張鵬，郝銀菊，任俊，韓亮娟，余建強(qiáng)，張萬(wàn)年，周茹，3，4，5#（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院藥劑科，銀川750004；.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，銀川 750004；3.寧夏回藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心，銀川 750004；4.寧夏回醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，銀川 750004；5.寧夏醫(yī)科大學(xué)回醫(yī)藥現(xiàn)代化省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004）

回藥核心方油溶液對(duì)離體大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)的舒張作用及機(jī)制研究Δ

張鵬1＊，郝銀菊2，任俊2，韓亮娟2，余建強(qiáng)2，張萬(wàn)年2，周茹2，3，4，5#（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院藥劑科，銀川750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，銀川 750004；3.寧夏回藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心，銀川 750004；4.寧夏回醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，銀川 750004；5.寧夏醫(yī)科大學(xué)回醫(yī)藥現(xiàn)代化省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004）

目的：研究回藥核心方油溶液對(duì)離體大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)的舒張作用及機(jī)制，為其用于心血管疾病的治療提供參考。方法：取出大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)后浸泡于克氏營(yíng)養(yǎng)液（K-H）中，以1×10－6mol/L去甲腎上腺素（PE）或60 mmol/L氯化鉀（KCl）致血管環(huán)收縮，采用生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)測(cè)定0.020 4、0.040 8、0.061 2、0.081 6、0.102 0 mg/mL核心方油溶液對(duì)血管環(huán)的舒張作用，計(jì)算舒張率；分別以0.1 mmol/L一氧化氮合酶抑制劑左旋硝基精氨酸甲酯（L-NAME）、環(huán)氧合酶抑制劑吲哚美辛（INDO）、鉀離子通道阻滯劑格列本脲（Gli）孵育血管環(huán)20 min后，測(cè)定上述5種質(zhì)量濃度核心方油溶液對(duì)PE預(yù)收縮血管環(huán)的舒張作用，計(jì)算舒張率；試驗(yàn)均以K-H溶液為空白對(duì)照。結(jié)果：與空白對(duì)照比較，0.020 4～0.102 0 mg/mL核心方油溶液對(duì)PE、KCl預(yù)收縮血管環(huán)均有明顯的舒張作用（P＜0.05或P＜0.01），且具有濃度依賴性。INDO預(yù)處理后可減弱核心方油溶液對(duì)PE預(yù)收縮血管環(huán)的舒張作用，舒張率較空白對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而Gli、L-NAME預(yù)處理不影響核心方油溶液對(duì)PE預(yù)收縮血管環(huán)的舒張作用，舒張率較空白對(duì)照組仍明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論：核心方油溶液可呈濃度依賴性地舒張PE、KCl預(yù)收縮的胸主動(dòng)脈血管環(huán)，其作用機(jī)制可能與激活環(huán)氧合酶途徑有關(guān)。

回藥；核心方油溶液；離體胸主動(dòng)脈血管環(huán)；血管舒張；環(huán)氧合酶抑制劑；鉀離子通道阻滯劑；一氧化氮合酶抑制劑

腦卒中是急性腦循環(huán)障礙所致的局限性或全面性腦功能缺損綜合征，或稱急性腦血管事件。腦卒中是目前危害人類健康的重要疾病之一，在世界范圍內(nèi)已成為第二大死亡原因和殘疾的首要原因，其具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高致殘率和高致死率的特點(diǎn)[1]。不同類型的腦卒中治療方式不同，但由于一直缺乏有效的治療手段，目前認(rèn)為預(yù)防是最好的措施。而高血壓是導(dǎo)致腦卒中的重要的可控性危險(xiǎn)因素，因此，降壓治療對(duì)預(yù)防腦卒中的發(fā)病和復(fù)發(fā)尤為重要。

