王忠成，顧爾莉，王身艷，王芳芳，俞沖，朱敏（.南通市第三人民醫(yī)院，江蘇南通6000；.南京中醫(yī)藥大學藥學院，南京 003）

RP-HPLC法同時測定加味補陽還五湯劑中4種成分的含量Δ

王忠成1＊，顧爾莉1#，王身艷2，王芳芳1，俞沖1，朱敏1（1.南通市第三人民醫(yī)院，江蘇南通226000；2.南京中醫(yī)藥大學藥學院，南京 210023）

目的：建立同時測定加味補陽還五湯劑中芍藥苷、苦杏仁苷、阿魏酸、川芎嗪含量的方法。方法：采用反相高效液相色譜法。色譜柱為YMC C18，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為320 nm（阿魏酸）、230 nm（芍藥苷）、207 nm（苦杏仁苷）、280 nm（川芎嗪），柱溫為30℃，進樣量為10 μL。結(jié)果：芍藥苷、苦杏仁苷、阿魏酸和川芎嗪檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為 0.191 2～1.912 μg/mL（r＝0.999 6）、0.117 4～1.174 μg/mL（r＝0.999 6）、0.011 5～0.115 μg/mL（r＝0.999 8）和0.001 66～0.016 6 μg/mL（r＝0.999 7）；定量限分別為1.912、1.174、0.115、0.016 6 μg/mL ，檢測限分別為0.25、0.40、0.05、0.008 5 μg/mL；精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為96.9%～100.3%（RSD＝1.3%，n＝6）、95.1%～100.3%（RSD＝2.2%，n＝6）、95.3%～100.2%（RSD＝2.0%，n＝6）、97.0%～100.0%（RSD＝1.3%，n＝6）。結(jié)論：該方法可靠、簡便、準確，適用于同時測定加味補陽還五湯劑中芍藥苷、苦杏仁苷、阿魏酸、川芎嗪的含量。

反相高效液相色譜法；加味補陽還五湯；芍藥苷；苦杏仁苷；阿魏酸；川芎嗪；含量測定

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish the method for simultaneous determination of paeoniflorin，amygdalin，ferulic acid and ligustrazine in Modified buying huanwu decoction.METHODS：RP-HPLC method was adopted.The determination was performed on YMC C18column with the mobile phase consisted of acetonitrile-0.1%phosphoric acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelengths were set at 320 nm（ferulic acid），230 nm（paeoniflorin），207 nm（amygdalin），280 nm（ligustrazine）.The column temperature was 30 ℃，and sample size was 10 μL.RESULTS：The linear ranges of paeoniflorin，amygdalin，ferulic acid and ligustrazine were 0.191 2-1.912 μg/mL（r＝0.999 6），0.117 4-1.174 μg/mL（r＝0.999 6），0.011 5-0.115 μg/mL（r＝0.999 8）and 0.001 66-0.016 6 μg/mL（r＝0.999 7），respectively.The limits of quantitation were 1.912，1.174，0.115，0.016 6 μg/mL，and the limits of detection were 0.25，0.40，0.05，0.008 5 μg/mL，respectively.RSDs of precision，stability and reproducible tests were all lower than 2.0%.The recoveries were 96.9%-100.3%（RSD＝1.3%，n＝6），95.1%-100.3%（RSD＝2.2%，n＝6），95.3%-100.2%（RSD＝2.0%，n＝6）and 97.0%-100.0%（RSD＝1.3%，n＝6）.CONCLUSIONS：The method is reliable，simple and accurate，and is suitable for simultaneous determination of paeoniflorin，amygdalin，ferulic acid and ligustrazine in Modified buyang huanwu decoction.

