李暉，李文靜，馬榮，曹建華，韓志武（1.青島大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)系，山東青島6601；.青島市第三人民醫(yī)院藥學(xué)部，山東青島 66040；3.青島大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，山東青島 66003）

大黃素甲醚8-O-β-吡喃葡萄糖苷對皮膚黑色素瘤A375細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制研究

李暉1，2＊，李文靜2，馬榮2，曹建華2，韓志武3#（1.青島大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)系，山東青島266021；2.青島市第三人民醫(yī)院藥學(xué)部，山東青島 266040；3.青島大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，山東青島 266003）

目的：研究天然產(chǎn)物大黃素甲醚8-O-β-吡喃葡萄糖苷（PG）對皮膚黑色素瘤A375細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制。方法：以0、10、20、50 μg/mL的PG作用于A375細(xì)胞24、48、72 h后，采用CCK-8法測定細(xì)胞的存活率；以0（對照）、20、50 μg/mL的PG作用于A375細(xì)胞48 h后，通過流式細(xì)胞儀以膜聯(lián)蛋白Ⅴ/碘化丙啶（PI）雙染法檢測細(xì)胞凋亡率；免疫印跡法檢測半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）和多腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）的蛋白表達(dá)以及細(xì)胞色素C在線粒體內(nèi)外的蛋白表達(dá)；以0（對照）、5、10 μmol/L的PG作用于A375細(xì)胞48 h后，采用酶底物法測定細(xì)胞中Caspase-8、Caspase-9的活性。結(jié)果：PG能有效降低A375細(xì)胞的存活率；與對照比較，20、50 μg/mL的PG作用后細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.01），細(xì)胞中Caspase-3、PARP及細(xì)胞基質(zhì)中細(xì)胞色素C的蛋白表達(dá)均明顯增強(qiáng)（P＜0.05或P＜0.01），線粒體中細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)明顯減弱（P＜0.05或P＜0.01）；5、10 μmol/L的PG作用后細(xì)胞中Caspase-9活性明顯增強(qiáng)（P＜0.05或P＜0.01），Caspase-8活性無明顯變化。結(jié)論：PG能抑制A375細(xì)胞活性、促進(jìn)細(xì)胞凋亡；其是通過破壞線粒體膜電位、促進(jìn)細(xì)胞色素C外流來發(fā)揮促凋亡作用的。

大黃素甲醚8-O-β-吡喃葡萄糖苷；皮膚黑色素瘤A375細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；線粒體途徑

黑色素瘤一般指惡性黑色素瘤，來源于黑素細(xì)胞，多由黑素細(xì)胞所形成的痣或黑素斑發(fā)生惡變而來。近30年來，黑色素瘤的患病率和致死率正以每年4.1%的速度呈現(xiàn)顯著上升趨勢，已成為近年來所有惡性腫瘤中發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤[1-3]。黑色素瘤極易轉(zhuǎn)移致死，屬于最難有效治療的腫瘤之一。鑒于已轉(zhuǎn)移的晚期黑色素瘤致死率極高，且其治療方案相對有限，因此尋找安全有效的新型治療手段抑制黑色素瘤是治療關(guān)鍵。中藥抗腫瘤有著悠久的歷史和豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，具有藥理活性顯著、毒副作用小、不良反應(yīng)輕微等特點(diǎn)。現(xiàn)代藥化藥理分析發(fā)現(xiàn)，羊蹄根中主要含有大黃素、大黃素甲醚、大黃酚等蒽醌類成分[4-5]，具有抗菌、抗炎、抗腫瘤及止血等生物活性，據(jù)此推測，羊蹄根中的抗腫瘤有效成分對黑色素瘤也可能具有抑制作用。而羊蹄根中主要抗腫瘤成分大黃素甲醚8-O-β-吡喃葡萄糖苷（PG），是近年來研究的熱點(diǎn)，受到廣泛的關(guān)注[6-9]。本研究擬以羊蹄根中有效抗腫瘤成分PG作用于黑色素瘤細(xì)胞，觀察PG對黑色素瘤細(xì)胞凋亡的影響，以期為黑色素瘤的臨床治療提供更多的新思路和新方法。

1 材料

1.1 儀器

Allegra X-22型高速低溫離心機(jī)（美國Beckman Coulter公司）；UV-4802型紫外分光光度計(jì)（上海旦鼎國際貿(mào)易有限公司）；Mini-PRTEANⅡ型垂直電泳儀（美國Bio-Rad公司）；Tecan Safire 2型多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；DYY-Ⅲ8型電泳儀（北京六一儀器廠）；FACS Vantage型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；Leica DMI 4000 B型熒光倒置顯微鏡（德國Leica公司）；凝膠成像系統(tǒng)（法國Vilber Lourmat公司）。

