羅紅，王春花，趙玲璐，楊宇，陳世平，徐旖旎，楊紅宇，沈祥春#（.貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省高等學(xué)校天然藥物藥理與成藥性評(píng)價(jià)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 55005；.貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，貴陽 55005）

·實(shí)驗(yàn)研究·

丹酚酸B抗心肌纖維化的機(jī)制研究Δ

羅紅1，2＊，王春花1，趙玲璐1，楊宇1，陳世平1，徐旖旎1，楊紅宇2，沈祥春1#（1.貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省高等學(xué)校天然藥物藥理與成藥性評(píng)價(jià)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，貴陽 550025）

目的：研究丹酚酸B（Sal B）對(duì)血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖、Ⅲ型膠原分泌及基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、Smad2/3、Smad7蛋白表達(dá)的影響，探討其抗心肌纖維化的作用機(jī)制。方法：將細(xì)胞分為空白對(duì)照組（培養(yǎng)液）、AngⅡ模型組和Sal B低、中、高濃度組（12.5、25、50 μmol/L），用空白或含藥培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞1 h后，除空白對(duì)照組外的其余各組均加入1 μmol/L的AngⅡ誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，共同作用24 h。分別采用MTT法和蘇木精-伊紅染色法考察Sal B對(duì)細(xì)胞增殖的影響；采用Western blot法檢測Sal B對(duì)細(xì)胞Ⅲ型膠原、MMP-9、Smad2/3、Smad7蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，AngⅡ模型組細(xì)胞明顯增殖，Ⅲ型膠原、MMP-9、Smad2/3蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，Smad7蛋白表達(dá)明顯減弱，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與AngⅡ模型組比較，Sal B各濃度組細(xì)胞的增殖均受到抑制，Ⅲ型膠原、MMP-9、Smad2/3蛋白表達(dá)均減弱，Smad7蛋白表達(dá)均增強(qiáng)，除Sal B低、中濃度組細(xì)胞Ⅲ型膠原與Sal B高濃度組細(xì)胞Smad2/3蛋白表達(dá)變化不顯著外，其余各指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：Sal B抗心肌纖維化的作用可能與抑制心肌成纖維細(xì)胞的增殖，下調(diào)Ⅲ型膠原、MMP-9、Smad2/3蛋白表達(dá)和上調(diào)Smad7蛋白表達(dá)有關(guān)。

丹酚酸B；心肌成纖維細(xì)胞；Ⅲ型膠原；基質(zhì)金屬蛋白酶9；轉(zhuǎn)化生長因子β1信號(hào)通路

心肌纖維化所導(dǎo)致的心力衰竭、心律失常和心源性猝死等嚴(yán)重并發(fā)癥已逐漸成為心血管疾病死亡的主要原因。而心肌成纖維細(xì)胞是心肌纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞，當(dāng)心臟受到損傷時(shí)，心肌成纖維細(xì)胞的數(shù)目增多，表型分化為肌成纖維細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞又通過分泌更多的Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白和上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的表達(dá)等方式抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解，使心肌膠原纖維成分不成比例地增多、排列紊亂，心肌間質(zhì)膠原合成和降解比例失調(diào)，導(dǎo)致心室壁的僵硬度增加、心室壁的順應(yīng)性降低，從而嚴(yán)重影響心臟正常的生理功能[1]。丹酚酸B（Salvianolic acid B，Sal B）為丹參的主要水溶性成分，具有很強(qiáng)的抗氧化活性。本課題組前期研究表明，Sal B能顯著抑制轉(zhuǎn)化因子β1（Transforming growth factor β1，TGF-β1）誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞的增殖[2-3]，但目前對(duì)于其抗心肌纖維化的作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究主要從Sal B對(duì)血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖活性，細(xì)胞Ⅲ型膠原、MMP-9蛋白表達(dá)以及TGF-β1信號(hào)通路這3個(gè)方面的影響來探索其抗心肌纖維化的作用及機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

ELX800酶聯(lián)免疫檢測儀（美國GE公司）；TDL-4ZB臺(tái)式自動(dòng)平衡離心機(jī)（湖南星科科學(xué)儀器有限公司）；BS223S電子天平（北京賽多利斯儀器系列有限公司）；XDS-1B倒置顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）；CFX凝膠成像系統(tǒng)儀、電泳儀、電泳槽（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