KEYWORDSRP-HPLC；Modified buyang huanwu decoction；Paeoniflorin；Amygdalin；Ferulic acid；Ligustrazine；Content determination

補陽還五湯劑出自清代王清任著《醫(yī)林改錯》，全方由黃芪、當歸、赤芍、地龍、川芎、桃仁、紅花等七味中藥組成，是目前治療中風等血栓性疾病應用頻率最高的方劑，方中重用黃芪補氣，與活血化瘀藥配伍，功在補氣、活血、通絡，主治氣虛血瘀之中風[1]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，補陽還五湯劑能抑制血小板活化、降低血液黏度，具有抗血栓，抗腦缺血及再灌注損傷，改善血液流變學等作用[1-5]。近年來，國內(nèi)對補陽還五湯劑的藥效物質(zhì)基礎及拆方進行了深入研究[6-10]，但是現(xiàn)有研究多以補陽還五湯劑經(jīng)典方組成及藥物劑量作為研究出發(fā)點，方中黃芪使用劑量較大，筆者在臨床應用過程中觀察到，方中君藥黃芪的用量需適宜，若連續(xù)超劑量使用，則可因患者病后無力運化而導致氣機壅滯，輕者影響食欲，重者痰濁壅滯。因此，本課題組在上述經(jīng)典方的基礎上加以化裁，減少黃芪用量，同時加用炒白術、仙鶴草等健脾補氣、消積中藥以擬定加味補陽還五湯劑，并參考相關文獻[11-12]，采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）建立了同時測定加味補陽還五湯劑中芍藥苷、苦杏仁苷、阿魏酸和川芎嗪含量的方法，以期為該方劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

E2695型HPLC儀，包括四元泵、柱溫箱、自動進樣器、二極管陣列檢測器、Empower色譜工作站（美國Waters公司）；FA1004型電子分析天平（寧波舜宇儀器有限公司）；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海研承儀器有限公司）；SHZ-DⅢ型循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）。

1.2 試劑

芍藥苷對照品（批號：S-061-150921）、苦杏仁苷對照品（批號：K-008-150518）、阿魏酸對照品（批號：A-100-151209）、川芎嗪對照品（批號：C-075-150629）均購自成都瑞芬思生物科技有限公司，純度均≥98%；乙腈和磷酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

1.3 藥材

藥材均購自南京益豐大藥房，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學藥學院陳建偉教授鑒定，黃芪為豆科黃芪屬蒙古黃芪Astragalus membranaceusvar.mongholicus的干燥根；當歸為傘形科當歸Angelica sinensis的干燥根；赤芍為毛茛科芍藥Paeonia lactiflora的干燥根；地龍為鉅引科參環(huán)毛蚓Pheretima aspergillum的干燥體；川芎為傘形科川芎Ligusticum chuanxiong的干燥根莖；桃仁為薔薇科桃Prunus persica的干燥成熟種子；紅花為菊科紅花Carthamus tinctorius的干燥花；仙鶴草為薔薇科植物龍芽草Agrimonia pilosa的干燥地上部分；白術為菊科植物白術Atractylodes macrocephala的干燥根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：YMC C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，8.0%→9.5%A；20～30 min，9.5%→10.0%A；30～35 min，10.0%→15.0%A；35～40 min，15.0%→16.0%A；40～60 min，16.0%→18.0%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：320 nm（阿魏酸）、230 nm（芍藥苷）、207 nm（苦杏仁苷）、280 nm（川芎嗪）；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。

2.2 樣品及溶液的制備

2.2.1 樣品的制備 按加味補陽還五湯劑的處方比例取黃芪30 g、當歸30 g、赤芍15 g、地龍10 g、川芎9 g、紅花30 g、桃仁10 g、仙鶴草15 g、炒白術15 g，置于同一2 000 mL圓底燒瓶中，加入相當于上述藥材8倍體積的水，浸泡30 min，回流提取2次，每次1 h，合并提取液，紗布過濾，濃縮至100 mL，加無水乙醇至含醇體積分數(shù)達85%，靜置24 h，抽濾，濾液回收乙醇至無醇味，加水定容至200 mL，即得。共制備3批樣品，編號為1、2、3。

2.2.2 混合對照品溶液 精密稱取芍藥苷對照品19.12 mg、苦杏仁苷對照品11.74 mg、阿魏酸對照品1.15 mg、川芎嗪對照品0.166 mg，分別置于2 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得單一對照品貯備液。精密吸取上述各單一對照品貯備液10 μL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液 取“2.2.1”項下樣品5 mL，加水定容至10 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對照溶液 按加味補陽還五湯劑的制備工藝和處方比例，取除赤芍、桃仁、當歸、川芎以外的藥材適量，按“2.2.1”項下方法制備陰性樣品，再按“2.2.3”項下方法制備，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

