，被包裹的柚皮苷等有效成分完全釋放出來，能通過HPLC含量測定時樣品溶液經(jīng)0.45 μm過濾的微孔濾膜而被檢測到，即除雜后未被包裹的柚皮苷和被包裹除雜釋放出來的柚皮苷可同時被檢測到，因此其保留率可超過100%。

3.3 應(yīng)用Box-Behnken設(shè)計的優(yōu)點和水溶性殼聚糖除雜的優(yōu)勢

本研究開展Box-Behnken[12-13]優(yōu)化除雜工藝試驗，在單因素考察基礎(chǔ)上，連續(xù)對17組試驗的各個水平進(jìn)行分析，在整個區(qū)域得到回歸方程，從而得到響應(yīng)值的最優(yōu)組合，試驗精確度高。響應(yīng)面法在設(shè)計時，試驗點必須包括試驗的最佳條件，否則不能得到很好的優(yōu)化結(jié)果。

本試驗首次采用水溶性殼聚糖作為澄清劑，其對蛋白質(zhì)、鞣酸、色素、膠質(zhì)等具有較強(qiáng)的絮凝作用，克服了以往使用殼聚糖加酸[14-15]溶解致低pH對有效成分帶來的不良影響，對以柚皮苷為代表的黃酮類成分以及其他有效成分有較高的保留率。水溶性殼聚糖還可兼作外用凝膠劑基質(zhì)，利于藥效的發(fā)揮，可輔助創(chuàng)面愈合。

此外，筆者在試驗中發(fā)現(xiàn)，水提液除雜后，于4℃冰箱冷藏靜置后過濾的澄清液柚皮苷保留率比室溫靜置后過濾的澄清液更高，故建議除雜后水提液于低溫放置，使雜質(zhì)沉淀更完全；另外薄層色譜鑒別時365 nm下的熒光斑點較254 nm下的暗斑更容易觀察，建議應(yīng)根據(jù)實際情況改變經(jīng)典鑒別方法條件。

綜上所述，Box-Behnken響應(yīng)面法可有效優(yōu)化水溶性殼聚糖澄清黃莪凝膠水提液工藝參數(shù)。

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（編輯：劉明偉）

Optimization of Clarification Technology of Water-soluble Chitosan on Huang’e Gel Water Extract by Box-Behnken Response Surface Method

WANG Dongdong，ZHANG Huikao，SUN Cheng，LYU Xiaomin，HU Rong（Dept.of Pharmacy，Medical College of Yangzhou University，Jiangsu Yangzhou 225001，China）

OBJECTIVE：To optimize the technology conditions of water-soluble chitosan on Huang’e gel water extract solution.METHODS：Using the comprehensive scores of transmittance ratio，impurity removal rate，naringin retention rate as indexes，Box-Behnken response surface method was used to optimize the amount of water-soluble chitosan，shocking time and temperature in clarifying technology，and verification test was conducted.RESULTS：The clarification effect was the best when the volume ratio of TCM extract solution with proportion≥1.3 to amount of 0.01 g/mL water-soluble chitosan was 2.2，shocking for 100 min at 70℃.In the verification test，the average transmittance ratio was 87.3%，impurity removal rate was 41.5%，and naringin retention rate was 131.38%.The measured values of comprehensive scores were 97.35%，98.92%and 98.04%，showing relative error of－0.87%，0.73%and－0.16%with the predicted values（98.27%），respectively.CONCLUSIONS：The method can effectively optimize the clarification technology parameters of water-soluble chitosan on Huang’e gel water extract solution.

Response surface method；Water-soluble chitosan；TCM extract solution；Naringin

R284.2

A

1001-0408（2017）28-3987-05

2017-01-23

2017-08-20）

＊碩士研究生。研究方向：藥劑學(xué)。電話：0514-87978840。E-mail：1606974450@qq.com

#通信作者：教授，碩士。研究方向：藥劑學(xué)。電話：0514-87978840。E-mail：398563432@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.28.27