Sal B原料藥（上海阿拉丁試劑有限公司，批號(hào)：46595，純度：＞98%）；AngⅡ（美國Sigma公司，批號(hào)：1401558214，純度：＞97%）；SP免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：PV-6002）；聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑盒、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：P0012AC-1、P0018A）；兔源Ⅲ型膠原、Smad2/3多克隆抗體（美國ImmunoWay公司，批號(hào)：B3201、B3201）；兔源波形蛋白、MMP-9、Smad7多克隆抗體（武漢博士德有限公司，批號(hào)：BM0135、2844710、12F81）；山羊抗兔二抗（上海拜力生物科技有限公司，批號(hào)：2000-0003）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體（英國Abcam公司，批號(hào)：ab9485）。

1.3 動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠10只，鼠齡1～3 d，♀♂不限，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK-（黔）2012-001。

2 方法

2.1 心肌成纖維細(xì)胞的分離純化

將大鼠用75%乙醇進(jìn)行皮膚消毒后，固定四肢，胸部向上，用75%乙醇分別消毒胸腹部皮膚，用虹膜剪剪開胸部皮膚及肋骨，暴露心臟；取下正在搏動(dòng)的心尖部份，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗凈殘留血污，將組織放入含有青霉素和鏈霉素的PBS的安瓿小瓶中，轉(zhuǎn)入超凈臺(tái)，用虹膜剪剪成大小約1 mm×1 mm×1 mm的碎塊，PBS洗3次；加入0.125%的胰酶，放入4℃冰箱進(jìn)行冷消化6 h，取出吸棄胰酶；再加入0.125%的胰酶后放入培養(yǎng)箱進(jìn)行熱消化5 min，重復(fù)4次，每次都收集消化的細(xì)胞懸液。終止消化后，以離心半徑為9.6 cm、1 000 r/min離心10 min，收集細(xì)胞沉淀。采用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，然后接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，90 min后進(jìn)行差速貼壁，以純化心肌成纖維細(xì)胞。

2.2 心肌成纖維細(xì)胞的鑒定

用3～5代的心肌成纖維細(xì)胞制備細(xì)胞爬片，然后以4%多聚甲醛固定，采用0.5%Triton X-100試劑破膜20 min；3%過氧化氫孵育，山羊血清封閉，依次用1∶200稀釋的兔源波形蛋白多克隆抗體、山羊抗兔二抗和辣根過氧化物酶孵育后，二氨基聯(lián)苯胺顯色至棕黃色；乙醇梯度脫水，二甲苯透明后，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察并拍照，若胞漿染成棕黃色則判定為陽性；并于顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞率。

2.3 Sal B對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖的影響

2.3.1 MTT法測定細(xì)胞增殖活性 將細(xì)胞接種于96孔板中，用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，棄原培養(yǎng)液，加入新鮮DMEM對(duì)細(xì)胞進(jìn)行同步12 h。將細(xì)胞分為AngⅡ模型組和Sal B低、中、高濃度組，并另設(shè)只加DMEM培養(yǎng)液不加藥物的空白對(duì)照組和只加培養(yǎng)液不加細(xì)胞的調(diào)零孔，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。Sal B低、中、高濃度組細(xì)胞分別加入12.5、25、50 μmol/L的Sal B預(yù)處理1 h后，加入AngⅡ（終濃度為1 μmol/L）；AngⅡ模型組細(xì)胞不加Sal B預(yù)處理，直接加入AngⅡ（終濃度為1 μmol/L）。培養(yǎng)24 h后，棄原培養(yǎng)液，用PBS洗細(xì)胞3次，每孔加入200 μL的二甲基亞砜（DMSO）和 20 μL的MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)孵育4 h。終止培養(yǎng)后，小心吸棄上清液，每孔加入150 μL的DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm波長處測定各孔光密度（OD）值，以O(shè)D值的大小表示細(xì)胞的增殖活性。

2.3.2 蘇木精-伊紅（HE）染色觀察細(xì)胞增殖情況 制備細(xì)胞爬片，試驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組、AngⅡ模型組和Sal B低、中、高濃度組。Sal B低、中、高濃度組加入12.5、25、50 μmol/L的Sal B預(yù)處理1 h后，加入AngⅡ（1 μmol/L）；AngⅡ模型組細(xì)胞不加Sal B預(yù)處理，直接加入AngⅡ（1 μmol/L）誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。作用24 h后，棄原培養(yǎng)液，用PBS洗細(xì)胞3次，然后加入4%多聚甲醛固定，蘇木精染色15～20 min，95%的乙醇潤洗5 s，伊紅染色20 min。鏡檢，著色滿意后拍照觀察細(xì)胞增殖情況。