回族醫(yī)藥“四性學(xué)說(shuō)”“真一七行論”獨(dú)特的理論體系已被社會(huì)廣泛認(rèn)可，在寧夏地區(qū)已有數(shù)百年的傳承與發(fā)展[2]。臨床上回藥以復(fù)方方劑應(yīng)用為主，以運(yùn)用香藥為特色。核心方油溶液是取中藥材海狗腎、沒藥、紅花、蓽茇、肉桂各12 g和胡椒6 g，與輔料壓片制成飲片，用一定溶劑提取有效成分，蒸去大半部分溶劑，調(diào)整濃度后制成的油溶液。其主藥為富含動(dòng)植物揮發(fā)油的香藥，通過(guò)“理氣調(diào)性”“芳香開竅”“散結(jié)化瘀”等特色治療原理，激發(fā)人體自身的調(diào)理與再生之潛能[3]。依據(jù)回醫(yī)理論，核心方油溶液可能對(duì)腦卒中有對(duì)癥治療作用。故本研究通過(guò)觀察核心方油溶液對(duì)大鼠離體腦主動(dòng)脈血管環(huán)張力的影響，并結(jié)合不同抑制劑處理后其張力的變化，探討核心方油溶液對(duì)大鼠血管環(huán)的作用及可能機(jī)制，為該溶液臨床用于治療心腦血管疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；Powerlab生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)（寧夏醫(yī)科大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室提供）；HSS-1B數(shù)字式超級(jí)恒溫泵（成都儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

核心方油溶液（寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥劑實(shí)驗(yàn)室提供，批號(hào)：20150413，規(guī)格：0.204 mg/mL）；去氧腎上腺素（PE，上海禾豐制藥有限公司，批號(hào)：07150801）；四乙胺（上海譜諾泰化工有限公司，批號(hào)：20110817）；吲哚美辛（INDO，上海振生物醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：20110520）；格列本脲（Gli）、左旋-硝基-精氨酸甲酯（L-NAME）均購(gòu)自上海將來(lái)實(shí)業(yè)股份有限公司（批號(hào)：075K1376、51298-62-5）；其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠，♂，體質(zhì)量220～320 g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：XYXK（寧）2005-0001。

2 方法

2.1 大鼠胸主動(dòng)脈離體血管環(huán)的制備

20%烏拉坦（5 mL/kg）ip麻醉大鼠，沿胸部正中切開，分離胸主動(dòng)脈。將取下的胸主動(dòng)脈迅速移入通有95%O2和5%CO2混合氣體的克氏營(yíng)養(yǎng)液（K-H）中。小心剔除血管周圍的脂肪及結(jié)締組織，剪成3～4 mm長(zhǎng)的血管環(huán)[4-5]，懸掛于37℃預(yù)熱、容量為10 mL的水浴槽內(nèi)[6]，一端用m型鉤固定，另一端通過(guò)張力換能器連接生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)。持續(xù)通以95%O2和5%CO2混合氣體，調(diào)節(jié)靜息張力為2.0 g，每20 min換K-H液1次，37℃下穩(wěn)定1 h[7]。用KCl刺激血管環(huán)收縮值達(dá)峰值（即血管環(huán)的收縮張力不再變化），K-H液沖洗，重復(fù)3次，以誘發(fā)血管環(huán)的最大收縮幅度。用1×10－6mol/L的PE預(yù)收縮血管環(huán)，待張力穩(wěn)定后加入1×10－5mol/L乙酰膽堿（ACh），待血管舒張達(dá)80%以上，可認(rèn)為內(nèi)皮完整。

2.2 核心方油溶液對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)血管環(huán)的作用

將大鼠離體胸主動(dòng)脈血管環(huán)在37℃的水浴槽（容量為10 mL）內(nèi)穩(wěn)定1 h，用累積給藥法[8]，每隔2 min往水浴槽中加入核心方油溶液1次，每次加藥0.1 mL，使灌流液中核心方油溶液的累積質(zhì)量濃度分別為0.020 4、0.040 8、0.061 2、0.081 6、0.102 0 mg/mL，作為核心方油溶液組，通過(guò)張力換能器反映出的張力觀察血管環(huán)張力變化；另以K-H液代替核心方油溶液累積加入，作為空白對(duì)照組。根據(jù)加入藥物后的血管張力幅度/PE或KCl誘發(fā)最大收縮幅度×100%計(jì)算各組的舒張率，繪制累積質(zhì)量濃度-血管舒張率曲線。試驗(yàn)重復(fù)6次。

