王霞，楊健，宋菲，董莉，劉亭，鄭林，馬雪，李勇軍#（.貴州醫(yī)科大學(xué)民族藥與中藥開(kāi)發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心/國(guó)家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴陽(yáng) 550004；.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴陽(yáng)550004；.貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550004）

·民族醫(yī)藥·

苗藥黑骨藤中咖啡?；鼘幩犷?lèi)部位對(duì)人類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞MH7A增殖及炎癥因子分泌的影響Δ

王霞1，2＊，楊健2，3，宋菲1，2，董莉2，劉亭3，鄭林3，馬雪1，李勇軍1#（1.貴州醫(yī)科大學(xué)民族藥與中藥開(kāi)發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心/國(guó)家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴陽(yáng) 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴陽(yáng)550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550004）

目的：研究苗藥黑骨藤中咖啡?；鼘幩犷?lèi)部位（CADF）對(duì)腫瘤壞死因子α（TNF-α）誘導(dǎo)的人類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）成纖維樣滑膜細(xì)胞MH7A增殖及炎癥因子分泌的影響，探討CADF抗RA的作用機(jī)制。方法：將MH7A細(xì)胞分為空白組、TNF-α模型組、甲氨蝶呤組（陽(yáng)性對(duì)照，20 mg/L）和CADF不同質(zhì)量濃度組（50、100、200、400 mg/L），除空白組外，其余各組均以50 μg/LTNF-α刺激活化MH7A細(xì)胞。以TNF-α與相應(yīng)藥物的混合液共同作用24 h后，檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況和培養(yǎng)液中一氧化氮（NO）、前列腺素E2（PGE2）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素6（IL-6）的含量。結(jié)果：與空白組比較，TNF-α模型組細(xì)胞增殖活性顯著增強(qiáng)（P＜0.01），培養(yǎng)液中NO、PGE2、IL-1β、IL-6含量顯著增加（P＜0.01）；與TNF-α模型組比較，各給藥組細(xì)胞的增殖均受到顯著抑制（P＜0.05或P＜0.01），培養(yǎng)液中NO、PGE2、IL-1β、IL-6含量均顯著減少（P＜0.01），且與CADF具有一定的量效關(guān)系。結(jié)論：CADF可通過(guò)抑制TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞增殖，減少炎癥因子NO、PGE2、IL-1β、IL-6的分泌，從而發(fā)揮其抗RA的作用。

苗藥；黑骨藤；咖啡?；鼘幩犷?lèi)部位；人類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞MH7A；炎癥因子

黑骨藤為蘿藦科杠柳屬植物黑龍骨（Periploca forrestii Schltr.）的干燥根或全株，有通經(jīng)、活血和祛風(fēng)等功效，用于風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、跌打損傷等癥的治療，被收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2003年版）中，是貴州省苗族常用藥材之一[1]。臨床應(yīng)用結(jié)果也顯示，黑骨藤及其復(fù)方制劑對(duì)風(fēng)濕病和類(lèi)風(fēng)濕病有較好的療效[2]。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，黑骨藤水溶性部位為抗類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）的活性部位。對(duì)黑骨藤70%乙醇提取物用大孔樹(shù)脂富集、80%乙醇洗脫并進(jìn)行成分分析后發(fā)現(xiàn)，80%乙醇洗脫部位主要含有咖啡?；鼘幩犷?lèi)成分[將該部位記為咖啡?；鼘幩犷?lèi)部位（CADF）][3]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，咖啡酰基奎寧酸類(lèi)成分具有抗氧化、抗炎等作用[4]。為探討其抗RA活性，本研究在前期研究基礎(chǔ)上，以黑骨藤中CADF為研究對(duì)象，考察其對(duì)人類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞MH7A的增殖及炎癥因子分泌的影響，在細(xì)胞水平上探討CADF抗RA的作用及機(jī)制，為黑骨藤的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

UV-2401 PC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）；TS100倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；Fresco17冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；680酶標(biāo)儀（上海伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