2.4 Western blot法檢測細(xì)胞中蛋白的表達(dá)

將處于對(duì)數(shù)生長期的同一批細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h，按“2.3”項(xiàng)下方法分組和給藥處理。培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)上清液，用預(yù)冷的PBS漂洗細(xì)胞3次，加入裂解液和苯甲基磺酰氟裂解細(xì)胞并提取總蛋白。蛋白定量后，取總蛋白50 μg加入上樣緩沖液中煮沸3 min變性。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，然后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，3%牛血清白蛋白封閉后與兔源Ⅲ型膠原、MMP-9、Smad2/3、Smad7多克隆抗體（1∶200～1∶1 000）4℃孵育過夜，然后加入山羊抗兔二抗（1∶5 000）室溫孵育90 min。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液作用1 min后曝光，用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)所有選擇的目標(biāo)條帶灰度值進(jìn)行分析，最后用內(nèi)參GAPDH對(duì)各目標(biāo)條帶進(jìn)行均一化處理，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 心肌成纖維細(xì)胞的鑒定結(jié)果

免疫化學(xué)染色后，光鏡下可見細(xì)胞呈梭形或多角形，細(xì)胞質(zhì)被染成棕黃色，呈陽性反應(yīng)，符合成纖維細(xì)胞的染色特征，且其純度大于99%，結(jié)果見圖1。

圖1 心肌成纖維細(xì)胞的鑒定結(jié)果（×200）Fig 1 Identification results of cardiac fibroblasts（ ×200）

3.2 Sal B對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖的影響結(jié)果

3.2.1 MTT試驗(yàn)結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，AngⅡ模型組細(xì)胞的OD值明顯升高（P＜0.01），提示加入AngⅡ后可促進(jìn)細(xì)胞增殖；與AngⅡ模型組比較，Sal B低、中、高濃度組細(xì)胞的OD值均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），提示Sal B預(yù)處理可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞的增殖?？瞻讓?duì)照組、AngⅡ模型組和Sal B低、中、高濃度組細(xì)胞的OD值分別為0.49±0.03、0.64±0.04、0.55±0.01、0.54±0.01、0.51±0.04（n＝6）。

3.2.2 HE染色結(jié)果 HE染色后，可見細(xì)胞的胞核被染成藍(lán)色或淡藍(lán)色，胞漿為淡紅色，細(xì)胞形態(tài)飽滿，細(xì)胞膜完整。與空白對(duì)照組比較，AngⅡ模型組細(xì)胞增生活躍，胞體稍微增大，數(shù)量明顯增多；與AngⅡ模型組比較，Sal B各濃度組細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，結(jié)果見圖2。

圖2 各組細(xì)胞的HE染色觀察結(jié)果（×200）Fig 2 Results of HE staining of cells in each group（ ×200）

3.3 Sal B對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞中蛋白表達(dá)的影響結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，AngⅡ模型組細(xì)胞中Ⅲ型膠原、MMP-9和Smad2/3蛋白表達(dá)均顯著增強(qiáng)（P＜0.05），Smad7蛋白表達(dá)顯著減弱（P＜0.05）；與AngⅡ模型組比較，Sal B低、中濃度組細(xì)胞中MMP-9、Smad2/3蛋白表達(dá)和Sal B高濃度組細(xì)胞中Ⅲ型膠原、MMP-9蛋白表達(dá)均顯著減弱（P＜0.05），Sal B各濃度組細(xì)胞中Smad7蛋白表達(dá)均顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。蛋白電泳結(jié)果見圖3，測定結(jié)果見表1。

圖3 各組細(xì)胞中Ⅲ型膠原、MMP-9、Smad2/3、Smad7蛋白表達(dá)電泳圖Fig 3 Electrophoresis chart of protein expressions of typeⅢ collagen，MMP-9，Smad2/3，Smad7 of cells in each group

表1 各組細(xì)胞Ⅲ型膠原、MMP-9、Smad2/3、Smad7蛋白表達(dá)測定結(jié)果（±s，n＝3）Tab 1 Determination results of protein expressions of typeⅢ collagen，MMP-9，Smad2/3，Smad7 of cells in each group（±s，n＝3）