1.2 藥品與試劑

PG（批號：140701，純度：≥98%）和二甲基亞砜（DMSO）均購自美國Sigma公司；小鼠抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、多腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）、細(xì)胞色素C單克隆抗體和10～170 kD彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（Marker）、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（中國碧云天生物科技有限公司）；大鼠抗β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）（美國Cell Signaling Technology公司）；Ac-IETD-AFC（Caspase-8熒光底物）、Ac-LEHDAFC（Caspase-9熒光底物）（天津百螢生物科技有限公司）；RIPI細(xì)胞裂解液（北京索萊寶科技有限公司）；細(xì)胞膜聯(lián)蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ）-碘化丙啶（PI）凋亡檢測試劑盒（中國BioTeke試劑有限公司）；胎牛血清（天津?yàn)笊镏破房萍脊荆?；DMEM培養(yǎng)基（美國Invitrogen公司）。

1.3 細(xì)胞

人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞株購自美國ATCC公司，用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 方法

2.1 PG對A375細(xì)胞活性的影響

將A375細(xì)胞以5×105mL－1接種于96孔板中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，以0（對照）、10、20、50 μg/mL的PG（以DMSO配制，下同）孵育細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×106mL－1，孵育24、48、72 h。然后向每孔加入10 μL CCK-8溶液，再將96孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育3 h，用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的光密度（OD），計(jì)算細(xì)胞存活率，試驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞存活率（%）＝（加藥孔OD值－空白孔OD值）/（對照孔OD值－空白孔OD值）×100%。

2.2 PG對A375細(xì)胞凋亡的影響

將細(xì)胞以5×105mL－1接種于6孔板中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用0（對照）、20、50 μg/mL的PG孵育細(xì)胞48 h，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×106mL－1，加入5 μL AnnexinⅤ-異硫氰酸熒光素（FITC）的結(jié)合緩沖液，37℃溫育30 min。然后在4℃下PI染色15 min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，試驗(yàn)重復(fù)3次。在FACS管上樣檢測熒光強(qiáng)度，設(shè)激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長635 nm、變異系數(shù)（CV值）＜2%、前向角散射光（FSC）/側(cè)向角散射光（SSC）設(shè)門。收集門內(nèi)10 000個細(xì)胞，用Modfit LT 3.2軟件分析凋亡率，以AnnexinⅤ－/PI－為活細(xì)胞、AnnexinⅤ+/PI－為凋亡早期細(xì)胞、AnnexinⅤ+/PI+為凋亡晚期細(xì)胞（死亡細(xì)胞）。

2.3 PG對A375細(xì)胞中Caspase-3、PARP及細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)的影響

按“2.2”項(xiàng)下方法培養(yǎng)和孵育A375細(xì)胞48 h后收集細(xì)胞，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，收集裂解上清，采用BCA法測定蛋白濃度后，加入5×上樣緩沖液（Loading buffer）煮沸后按Western blot法檢測細(xì)胞中Caspase-3、PARP、細(xì)胞色素C（線粒體中和細(xì)胞基質(zhì)中）及內(nèi)參（β-actin）蛋白表達(dá)水平，試驗(yàn)重復(fù)3次。蛋白表達(dá)以目的蛋白/內(nèi)參蛋白進(jìn)行評價(jià)。將提取的蛋白樣品混勻后上樣于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，同時以Marker作為分子量標(biāo)記，75 V恒壓30～45 min，待樣品進(jìn)入分離膠后調(diào)電壓至120 V。待目的蛋白分離后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，250 mA恒流，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印1 h，以使目的蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。轉(zhuǎn)印結(jié)束后，PVDF膜用5%脫脂牛奶室溫?fù)u床封閉1 h，之后用5%脫脂牛奶配制的一抗（β-actin按1∶3 000配制，Caspase-3、PARP、細(xì)胞色素C按1∶1 000配制）室溫?fù)u床孵育4 h。1×TBST緩沖液洗膜，后加入1×TBST緩沖液配制的二抗（HRP標(biāo)記兔抗小鼠IgG按1∶3 000配制）孵育1 h，1×TBST緩沖液洗膜。在暗室內(nèi)進(jìn)行顯影，采用凝膠分析軟件Image J進(jìn)行灰度分析。

2.4 PG對A375細(xì)胞中Caspase-8和Caspase-9活性的影響

按“2.2”項(xiàng)下方法培養(yǎng)A375細(xì)胞至對數(shù)生長期，用0（對照）、5、10 μmol/L的PG孵育A375細(xì)胞48 h，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×106mL－1。將每個濃度的蛋白均分為二份，分別加入Ac-IETD-AFC、Ac-LEHD-AFC，混勻后在37℃孵育2 h。通過酶標(biāo)儀于發(fā)射波長505 nm、激發(fā)波長400 nm處檢測熒光強(qiáng)度，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graph-pad Prism 5.01軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 PG能夠抑制A375細(xì)胞活性

