李映新，黃曉亮，黃媛恒，班建東，龐麗君，黎欽蓉，雷丹青#（.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧500；.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南寧 500；.廣西蛇毒研究所，南寧 500；.廣西醫(yī)科大學(xué)全科醫(yī)學(xué)院，南寧500）

光裸方格星蟲纖溶酶SNFE的抗凝作用及機(jī)制研究Δ

李映新1＊，黃曉亮1，黃媛恒2，班建東3，龐麗君1，黎欽蓉4，雷丹青3#（1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南寧 530021；3.廣西蛇毒研究所，南寧 530021；4.廣西醫(yī)科大學(xué)全科醫(yī)學(xué)院，南寧530021）

目的：研究光裸方格星蟲纖溶酶SNFE的抗凝作用及機(jī)制，為SNFE的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。方法：將40只小鼠隨機(jī)分為空白對照組（生理鹽水）、血栓通組（陽性對照，15 mg/kg）和SNFE低、高劑量組（15、30 mg/kg），每組10只，尾iv給藥后分別測定斷尾出血時間（BT）和凝血時間（CT），以考察SNFE的抗凝作用。大鼠腹主動脈取血后，將試驗(yàn)分為空白對照組、陽性對照組和SNFE低、中、高質(zhì)量濃度組（0.25、0.50、1.00 mg/mL），分別測定體外血漿的凝血酶原時間（PT）和復(fù)鈣時間（PRT）（以尿激酶為陽性藥物，10萬U/mL）及二磷酸腺苷（ADP）誘導(dǎo)劑作用下的血小板5 min內(nèi)的最大聚集率（PAG）（以阿司匹林為陽性藥物，0.50 mg/mL），以分析SNFE的抗凝作用機(jī)制。結(jié)果：與空白對照組比較，各給藥組小鼠的BT、CT均延長，其中血栓通組和SNFE高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；陽性對照組和SNFE中、高濃度組大鼠血漿PT及各給藥組大鼠血漿PRT均顯著延長（P＜0.05或P＜0.01）；各給藥組大鼠PAG均顯著降低（P＜0.01）。結(jié)論：光裸方格星蟲纖溶酶SNFE可能通過抑制內(nèi)、外源性凝血因子的活性及ADP誘導(dǎo)的血小板聚集而發(fā)揮抗凝作用。

光裸方格星蟲；纖溶酶；抗凝作用；血小板聚集

光裸方格星蟲（Sipunculus Nudus）俗稱“沙蟲”“沙腸子”，隸屬星蟲動物門、星蟲綱、方格星蟲屬，為暖水性世界廣布種，營穴居生活，多棲息于河口、港灣及地表徑流較豐富的沙質(zhì)或沙泥質(zhì)灘涂。方格星蟲蟲體肉質(zhì)鮮美，富含蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖等多種活性物質(zhì)，具有增強(qiáng)免疫力、抗疲勞、延緩衰老、滋陰降火及清肺化痰等功效，被稱為“海洋冬蟲夏草”[1-4]。當(dāng)前，從海洋天然產(chǎn)物中開發(fā)藥物是研究熱點(diǎn)。本課題組前期從光裸方格星蟲內(nèi)臟勻漿液中提取到分子量約為32 000 D的纖維蛋白溶解酶——SNFE[5]，該提取方法已獲一項(xiàng)國家發(fā)明專利（No.201010210919.5）。前期研究發(fā)現(xiàn)，SNFE在體外不僅具有激酶的活性，還能直接溶解纖維蛋白原和纖維蛋白；對血凝塊具有良好的溶栓作用，且無出血活性和溶血作用[6]，這提示其具有開發(fā)為溶栓、抗栓藥物的可能性。本研究通過考察SNFE對小鼠斷尾后出血時間（BT）、凝血時間（CT）和血漿凝血酶原時間（PT）、復(fù)鈣時間（PRT）等指標(biāo)的影響研究其抗凝作用，并通過考察SNFE對血小板聚集率的影響對其抗凝機(jī)制進(jìn)行初步探討，為SNFE的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

ME204E電子分析天平（德國梅特勒-托利多有限公司）；全血血小板聚集儀（美國Chrono-Log公司）；DEAE Sepharose CL-6B、Sephadex G-75柱（美國Pharmacia生物技術(shù)公司）。

1.2 藥品與試劑

新鮮光裸方格星蟲內(nèi)臟，收集于廣西欽州沿海；注射用尿激酶（UK，廣東麗珠集團(tuán)生物化學(xué)制藥有限公司，批號：140609，規(guī)格：10 000 U/瓶）；注射用血栓通（廣西梧州制藥集團(tuán)股份有限公司，批號：14091001，規(guī)格：150 mg/瓶）；阿司匹林腸溶片（亞寶藥業(yè)太原制藥有限公司，批號：15121，規(guī)格：25 mg/片）；PT測定試劑盒（上海太陽生物技術(shù)有限公司，批號：105259）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 動物