表1 各組細(xì)胞Ⅲ型膠原、MMP-9、Smad2/3、Smad7蛋白表達(dá)測定結(jié)果（±s，n＝3）Tab 1 Determination results of protein expressions of typeⅢ collagen，MMP-9，Smad2/3，Smad7 of cells in each group（±s，n＝3）

注：與空白對(duì)照組比較，＊P＜0.05；與AngⅡ模型組比較，#P＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05；vs.AngⅡ model group，#P＜0.05

組別空白對(duì)照組AngⅡ模型組Sal B低濃度組Sal B中濃度組Sal B高濃度組Smad7 1.00±0.00 0.44±0.01＊0.52±0.22#0.95±0.01#1.40±0.04#濃度，μmol/L 1 12.5 25 50Ⅲ型膠原1.00±0.00 2.19±0.48＊1.19±0.30 1.10±0.35 0.91±0.30#MMP-9 1.00±0.00 1.35±0.040＊0.72±0.01#0.70±0.01#0.59±0.02#Smad2/3 1.00±0.00 1.70±0.16＊0.42±0.01#0.76±0.15#1.69±0.28

4 討論

心肌纖維化是各種心血管疾病發(fā)生發(fā)展中心臟組織的共同病理改變，心肌纖維化導(dǎo)致的并發(fā)癥已成為心血管疾病死亡的主要原因。心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展都與心肌成纖維細(xì)胞增殖、過度分泌膠原及MMP有著十分緊密的聯(lián)系[3]。Sal B抗心肌纖維化的作用在一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已被證實(shí)[4]，但是其對(duì)心肌成纖維細(xì)胞的作用目前報(bào)道較少。過度的膠原沉積是心肌纖維化最主要也是最重要的特點(diǎn)，減少膠原蛋白的表達(dá)也是評(píng)價(jià)抗纖維化藥物最直觀的指標(biāo)之一[5]。本研究結(jié)果顯示，Sal B可以明顯減少細(xì)胞中Ⅲ型膠原的產(chǎn)生，從而發(fā)揮其抗心肌纖維化的作用。

MMP及其抑制劑維持著心臟組織中細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)MMP活性增高、MMP抑制劑活性降低時(shí)，細(xì)胞外基質(zhì)降解減少，最終造成膠原的過度沉積[6]。因此，抑制MMP-9的活性可以改善心肌纖維化的程度。本研究結(jié)果顯示，低、中、高濃度的Sal B均可降低細(xì)胞中MMP-9蛋白的表達(dá)。

TGF-β1信號(hào)通路是目前已知的最強(qiáng)的促纖維化信號(hào)通路之一。該信號(hào)通路上調(diào)可以促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其分化為心肌成纖維細(xì)胞，從而促進(jìn)膠原的合成、抑制膠原的降解，最終導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的積聚，并可介導(dǎo)炎癥因子白細(xì)胞介素6產(chǎn)生，促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)展[7]。在TGF-β1信號(hào)通路中，TGF-β1受體主要是通過磷酸化Smads蛋白調(diào)節(jié)纖維化基因的表達(dá)，促進(jìn)纖維化發(fā)展[8]。Smads蛋白可以分為3種，即受體調(diào)節(jié)Smads蛋白、共同介質(zhì)型Smads蛋白和抑制性Smads蛋白。Smad2/3是受體調(diào)節(jié)Smads蛋白，與受體結(jié)合后，可上調(diào)TGF-β1信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)；Smad7是抑制性Smads蛋白，可競爭性地結(jié)合TGF-β1受體，阻止受體調(diào)節(jié)Smads蛋白磷酸化，從而阻斷TGF-β1信號(hào)通路效應(yīng)[9]。本研究結(jié)果顯示，Sal B可以明顯下調(diào)Smad2/3蛋白的表達(dá)、上調(diào)Smad7的表達(dá)，抑制心肌成纖維細(xì)胞的異常增殖，減少Ⅲ型膠原和MMP-9的表達(dá)，從而發(fā)揮其抗心肌纖維化的作用。在本研究中，關(guān)于加入AngⅡ后細(xì)胞中Smad2/3、Smad7的變化規(guī)律與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本相符，但是加入Sal B后Smad2/3的變化趨勢卻是隨著Sal B濃度的增加而增強(qiáng)。筆者猜測可能由于低濃度是Sal B抑制細(xì)胞中Smad2/3蛋白表達(dá)的最佳濃度，在此濃度下Smad2/3蛋白的表達(dá)水平最低。關(guān)于Sal B抑制AngⅡ誘導(dǎo)細(xì)胞增殖后細(xì)胞中Smad2/3蛋白表達(dá)的變化規(guī)律還需要設(shè)計(jì)更多的試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，Sal B抗心肌纖維化的作用機(jī)制可能與其抑制心肌成纖維細(xì)胞的增殖，下調(diào)細(xì)胞Ⅲ型膠原、MMP-9、Smad2/3蛋白的表達(dá)及上調(diào)Smad7蛋白的表達(dá)有關(guān)，但其更多的作用機(jī)制有待進(jìn)一步證實(shí)。