黑骨藤藥材購(gòu)自貴陽(yáng)市萬(wàn)東中藥材市場(chǎng)，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)藥用植物學(xué)與生藥學(xué)教研室龍慶德副教授鑒定為真品；注射用甲氨蝶呤（MTX，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：16031416，規(guī)格：0.1 g/瓶）；重組人腫瘤壞死因子α（TNF-α）蛋白（美國(guó)泒普泰克公司，批號(hào)：300-01A）；3-O-咖啡?；鼘幩釋?duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：RO5F6F1，純度：≥98%）；一氧化氮（NO）試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：S0021-3）；前列腺素E2（PGE2，批號(hào)：20161021）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β，批號(hào)：20161028）、白細(xì)胞介素6（IL-6，批號(hào)：20161027）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純。

1.3 細(xì)胞

人類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞MH7A購(gòu)自廣州吉尼歐生物有限公司（細(xì)胞來(lái)源于日本RIKEN研究所生物資源中心）。

2 方法

2.1 CADF的制備

取干燥黑骨藤藥材粗粉15 kg，用70%乙醇回流提取3次，每次1.5 h，回收乙醇，干燥后得到70%乙醇提取物浸膏1 920.5 g。用水將浸膏溶解后用D101大孔樹(shù)脂吸附，然后依次用水、80%乙醇洗脫，收集80%乙醇洗脫部位，回收乙醇，干燥得80%乙醇組分641.7 g，將該部位記為CADF。以3-O-咖啡酰基奎寧酸為對(duì)照品，采用紫外-可見(jiàn)光分光光度法對(duì)CADF中總咖啡?；鼘幩狨ヮ?lèi)化合物進(jìn)行含量測(cè)定，含量為61.5%。將CADF用二甲基亞砜（DMSO）制備成100 g/L的母液，于－20℃條件下保存，備用。臨用前用培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 mg/L鏈霉素和1×105u/L青霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞隔天換液，每3～4天進(jìn)行1次傳代，選取5～10代生長(zhǎng)良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)

采用MTS法測(cè)定細(xì)胞增殖活性。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，以含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液制成細(xì)胞密度為1×105mL－1的單細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔100 μL。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄原培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細(xì)胞，將試驗(yàn)分為空白組（空白DMEM高糖培養(yǎng)液）、TNF-α模型組（加入終質(zhì)量濃度為50 μg/L的TNF-α溶液）、MTX組（陽(yáng)性對(duì)照，加入終質(zhì)量濃度為 20 mg/L MTX與50 μg/L TNF-α的混合液）及CADF不同質(zhì)量濃度組（加入終質(zhì)量濃度為50、100、200、400 mg/L CADF與50 μg/L TNF-α的混合液），每孔100 μL，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液；每孔加入5 μL的MTS，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，于酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（A）。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率（%）＝（TNF-α模型組A值－藥物組A值）/TNF-α模型組A值×100%。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 CADF對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞釋放NO的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按“2.3”項(xiàng)下方法分組、給藥，每個(gè)質(zhì)量濃度平行設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，分別吸取培養(yǎng)液上清50 μL于酶標(biāo)板中，先加入格里斯試劑Ⅰ（GriessⅠ）50 μL，然后再加入GriessⅡ 50 μL，混勻后于酶標(biāo)儀540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值，按照NO試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)定培養(yǎng)液中NO的含量。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 CADF對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞釋放PGE2、IL-1β、IL-6的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按“2.3”項(xiàng)下方法分組、給藥，每個(gè)質(zhì)量濃度平行設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，分別吸取培養(yǎng)液上清，按照相應(yīng)的試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)定培養(yǎng)液中PGE2、IL-1β、IL-6的含量。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞增殖抑制率測(cè)定結(jié)果

與空白組比較，TNF-α模型組細(xì)胞明顯增殖（P＜0.01）。與TNF-α模型組比較，各給藥組細(xì)胞的增殖均受到明顯抑制（P＜0.05）；且CADF對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用具有濃度依賴(lài)性，當(dāng)CADF質(zhì)量濃度為400 mg/L時(shí)，其對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)30.8%，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞增殖抑制率測(cè)定結(jié)果（±s，n＝3）Tab 1 Determination results of cell proliferation inhibitory rate in each group（±s，n＝3）