SPF級KM小鼠，體質(zhì)量20～30 g，♀♂各半；SPF級SD大鼠，體質(zhì)量250～350 g，♀♂不限。所有動物均購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（桂）2014-0002。

2 方法

2.1 SNFE的分離純化

采用纖維蛋白平板法測定纖溶活性，以有溶圈出現(xiàn)的組分為活性組分。取新鮮方格星蟲內(nèi)臟，以3倍體積磷酸鹽緩沖液（PBS，0.02 mol/L，pH 7.5，下同）在4℃條件下勻漿抽提，得粗酶液。粗酶液加入固體硫酸銨使飽和度達(dá)到50%，以沉淀活性蛋白。將收集的活性蛋白2 g溶于15 mL PBS中，以1 000×g離心10 min，取上清液上樣于用PBS平衡的DEAE Sepharose CL-6B柱（50 cm×2.6 cm）上，用0～0.8 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.5 mL/min，分別測定各洗脫組分的纖溶活性。將收集的活性組分經(jīng)透析濃縮后，上樣于用PBS平衡的Sephadex G-75柱（100 cm×2.6 cm）上，用同一緩沖液洗脫，流速為0.5 mL/min，收集活性組分即為SNFE，經(jīng)透析、凍干后，干粉存于－20℃冰箱中保存，備用。使用時，用生理鹽水溶解至所需要的質(zhì)量濃度[5]。

2.2 SNFE對小鼠BT的影響

將40只KM小鼠隨機(jī)分為空白對照組、血栓通組（陽性對照）和SNFE低、高劑量組，每組10只。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，SNFE低、高劑量組小鼠分別尾iv給予15、30 mg/kg的SNFE溶液，空白對照組小鼠尾iv等體積生理鹽水，血栓通組小鼠尾iv注射用血栓通15 mg/kg（生理鹽水溶解），給藥體積均為0.2 mL。給藥0.5 h后，于距尾尖端0.3 cm處用剪刀截斷鼠尾，使血液自行溢出。自截斷鼠尾時即刻開始記時，每隔30 s用紙巾輕輕吸取血滴，直到紙巾無血的時間，即為BT。

2.3 SNFE對小鼠CT的影響

取小鼠同“2.2”項(xiàng)下分組、給藥。給藥1 h后，用內(nèi)徑為1 mm、長為10 cm的毛細(xì)管插入小鼠眼眶后靜脈叢，至毛細(xì)管內(nèi)血柱超過10 cm時取出，平放于桌面，每隔30 s折斷毛細(xì)管一小段，觀察有無血凝絲出現(xiàn)，記錄從取血到出現(xiàn)血凝絲的時間，即為CT。

2.4 SNFE對大鼠血漿PT的影響

SD大鼠以10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）ip麻醉后，采用枸櫞酸鈉抗凝的采血管（1∶9）進(jìn)行腹主動脈取血，將血液以1 000×g離心15 min，取上層血漿，備用。按照PT測定試劑盒說明，將50 μL低、中、高質(zhì)量濃度（0.25、0.50、1.00 mg/mL）的SNFE溶液置于EP管中，加入50 μL血漿混勻并于37℃水浴孵育，記為SNFE低、中、高質(zhì)量濃度組；以等體積的生理鹽水代替藥物加入，記為空白對照組；以等體積的尿激酶溶液（10萬U/mL）代替藥物加入，記為陽性對照組。每組設(shè)定5管平行對照，孵育3 min后，立即加入37℃預(yù)溫的PT試劑0.2 mL，自加入時即刻開始計(jì)時?；靹蚝?，每隔2 s以鋼絲挑動，直到生成固體細(xì)絲的時間，即為PT。

2.5 SNFE對大鼠血漿PRT的影響

取血方法同“2.3”項(xiàng)下。將血液以200×g離心10 min，取上層血漿[即為富血小板血漿（PRP）]。然后按“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組、給藥和孵育。孵育1 min后，各組分別加入0.025 mol/L的CaCl2溶液50 μL，自加入起即刻開始計(jì)時，混勻后每隔10 s以鋼絲挑動，直到生成固體細(xì)絲的時間，即為血漿PRT。