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Study on the Mechanism of Anti-myocardial Fibrosis of Salvianolic Acid B

LUO Hong1，2，WANG Chunhua1，ZHAO Linglu1，YANG Yu1，CHEN Shiping1，XU Yini1，YANG Hongyu2，SHEN Xiangchun1（1.The High Educational Key Laboratory of Guizhou Province for Natural Medicinal Pharmacology and Druggability，Guizhou Medical University，Guiyang 550025，China；2.The Laboratory Animal Center of Guizhou Medical University，Guiyang 550025，China）

OBJECTIVE：To study the effects of salvianolic acid B（Sal B）on angiotensinⅡ（AngⅡ）-induced cardiac fibroblast proliferation，secretion of type Ⅲ collagen，protein expressions of matrix metalloproteinase 9（MMP-9），Smad2/3，Smad7，and explore its mechanism of anti-myocardial fibrosis.METHODS：Cells were divided into blank control group（culture medium）Ang Ⅱ model group，Sal B low-dose，medium-dose，high-dose groups（12.5，25，50 μmol/L）.After cultured 1 h by blank or drug-containing culture，except for blank control group，cells in other groups were added 1 μmol/L Ang Ⅱ to induce proliferation.for 24 h.MTT method and hematoxylin-eosin staining method were adopted investigate the effect of Sal B on proliferation.Western blot method was adopted to detect the effects of Sal B on protein expressions of typeⅢ collagen，MMP-9，Smad2/3，Smad7.RESULTS：Compared with blank control group，cells in AngⅡ model group were significantly proliferated，protein expressions of typeⅢ collagen，MMP-9，Smad2/3 were obviously enhanced，protein expression of Smad7 was obviously weakened，with statistical significances（P＜0.05）.Compared with Ang Ⅱ model group，the cell proliferation in Sal B groups were inhibited，protein expressions of typeⅢ collagen，MMP-9，Smad2/3 were weakened，while protein expression of Smad7 was enhanced.Except the pro-tein expression of typeⅢ collagen in Sal B low-dose and medium-dose groups，the protein expression of Smad2/3 in Sal B high-dose group did not change significantly，other indexes had statistical significances（P＜0.05）.CONCLUSIONS：The anti-myocardial fibrosis effect of Sal B may be associated with inhibiting the proliferation of cardiac fibroblasts，down-regulating protein expressions of typeⅢ collagen，MMP-9，Smad2/3 and up-regulating protein expression of Smad7.

Salvianolic acid B；Cardiac fibroblasts；TypeⅢ collagen；Matrix metalloproteinase 9；Transforming growth factor β1signaling pathway

R541

A

1001-0408（2017）28-3900-04

2017-02-23

2017-08-12）

（編輯：林 靜）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81560588）；貴州省科技合作計(jì)劃項(xiàng)目（No.黔科合LH字〔2016〕7356號(hào)）；貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目（No.黔科合JZ字〔2015〕2002號(hào)）；貴州省高層次創(chuàng)新型人才培養(yǎng)項(xiàng)目（No.黔科合人才〔2015〕4029號(hào)）；貴州醫(yī)科大學(xué)2015年高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（No.201510660007）

＊實(shí)驗(yàn)師，碩士。研究方向：心血管藥理學(xué)。電話：0851-86908928。E-mail：luohong1011@163.com

#通信作者：教授，博士生導(dǎo)師，博士。研究方向：心血管藥理學(xué)。電話：0851-88416149。E-mail：shenxiangchun@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.28.04