在PG孵育24 h后，僅50 μg/mL的PG能夠明顯降低A375細(xì)胞的細(xì)胞存活率（P＜0.05）；孵育48、72 h后，20、50 μg/mL的PG均能夠明顯降低A375細(xì)胞的細(xì)胞存活率（P＜0.05），綜合考察可優(yōu)先選擇短時間48 h進(jìn)行后續(xù)研究。此結(jié)果提示，PG能夠抑制A375細(xì)胞活性，具有抗A375細(xì)胞潛質(zhì)。PG對A375細(xì)胞存活率的影響見圖1。

3.2 PG能夠促進(jìn)A375細(xì)胞凋亡

與對照比較，20、50 μg/mL的PG孵育后A375細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.01），且隨著PG劑量增加細(xì)胞凋亡率增加越明顯。PG作用后A375細(xì)胞的流式圖見圖2，測定結(jié)果見圖3。

圖1 PG對A375細(xì)胞存活率的影響Fig 1 Effect of PG on survival rate ofA375 cells

圖3 PG對A375細(xì)胞凋亡率的影響Fig 3 Effect of PG on apoptosis rate ofA375 cells

3.3 PG能夠促進(jìn)A375細(xì)胞中Caspase-3、PARP蛋白表達(dá)

與對照比較，20、50 μg/mL的PG孵育后A375細(xì)胞中Caspase-3、PARP蛋白表達(dá)均明顯增強(qiáng)（P＜0.01），且隨著PG濃度增加增強(qiáng)越明顯。PG作用后A375細(xì)胞中Caspase-3、PARP表達(dá)的電泳圖見圖4，測定結(jié)果見圖5。

3.4 PG通過線粒體途徑啟動凋亡

與對照比較，5、10 μmol/L的PG作用后A375細(xì)胞中Caspase-8活性無明顯變化，而Caspase-9活性隨著PG濃度的增加不斷增強(qiáng)（P＜0.05或P＜0.01）。PG對A375細(xì)胞中Caspase-8、Caspase-9活性的影響見圖6。

圖4 PG作用后A375細(xì)胞中Caspase-3、PARP蛋白表達(dá)的電泳圖Fig 4 Electrophoresis chart of the protein expressions of Caspase-3，PARP in A375 cells after treated by PG

圖5 PG對A375細(xì)胞中Caspase-3、PARP蛋白表達(dá)的影響Fig 5 Effects of PG on the protein expressions of Caspase-3，PARPinA375 cells

圖6 PG對A375細(xì)胞中Caspase-8、Caspase-9活性的影響Fig 6 Effects of PG on the activities of Caspase-8，Caspase-9 inA375 cells

3.5 PG通過降低線粒體中細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞基質(zhì)中細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)

與對照比較，20、50 μg/mL的PG作用后，A375細(xì)胞線粒體中細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），且隨著PG濃度的增加降低越明顯；A375細(xì)胞基質(zhì)中細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.05或P＜0.01），且隨著PG濃度的增加增強(qiáng)越明顯。PG作用后A375細(xì)胞中細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)的電泳圖見圖7，測定結(jié)果見圖8。

4 討論

圖7 PG作用后A375細(xì)胞中細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)的電泳圖Fig 7 Electrophoresis chart of the protein expression of cytochrome C in A375 cells after treated by PG

圖8 PG對A375細(xì)胞中細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)的影響Fig 8 Effect of PG on the protein expression of cytochrome C inA375 cells

PG是傳統(tǒng)中藥羊蹄根中的主要活性成分，也存在于大黃、何首烏、虎杖等中藥中，是自然界中天然存在的蒽醌類化合物。自20世紀(jì)初，PG被提取、純化并確認(rèn)結(jié)構(gòu)之后，諸多學(xué)者致力于其藥理學(xué)功效的深入研究，近年來越來越多的研究結(jié)果見于報(bào)道，尤其PG抗腫瘤作用的研究成為關(guān)注的焦點(diǎn)[10-11]。研究報(bào)道提示，PG具有廣譜抗腫瘤作用，對肺癌、口腔上皮癌、骨肉瘤、乳腺癌等多種腫瘤均具有凋亡誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)移侵襲抑制等作用，其抗腫瘤作用一部分是通過線粒體途徑促凋亡實(shí)現(xiàn)的[12-13]。

針對黑色素瘤，截至目前，尚無PG抗黑色素瘤的相關(guān)報(bào)道。筆者推測PG可以應(yīng)用到黑色素瘤的預(yù)防與治療中，因此本研究以PG處理黑色素瘤A375細(xì)胞，檢測PG對A375細(xì)胞增殖、凋亡的作用。結(jié)果顯示，PG能夠抑制A375細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞中Caspase-3和PARP的蛋白表達(dá)。