2.6 SNFE對大鼠血小板聚集的影響

2.6.1 血小板懸液的制備 大鼠ip 10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉后，采用枸櫞酸鈉抗凝的采血管進(jìn)行腹主動脈取血。將血液以200×g離心10 min，取上層血漿即為PRP。余下的血漿再以1 000×g離心10 min，再取上層液，即為貧血小板血漿（PPP）。2.6.2 血小板聚集率的測定 在測試杯中加入攪拌珠、10 μL質(zhì)量濃度分別為0.25、0.50、1.00 mg/L 的SNFE溶液及280 μL的PRP，記為SNFE低、中、高質(zhì)量濃度組；以等體積的阿司匹林溶液（0.50 mg/mL）代替SNFE加入，記為陽性對照組；以等體積的生理鹽水代替SNFE加入，記為空白對照組。孵育3 min后，放入測試通道，加10 μL的二磷酸腺苷（ADP）至終濃度為5 μmol/L，用PPP（加入與相應(yīng)測量管等質(zhì)量濃度的藥液10 μL，以消除藥物自身顏色影響）調(diào)零，用血小板聚集儀測定空白對照管和給藥管血小板5 min內(nèi)的最大聚集率（PAG，%），每個濃度設(shè)5管平行對照。并按下述公式計(jì)算藥物對血小板聚集的抑制率（AIP），AIP（%）＝（空白對照組的PAG－給藥組的PAG）/空白對照組的PAG×100%。以AIP取自然對數(shù)值作為縱坐標(biāo)、不同給藥濃度的自然對數(shù)值為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，根據(jù)回歸方程計(jì)算半數(shù)有效劑量（ED50）。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 SNFE對小鼠BT、CT的影響結(jié)果

SNFE能延長小鼠的BT、CT，且隨著劑量的增加效果越明顯，其中血栓通組、SNFE高劑量組與空白對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），結(jié)果詳見表1。

表1 各組小鼠BT、CT的測定結(jié)果（±s，n＝10，s）Tab 1 Determination results of BT，CT in mice in each group（±s，n＝10，s）

表1 各組小鼠BT、CT的測定結(jié)果（±s，n＝10，s）Tab 1 Determination results of BT，CT in mice in each group（±s，n＝10，s）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.blank control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別空白對照組血栓通組SNFE低劑量組SNFE高劑量組CT 55.71±20.70 132.86±29.28＊＊68.57±14.64 90.00±18.97＊劑量，mg/kg 15 15 30 BT 232.50±28.72 402.00±80.44＊＊255.00±31.46 330.00±64.81＊

3.2 SNFE對大鼠血漿PT、PRT的影響結(jié)果

SNFE能延長大鼠血漿PT、PRT，且具有明顯的濃度依賴性。其中陽性對照組和SNFE中、高質(zhì)量濃度組大鼠血漿PT與空白對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），各給藥組大鼠血漿PRT與空白對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果詳見表2。

表2 各組大鼠血漿PT、PRT的測定結(jié)果（±s，n＝5，s）Tab 2 Determination results of plasma PT，PRT in rats in each group（±s，n＝5，s）

表2 各組大鼠血漿PT、PRT的測定結(jié)果（±s，n＝5，s）Tab 2 Determination results of plasma PT，PRT in rats in each group（±s，n＝5，s）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.blank control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別空白對照組陽性對照組SNFE低質(zhì)量濃度組SNFE中質(zhì)量濃度組SNFE高質(zhì)量濃度組PRT 77.40±8.05 242.68±22.01＊＊144.00±15.10＊＊445.00±36.97＊＊＞600＊＊劑量10 000 U/mL 0.25 mg/mL 0.50 mg/mL 1.00 mg/mL PT 14.78±1.72 21.78±0.99＊14.61±0.84 17.63±1.60＊35.02±3.08＊＊

3.3 SNFE對ADP誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集的影響結(jié)果

SNFE對ADP誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集有抑制作用，且具有明顯的濃度依賴性。各給藥組大鼠血小板5 min內(nèi)的PAG與空白對照組比較均明顯減?。≒＜0.01），ED50為0.62 mg/mL，結(jié)果詳見表3。

表3 各組大鼠血小板PAG、AIP的測定結(jié)果（±s，n＝3，%%）Tab 3 Determination results of PAG，AIP of platelet of rats in each group（±s，n＝3，%%）

表3 各組大鼠血小板PAG、AIP的測定結(jié)果（±s，n＝3，%%）Tab 3 Determination results of PAG，AIP of platelet of rats in each group（±s，n＝3，%%）

注：與空白對照組比較，＊＊P＜0.01Note：vs.blank control group，＊＊P＜0.01

組別空白對照組陽性對照組SNFE低質(zhì)量濃度組SNFE中質(zhì)量濃度組SNFE高質(zhì)量濃度組劑量，mg/mL AIP 81.10±4.2 31.90±10.1 46.38±7.4 62.50±4.4 0.50 0.25 0.50 1.00 PAG 58.0±2.9 11.0±2.4＊＊39.3±4.9＊＊30.5±4.5＊＊21.7±2.1＊＊