表1 各組細(xì)胞增殖抑制率測(cè)定結(jié)果（±s，n＝3）Tab 1 Determination results of cell proliferation inhibitory rate in each group（±s，n＝3）

注：與空白組比較，＊＊P＜0.01；與TNF-α模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.blank group，＊＊P＜0.01；vs.TNF-α model group，#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白組TNF-α模型組MTX組CADF 50 mg/L組CADF 100 mg/L組CADF 200 mg/L組CADF 400 mg/L組增殖抑制率，%16.4 8.3 16.5 18.5 30.8 A值0.652±0.029 0.734±0.028＊＊0.613±0.013##0.673±0.022#0.613±0.012##0.598±0.013##0.508±0.017##

3.2 培養(yǎng)液中NO、PGE2、IL-1β、IL-6含量的測(cè)定結(jié)果

與空白組比較，TNF-α模型組細(xì)胞培養(yǎng)液中NO、PGE2、IL-1β、IL-6含量均顯著增加（P＜0.01）；與TNF-α模型組比較，各給藥組細(xì)胞培養(yǎng)液中NO、PGE2、IL-1β、IL-6含量均顯著減少（P＜0.01），并呈現(xiàn)較好的濃度依賴(lài)性，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中NO、PGE2、IL-1β、IL-6含量測(cè)定結(jié)果（±s，n＝3）Fig 1 Determination results of NO，PGE2，IL-1β and IL-6 contents in culture medium in each group（±s，n＝3）

4 討論

RA是一種常見(jiàn)的慢性全身性自身免疫性疾病[5]。RA的病理特點(diǎn)就是滑膜長(zhǎng)期的慢性炎癥，并逐漸增生成血管翳，造成骨與軟骨的破壞，晚期還可導(dǎo)致關(guān)節(jié)強(qiáng)直、畸形甚至殘疾[6-7]?；ぴ錾荝A病理過(guò)程中的一個(gè)重要特征，其侵蝕骨與軟骨后直接導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙，特點(diǎn)是產(chǎn)生腫瘤樣增殖。故有研究認(rèn)為，抗滑膜細(xì)胞增殖可能是一種有效治療RA的手段[8]。

原代RA滑膜細(xì)胞RAFLSs來(lái)源有限，受代數(shù)限制，用于科研有一定困難。MH7A細(xì)胞屬于RAFLSs的一種成熟細(xì)胞系，該細(xì)胞具有增殖速度快、可多次傳代、貼近病患體內(nèi)狀態(tài)等特點(diǎn)[9-10]。因此，本研究選擇MH7A細(xì)胞作為RA研究的細(xì)胞模型。在前期預(yù)試驗(yàn)中，本課題組考察了6.25、12.5、25、50、100、200、400、800、1 000 mg/L的CADF對(duì)MH7A細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果，當(dāng)CADF質(zhì)量濃度低于50 mg/L時(shí)，其對(duì)MH7A細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響；當(dāng)CADF質(zhì)量濃度高于400 mg/L時(shí)，其對(duì)MH7A細(xì)胞增殖有非常明顯的抑制作用；當(dāng)CADF質(zhì)量濃度在50～400 mg/L時(shí)，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制具有濃度依賴(lài)性。故在本研究中設(shè)置50、100、200、400 mg/L這4個(gè)藥物濃度進(jìn)行考察。

TNF-α是RA中重要的細(xì)胞因子之一，可使細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤樣增殖，并產(chǎn)生大量的炎癥因子[11]。IL-1β是促使RA免疫應(yīng)答放大，并轉(zhuǎn)為破壞反應(yīng)的主要細(xì)胞因子。IL-6是一種重要的炎癥細(xì)胞因子，與RA的發(fā)展有關(guān)。NO是炎癥反應(yīng)與免疫調(diào)節(jié)的效應(yīng)因子，在炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用；其還能促進(jìn)PGE2、IL-1β、TNF-α等炎癥因子的釋放，當(dāng)產(chǎn)生過(guò)量炎癥因子時(shí)則會(huì)導(dǎo)致一系列的炎性損傷。其中，PGE2作為第三信使，是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，炎癥的發(fā)生發(fā)展與局部PGE2的含量密切相關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示，50 μg/L的TNF-α可明顯誘導(dǎo)MH7A細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子NO、PGE2、IL-1β、IL-6。50～400 mg/L的CADF對(duì)細(xì)胞增殖和炎癥細(xì)胞因子的分泌均有明顯的抑制作用，且具有濃度依賴(lài)性。