筆者對PG促凋亡作用機(jī)制進(jìn)行了研究。通常細(xì)胞凋亡會通過線粒體途徑、死亡受體途徑兩種主要方式，線粒體途徑凋亡以線粒體膜電位受損、Caspase-9激活為特征，而死亡受體途徑以死亡信號復(fù)合物（DISC）形成、Caspase-8激活為特征，二者均最終激活Caspase-3，啟動凋亡不可逆轉(zhuǎn)模式。本研究結(jié)果提示，PG的促凋亡作用可能是通過線粒體途徑實(shí)現(xiàn)的，與死亡受體途徑無關(guān)。

細(xì)胞色素C為生物氧化過程中的電子傳遞體，在線粒體上與其他氧化酶排列成呼吸鏈，參與細(xì)胞呼吸過程。通常情況下，細(xì)胞色素C主要存在于線粒體中，不能進(jìn)入細(xì)胞基質(zhì)；而在線粒體膜電位損傷后，由于膜通透性增加，細(xì)胞色素C進(jìn)入細(xì)胞基質(zhì)。因此，筆者以Western blot法對細(xì)胞基質(zhì)和線粒體中細(xì)胞色素C的蛋白表達(dá)進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，細(xì)胞基質(zhì)中細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)增加，表明PG破壞了A375細(xì)胞中的線粒體膜電位，使線粒體膜通透性增加，細(xì)胞色素C進(jìn)入細(xì)胞基質(zhì)，加劇了細(xì)胞凋亡。

綜上所述，PG能抑制A375細(xì)胞活性、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其是通過破壞線粒體膜電位、促進(jìn)細(xì)胞色素C外流來發(fā)揮促凋亡作用的。

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（編輯：鄒麗娟）

Study on the Effect and Mechanism of Physcion 8-O-β-glucopyranoside on the Apoptosis of Skin Melanoma A375 Cells

LI Hui1，2，LI Wenjing2，MA Rong2，CAO Jianhua2，HAN Zhiwu3（1.Dept.of Pharmacology，School of Pharmacy，Qingdao University，Shandong Qingdao 266021，China；2.Dept.Pharmacy，Qingdao Third People’s Hospital，Shandong Qingdao 266040，China；3.Dept.of Pharmacy，the Affiliated Hospital of Qingdao University，Shandong Qingdao 266003，China）

OBJECTIVE：To study the effect and mechanism of physcion 8-O-β-glucopyranoside（PG）on the apoptosis of skin melanoma A375 cells.METHODS：After A375 cells were treated by PG with 0，10，20，50 μg/mL for 24，48，72 h，CCK-8 method was adopted to determine the survival rate of cells.After A375 cells were treated by PG with 0（control），20，50 μg/mL for 48 h，flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of cells with membrane protein Ⅴ/propidium iodide（PI）double staining.Immunoblotting was used to detect the protein expressions of Caspase-3 and polyadenyl adenine diphosphate ribose polymerase（PARP）and protein expressions of cytochrome C inside and outside mitochondria.After A375 cells were treated by PG with 0（control），5，10 μmol/L for 48 h，enzyme substrate method was used to determine the activities of Caspase-8 and Caspase-9.RESULTS：PG can effectively decrease the survival rate of A375 cells.Compared with control，apoptosis rate of cells was obviously increased after treated by PG with 20，50 μg/mL（P＜0.01）；protein expressions of Caspase-3，PARP in cells and cytochrome C in cell matrix were obviously enhanced（P＜0.05 or P＜0.01）；and protein expression of cytochrome C in mitochondria was obviously weakened（P＜0.05 or P＜0.01）.Caspase-9 activity in cells was obviously enhanced after treated by PG with 5，10 μmol/L（P＜0.05 or P＜0.01）；and Caspase-8 activity had no obvious changes.CONCLUSIONS：PG can inhibit activity of A375 cells and promote its apoptosis，and its pro-apoptotic effects is achieved by destructing mitochondrial membrane potential and promoting cytochrome C outflow.

Physcion 8-O-β-glucopyranoside；Skin melanoma A375 cells；Cell apoptosis；Mitochondrial pathway

R965

A

1001-0408（2017）28-3941-05

2017-04-17

2017-08-16）

＊主管藥師，碩士。研究方向：臨床藥學(xué)。電話：0532-89076099。E-mail：lihui821127@163.com

#通信作者：主任藥師，碩士。研究方向：臨床藥學(xué)、藥事管理。電話：0532-82911848。E-mail：zhiwu1218@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.28.15