4 討論

BT是指血液從開始流出到自然止血所需的時間，其長短主要與毛細(xì)血管功能、血小板的數(shù)量和功能、組織因子、組織收縮力以及纖溶酶等因素有關(guān)[7]。CT是指從血液離體至自然凝固所需的時間，其長短主要與凝血因子的激活和血液黏稠度等因素有關(guān)[8]。一般認(rèn)為，藥物的抗凝作用可以通過測定BT和CT來反映[9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，SNFE具有良好的溶栓活性[6]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，SNFE可延長小鼠BT和CT，這提示其具有較好的抗凝作用。

PT和PRT被認(rèn)為分別是反映外源性凝血和內(nèi)源性凝血是否正常的敏感性指標(biāo)。PT與外源性凝血因子活性有關(guān)，PRT與內(nèi)源性凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅹ等的功能有關(guān)，兩者可反映藥物影響凝血過程的作用途徑[10-11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SNFE能延長大鼠血漿PT和PRT，這提示SNFE可以通過影響外源性凝血因子和內(nèi)源性凝血因子的活性，從而影響外源性凝血和內(nèi)源性凝血過程。

血小板的黏附聚集并形成血栓，以及釋放ADP、5-羥色胺、前列腺素等與凝血有關(guān)的各種因子，是促進(jìn)血液凝固的重要因素。ADP是機(jī)體釋放的促進(jìn)血小板聚集的最重要的物質(zhì)，能夠與血小板表面受體結(jié)合，激活血小板纖維蛋白原受體，從而引起血小板聚集，作為誘導(dǎo)血小板聚集的常用激活劑；同時，ADP也是其他誘導(dǎo)劑如凝血酶膠原、腎上腺素等激發(fā)血小板活性的一個必要的共同因子[12-13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SNFE在體外能夠抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，這可能是SNFE發(fā)揮抗凝作用的另一機(jī)制。

綜上所述，SNFE具有較好的抗凝作用，其作用機(jī)制可能與降低內(nèi)、外源性凝血因子的活性以及抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集有關(guān)。

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Study on the Anti-coagulation Effect and Mechanism of Fibrinolytic Enzyme SNFE in Sipuculus Nudus

LI Yingxin1，HUANG Xiaoliang1，HUANG Yuanheng2，BAN Jiandong3，PANG Lijun1，LI Qinrong4，LEI Danqing3
（1.School of Pharmacy，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China；2.Basic Medical College，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China；3.Institute of Snake Venom Research，Nanning 530021，China；4.General Medical School，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China）

OBJECTIVE：To study the anti-coagulation effect and mechanism of fibrinolytic enzyme SNFE in sipuculus nudus，and provide reference for further development of SNFE.METHODS：40 mice were randomly divided into blank control group（normal saline），Xueshuantong group（positive control，15 mg/kg）and SNFE low-dose，high-dose group（15，30 mg/kg），10 in each group.After intravenous injection in tail，tail bleeding time（BT）and clotting time（CT）were respectively determined to investigate the anti-coagulation effect of SNFE.After taking blood in abdominal aorta of rats，test was divided into blank control group，positive control group and SNFE low-mass concentration，medium-mass concentration，high-mass concentration groups（0.25，0.50，1.00 mg/mL）.Prothrombin time（PT），re-calcium time（PRT）（using orokinase as positive drug，100 000 U/mL），and maxmum platelet aggregation rate（PAG）in 5 min under adenosine diphosphate（ADP）inducer（using asprin as positive drug，0.50 mg/mL）were respectively determined，and anti-coagulation effect mechanism of SNFE was analyzed.RESULTS：Compared with blank control group，BT，CT of mice in each group were prolonged，with statistical significance in Xueshuantong group and SNFE high-dose group（P＜0.05 or P＜0.01）.Plasma PT of rats in positive control group，SNFE medium-dose，high-dose groups and PRT in each administration group were significantly prolonged（P＜0.05 or P＜0.01）；and PAG in administration group was significantly reduced（P＜0.01）.CONCLUSIONS：The fibrinolytic enzyme SNFE in sipuculus nudus can play its anti-coagulant effect by inhibiting the activity of coagulation factors in internal and external sources and ADP-induced platelet aggregation.

Sipuculus nudus；Fibrinolytic enzyme；Anti-coagulation effect；Platelet aggregation

R285

A

1001-0408（2017）28-3938-04

2017-04-26

2017-07-12）
（編輯：林 靜）

廣西醫(yī)科大學(xué)青年科學(xué)基金項(xiàng)目（No.GXMUYSF-2014025）；廣西高校-廣西再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（No.桂再重開15-05）

＊高級實(shí)驗(yàn)師，博士。研究方向：生化藥理。電話：0771-5358272。E-mail：marchimoro@yeah.net

#通信作者：研究員，碩士生導(dǎo)師。研究方向：生化藥理。電話：0771-5358272。E-mail：506448694@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.28.14