綜上所述，CADF可呈濃度依賴(lài)性地抑制MH7A細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞因子NO、PGE2、IL-1β、IL-6的分泌，這可能是其抗RA的作用機(jī)制之一，但其更多的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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Effects of Caffeoylquinic Acid Derivative Fractions in Miao Medicine Periploca forrestii on Proliferation and Secretion of Inflammatory Cytokines in Human Rheumatoid Arthritis Fibroblast-like Synoviocytes MH7A

WANG Xia1，2，YANG Jian2，3，SONG Fei1，2，DONG Li2，LIU Ting3，ZHENG Lin3，MA Xue1，LI Yongjun1（1.Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM，Ministry of Education/National Engineering Research Center of Miao Medicines，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China；2.School of Pharmacy，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China；3.Guizhou Provincial Key Laboratory of Preparations，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China）

OBJECTIVE：To study the effects of caffeoylquinic acid derivative fractions（CADF）in Miao medicine Periploca forrestii on proliferation and secretion of inflammatory cytokines in tumor necrosis factor α（TNF-α）-induced human rheumatoid arthritis（RA）fibroblast-like synoviocytes MH7A，and explore its mechanism on anti-RA.METHODS：MH7A cells were divided into blank group，TNF-α model group，methotrexate group（positive control，20 mg/L）and CADF different mass concentrations groups（50，100，200，400 mg/L）.Except for blank group，other groups

50 μg/L of TNF-α to stimulate MH7A cells.After treated by suspension with TNF-α and related medicines for 24 h，the cell proliferation and contents of nitric oxide（NO），prostaglandin E2（PGE2），interleukin 1β（IL-1β），interleukin 6（IL-6）in culture medium were detected.RESULTS：Compared with blank group，cell proliferation activity in TNF-α model group was significantly enhanced（P＜0.01），contents of NO，PGE2，IL-1β，IL-6 in culture medium were significantly increased（P＜0.01）.Compared with TNF-α model group，cell proliferation in each administration group were significantly inhibited（P＜0.05 or P＜0.01），contents of NO，PGE2，IL-1β，IL-6 in culture medium were significantly decreased（P＜0.01），showing certain dose-effect relationship with CADF.CONCLUSIONS：CADF can play the role in anti-RA by inhibiting the TNF-α-induced proliferation of MH7A cells and reducing the secretion of inflammatory cytokines NO，PGE2，IL-1β，IL-6.

Miaomedicine； Periplocaforrestii； Caffeoylquinic acid derivative fractions；Human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes MH7A；Inflammatory cytokines

R285.5

A

1001-0408（2017）28-3949-04

2017-03-04

2017-07-14）

（編輯：林 靜）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81460641、81660691）；貴州省優(yōu)秀青年科技人才培養(yǎng)對(duì)象專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目（No.黔科合人字〔2015〕11號(hào)）；貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.黔科合平臺(tái)人才〔2016〕5677、黔科合平臺(tái)人才〔2016〕5613）；貴州省協(xié)同創(chuàng)新中心建設(shè)項(xiàng)目（No.黔教合協(xié)同創(chuàng)新字〔2013〕04）；貴州省研究生卓越人才計(jì)劃項(xiàng)目（No.ZYRC2014012）

＊碩士研究生。研究方向：中藥藥效物質(zhì)與質(zhì)量控制。電話(huà)：0851-86908468。E-mail：948015901@qq.com

#通信作者：教授，碩士生導(dǎo)師，碩士。研究方向：中藥藥效物質(zhì)與質(zhì)量控制。電話(huà)：0851-86908468。E-mail：liyongjun026@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.28.17