精密量取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達到基線分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)以苦杏仁苷峰計為5 000，保留時間為24.17 min。結(jié)果表明，其他成分對測定無干擾。

2.4 線性關系考察

分別精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液40、120、200、280、400 μL，分別置于2 mL量瓶中，加甲醇定容，即得系列混合對照品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表1。

2.5 定量限（LOQ）與檢測限（LOD）考察

取“2.2.2”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為10∶1時，得LOQ；當信噪比為3∶1時，得LOD，結(jié)果見表2。

2.6 精密度試驗

精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液10 μL，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，芍藥苷、苦杏仁苷、阿魏酸、川芎嗪峰面積的RSD分別為0.4%、0.6%、1.2%、1.7%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液（編號：1）適量，分別于室溫下放置0、1、2、4、8、12 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，芍藥苷、苦杏仁苷、阿魏酸、川芎嗪峰面積的RSD分別為0.4%、0.5%、1.0%、1.6%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復性試驗

取樣品（編號：1）適量，按“2.2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，芍藥苷、苦杏仁苷、阿魏酸、川芎嗪峰面積的RSD分別為0.6%、0.8%、1.0%、1.3%（n＝6），表明本方法重復性良好。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equations and linear range

表2LOQ與LOD測定結(jié)果（μg/mL）Tab 2 Results of LOQ and LOD（μg/mL）

2.9 加樣回收率試驗

精密量取已知含量的樣品（編號：1）0.5 mL，共6份，分別精密加入一定質(zhì)量的待測成分對照品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 3 Results of recovery tests（n＝6）

2.10 樣品含量測定

取3批樣品各適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計樣品含量，結(jié)果見表4。

3 討論

表4 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 4 Results of content determination of samples（n＝3，mg/g）

3.1 色譜柱的考察

本試驗曾考察了Chromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、BenetnachTMC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）以及YMC C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）等為本試驗色譜柱時樣品的分離效果。結(jié)果表明，YMC C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為本試驗的色譜柱時樣品的分離度及峰形較好，因此選擇上述色譜柱進行試驗。

3.2 流動相的考察

本試驗還考察了不同體積分數(shù)的甲醇-水、乙腈-磷酸、甲醇-冰乙酸、甲醇-磷酸、乙腈-水、乙腈-冰乙酸溶液作為流動相的結(jié)果。結(jié)果，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫時，各待測成分的分離度均較好，因此選擇上述溶液為本試驗流動相。

3.3 檢測波長的選擇

加味補陽還五湯劑含有多味中藥，成分復雜，本試驗對4種待測成分的單一對照品貯備液進行了200～400 nm全波長掃描，在保證各成分含量測定準確的前提條件下，選擇了最大吸收波長作為檢測波長，即阿魏酸在320 nm波長處、芍藥苷在230 nm波長、苦杏仁苷在207 nm波長處、川芎嗪在280 nm波長處，對處方中的樣品含量進行測定。

綜上所述，本方法可靠、簡便、準確，適用于同時測定加味補陽還五湯劑中芍藥苷、苦杏仁苷、阿魏酸、川芎嗪的含量。

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Simultaneous Determination of 4 Components in Modified Buyang Huanwu Decoction by RP-HPLC

WANG Zhongcheng1，GU Erli1，WANG Shenyan2，WANG Fangfang1，YU Chong1，ZHU Min1（1.Nantong Third People’s Hospital，Jiangsu Nantong 226000，China；2.School of Pharmacy，Nanjing University of TCM，Nanjing 210023，China）

R927.2

A

1001-0408（2017）27-3849-04

2016-10-28

2017-03-28）

（編輯：劉 柳）

江蘇省中醫(yī)藥局科技項目（No.LZ13167）；南通市科技計劃項目（No.HS2013047）

＊主治醫(yī)師，碩士。研究方向：中醫(yī)藥基礎及臨床。E-mail：doctorwzc@126.com

#通信作者：主任醫(yī)師。研究方向：中醫(yī)藥臨床。E-mail：740336946@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.27.29