2.3 核心方油溶液對(duì)PE或KCl預(yù)收縮血管環(huán)的舒張作用

將血管環(huán)在37℃水浴槽內(nèi)穩(wěn)定1 h后，將試驗(yàn)分為核心方油溶液組和空白對(duì)照組。核心方油溶液組加入1×10－6mol/L的PE 0.1 mL或60 mmol/L的KCl 0.2 mL預(yù)收縮，然后每隔2 min往水浴槽中加入核心方油溶液0.1 mL，使核心方油溶液累積質(zhì)量濃度分別為0.020 4、0.040 8、0.061 2、0.081 6、0.102 0 mg/mL，通過(guò)張力換能器反映出的張力觀察血管環(huán)的張力變化；以K-H液代替核心方油溶液累積加入作為空白對(duì)照組。按“2.2”項(xiàng)下方法計(jì)算舒張率。試驗(yàn)重復(fù)6次。

2.4 L-NAME、Gli和INDO對(duì)核心方油溶液舒張血管環(huán)的影響

分別以0.1 mmol/L的L-NAME、Gli和INDO孵育血管環(huán)20 min，然后以1×10－6mol/L的PE 0.1 mL預(yù)收縮血管環(huán)。按照“2.2”項(xiàng)下方法加藥并計(jì)算舒張率。試驗(yàn)重復(fù)6次。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 核心方油溶液對(duì)離體大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)基礎(chǔ)張力的影響結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，在不同質(zhì)量濃度下核心方油溶液組大鼠離體血管舒張率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明核心方油溶液對(duì)正常血管環(huán)沒有舒張作用，結(jié)果見圖1。

圖1 不同質(zhì)量濃度核心方油溶液對(duì)大鼠離體胸主動(dòng)脈血管環(huán)的舒張作用Fig 1 Diastolic effect of Hexin oil solution with different mass concentrations on isolated thoracic aortic vascular rings of rats

3.2 核心方油溶液對(duì)PE或KCl預(yù)收縮血管環(huán)舒張作用的影響結(jié)果

0.020 4～0.102 0 mg/mL核心方油溶液對(duì)PE或KCl預(yù)收縮血管環(huán)均有較好的舒張作用，且具有明顯的量效關(guān)系。與空白對(duì)照組比較，在不同質(zhì)量濃度下，核心方油溶液組大鼠離體血管環(huán)的舒張率均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），結(jié)果見圖2。

圖2 不同質(zhì)量濃度核心方油溶液對(duì)PE或KCl預(yù)收縮胸血管環(huán)的舒張作用Fig 2 Diastolic effect of Hexin oil solution with different mass concentrations on vascular rings precontracted by PE or KCl

3.3 核心方油溶液對(duì)L-NAME、Gli、INDO預(yù)處理后的PE預(yù)收縮血管環(huán)舒張作用的影響結(jié)果

L-NAME、Gli預(yù)處理后，核心方油溶液對(duì)PE預(yù)收縮血管環(huán)仍有較好的舒張作用；與空白對(duì)照組比較，在不同質(zhì)量濃度下核心方油溶液組血管環(huán)舒張率均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），提示L-NAME、Gli對(duì)核心方油溶液舒張血管無(wú)明顯抑制作用。而INDO預(yù)處理后，核心方油溶液對(duì)PE預(yù)收縮血管環(huán)的舒張作用不明顯；與空白對(duì)照組比較，在不同質(zhì)量濃度下核心方油溶液組血管環(huán)舒張率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示INDO預(yù)處理對(duì)核心方油溶液舒張血管有明顯的抑制作用，結(jié)果見圖3。

4 討論

核心方中的芳香開竅藥胡椒、蓽茇中的胡椒堿可以縮小大鼠中動(dòng)脈阻塞（MCAO）面積，改善MCAO大鼠梗死后神經(jīng)功能缺損，具有一定的腦保護(hù)作用；并且胡椒堿可抑制MCAO大鼠缺血半暗帶內(nèi)的細(xì)胞凋亡，這一過(guò)程可能與抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3蛋白的表達(dá)有關(guān)[9]。肉桂中的肉桂醛對(duì)缺血腦組織中的Toll樣受體4（TLR4）、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）、轉(zhuǎn)錄核因子κB（NF-κB）表達(dá)的抑制程度與其對(duì)腦保護(hù)作用及抗炎癥損傷作用一致，提示肉桂醛有可能通過(guò)抑制TLR4/TRAF6/NF-κB炎癥通路，從而減輕缺血腦組織的過(guò)度炎癥反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)缺血后的腦保護(hù)作用[10]。以上結(jié)果均提示，核心方油溶液對(duì)缺血性腦疾病有較好的療效。

圖3 不同質(zhì)量濃度核心方油溶液對(duì)L-NAME、INDO、Gli預(yù)處理后的PE預(yù)收縮血管環(huán)的舒張作用Fig 3 Diastolic effect of Hexin oil solution with different mass concentrations on vascular rings precontracted by PE after L-NAME，INDO，Gli pre-treatment

血管平滑肌上主要有兩種鈣通道，即受體操作性鈣通道（ROC）和電壓依賴性鈣通道（VDC）[11]，其分別可被PE和KCl激活，使細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流增加，引起血管收縮。KCl誘導(dǎo)的血管收縮，其機(jī)制主要是使VDC開放，細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，從而增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度。激活的ROC引起細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放，使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)游離Ca2+濃度升高，從而收縮血管平滑肌[12]。本研究中，核心方油溶液對(duì)KCl、PE預(yù)收縮血管環(huán)具有舒張作用，提示其舒張血管的作用可能與Ca2+通道有關(guān)，降低Ca2+內(nèi)流是核心方油溶液舒張血管的機(jī)制之一。

內(nèi)皮細(xì)胞釋放的血管舒張物質(zhì)在血管平滑肌張力的調(diào)節(jié)過(guò)程起重要的作用[13]。NO是內(nèi)皮源性的松弛因子，在內(nèi)皮細(xì)胞NO合酶（eNOS）的作用下，由精氨酸合成釋放進(jìn)入平滑肌細(xì)胞，作用于可溶性鳥苷酸環(huán)化酶，促使環(huán)磷鳥嘌呤核苷（cGMP）的生成，cGMP通過(guò)抑制肌球蛋白輕鏈激酶舒張血管[14]。本研究結(jié)果顯示，用eNOS抑制劑L-NAME預(yù)孵育內(nèi)皮完整血管環(huán)，對(duì)核心方油溶液舒張血管作用無(wú)顯著影響，說(shuō)明核心方油溶液舒張血管的作用與eNOS無(wú)關(guān)。內(nèi)皮細(xì)胞中環(huán)氧合酶（COX）中起潛在的催進(jìn)作用，內(nèi)皮依賴性收縮可被非選擇性COX抑制劑所阻滯。用COX抑制劑INDO孵育血管環(huán)后，發(fā)現(xiàn)核心方油溶液舒張血管環(huán)的作用受到明顯抑制，說(shuō)明其舒張血管的作用與COX有關(guān)。

K+通道活性的改變可使動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜電位去極化或超極化，是參與動(dòng)脈血管舒縮調(diào)節(jié)的重要機(jī)制[15-16]。為了解核心方油溶液的舒張血管作用和K+的關(guān)系，本研究觀察了K+通道阻滯劑Gli對(duì)核心方油溶液舒張血管環(huán)作用的影響。結(jié)果顯示，Gli預(yù)孵育后，對(duì)核心方油溶液舒張血管環(huán)的作用無(wú)明顯影響，說(shuō)明其舒張血管環(huán)的作用與K+通道無(wú)關(guān)。

綜上所述，核心方油溶液對(duì)正常大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)無(wú)影響；對(duì)KCl或PE預(yù)收縮的血管環(huán)有濃度依賴性的舒張作用；eNOS抑制劑L-NAME和K+通道阻滯劑Gli都不能抑制核心方油溶液對(duì)PE預(yù)收縮血管環(huán)的舒張作用，而COX抑制劑INDO則可以抑制核心方油溶液對(duì)PE預(yù)收縮血管環(huán)的舒張作用，提示其舒張血管環(huán)的作用與eNOS和K+通道無(wú)關(guān)，與激活COX有關(guān)。但核心方油溶液舒張血管的更多作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Study on the Diastolic Effect and Mechanism of Hui Medicine Hexin Oil Solution on Isolated Thoracic Aortic Vascular Rings of Rats

ZHANG Peng1，HAO Yinju2，REN Jun2，HAN Liangjuan2，YU Jianqiang2，ZHANG Wannian2，ZHOU Ru2，3，4，5（1.Dept.of Pharmacy，General Hospital of Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China；2.School of Pharmacy，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China；3.Ningxia Modernization Engineering Technology Research Center for Hui Medicine，Yinchuan 750004，China；4.Ningxia Collaborative Innovation Center for Hui Medicine，Yinchuan 750004，China；5.Modernization Key Laboratory for Hui Medicine Co-founded by Ningxia Province and Ministry of Education，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China）

OBJECTIVE：To study the diastolic effect and mechanism of Hui medicine Hexin oil solution on isolated thoracic aortic vascular rings of rats，and provide reference for its treatment for cardiovascular diseases.METHODS：Thoracic aortic vascular rings of rats were taken and then soaked in Kelvin’s nutrient solution（K-H）.Using 1×10－6mol/L norepinephrine（PE）or 60 mmol/L potassium chloride（KCl）for inducing the contraction of vascular rings，biological signal acquisition and analysis system was used to determine the diastolic effect and mechanism of Hexin oil solution with concentrations of 0.020 4，0.040 8，0.061 2，0.081 6，0.102 0 mg/mL on vascular rings，and diastolic rate was calculated.After culturing vascular rings by 0.1 mmol/L nitric oxide synthase inhibitor L-nitro-arginine methyl ester（L-NAME），cyclooxygenase inhibitor indomethacin（INDO），and potassium ion channel blocker glibenclamide（Gli）for 20 min，the diastolic effects of above-mentioned 5 mass concentrations of Hexin oil solution on the contraction of vascular rings pre-contracted by PE were determined，and diastolic rate was calculated.The test was based on K-H solution as blank control.RESULTS：Compared with blank control，Hexin oil solution with concentration of 0.020 4-0.102 0 mg/mL had obvious diastolic effect on the contraction of vascular rings induced by PE and KCl（P＜0.05 or P＜0.01），showing concentration-dependent relationship.INDO pre-treatment can relieve the diastolic effect of Hexin oil solution on vascular rings pre-contracted by PE；and compared with blank control group，the diastolic rate had no statistical significance（P＞0.05）.While the pre-treatment of Gli，L-NAME did not affect the diastolic effect of Hexin oil solution on vascular rings pre-contracted by PE；and compared with blank control group，diastolic rate was obviously increased（P＜0.05 or P＜0.01）.CONCLUSIONS：Hexin oil solution can concentration-dependently conduct the relaxation of thoracic aortic vascular rings pre-contracted by PE，KCl.The mechanism may be associated with activation of cyclooxygenase pathway.

Hui medicine；Hexin oil solution；Isolated thoracic aorta vascular ring；Vasodilation；Cyclooxygenase inhibitors；Potassium channel blockers；Nitric oxide synthase inhibitors

R285

A

1001-0408（2017）28-3952-04

2017-04-18

2017-08-12）

（編輯：林 靜）

國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題（No.2013BAI11B07）；寧夏回族自治區(qū)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（No.2012）；大學(xué)生創(chuàng)新/創(chuàng)業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目（No.201510752008）

＊副主任藥師。研究方向：臨床藥學(xué)。電話：0951-6743353。E-mail：13895182622@163.com

#通信作者：副教授，博士。研究方向：心腦血管藥理學(xué)。電話：0951-6980192。E-mail：zhour-ru926@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.28.18