耿婕，那順朝克圖，叢麗華，樊精輝，趙春雨，薛培鳳#（.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，呼和浩特000；.內(nèi)蒙古宇航人藥業(yè)有限責(zé)任公司，呼和浩特 057）

HPLC法同時(shí)測(cè)定五味沙棘顆粒中甘草苷和甘草酸的含量Δ

耿婕1＊，那順朝克圖1，叢麗華2，樊精輝2，趙春雨1，薛培鳳1#（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，呼和浩特010110；2.內(nèi)蒙古宇航人藥業(yè)有限責(zé)任公司，呼和浩特 011517）

目的：建立同時(shí)測(cè)定五味沙棘顆粒中甘草苷和甘草酸含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Thermo scientific ODS-2 Hypersil，流動(dòng)相為乙腈-0.5%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為237 nm，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為20 μL。結(jié)果：甘草苷和甘草酸檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍分別為48～480 μg（r＝0.999 9）、90～900 μg（r＝0.999 9）；定量限分別為0.55、2.10 μg/mL，檢測(cè)限分別為0.16、0.62 μg/mL；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為95.08%～97.58%（RSD＝0.93%，n＝6）、95.86%～99.89%（RSD＝1.67%，n＝6）。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)單準(zhǔn)確、重復(fù)性好，適用于五味沙棘顆粒中甘草苷和甘草酸含量的同時(shí)測(cè)定。

高效液相色譜法；五味沙棘顆粒；甘草苷；甘草酸；含量測(cè)定

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of liquiritin and glycyrrhizic acid in Wuwei shaji granules.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Thermo scientific ODS-2 Hypersil column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.5%phosphoric acid（gradient elution）with flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 237 nm，and column temperature was 25 ℃.The sample size was 20 μL.RESULTS：The linear ranges of liquiritin and glycyrrhizic acid were 48-480 μg（r＝0.999 9）and 90-900 μg（r＝0.999 9），respectively.The limits of quantitation were 0.55，2.10 μg/mL，and the limits of detection were 0.16，0.62 μg/mL.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 2.0%.The recoveries were 95.08%-97.58%（RSD＝0.93%，n＝6）and 95.86%-99.89%（RSD＝1.67%，n＝6），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate and reproducible，and can be used for the content determination of liquiritin and glycyrrhizic acid in Wuwei shaji granules.

KEYWORDSHPLC；Wuwei shaji granules；Liquiritin；Glycyrrhizic acid；Content determination

五味沙棘顆粒源于蒙醫(yī)清肺祛痰之主方五味沙棘散，由五味沙棘散經(jīng)劑型改變而成，由沙棘膏、木香、白葡萄干、甘草、梔子等五味中藥材組成[1-2]，具有清熱祛痰、止咳定喘之功效，常用于肺熱久咳、胸中滿悶、胸脅作痛、慢性支氣管炎見上述證候者。現(xiàn)代藥理研究表明，該制劑可顯著改善慢性支氣管炎模型小鼠的炎性病變，增強(qiáng)小鼠免疫功能[3]，改善慢性阻塞性肺疾病模型小鼠的肺部病變[4]。本課題組在前期研究的基礎(chǔ)上建立了測(cè)定五味沙棘顆粒中異鼠李素及梔子苷含量的方法[5-6]，但是目前尚未有測(cè)定該制劑中甘草主要成分（甘草苷和甘草酸）的方法。鑒于此，本課題組參考2015年版《中國(guó)藥典》（一部）[7]及文獻(xiàn)[8-9]，采用高效液相色譜法（HPLC）建立了同時(shí)測(cè)定該制劑中甘草苷和甘草酸含量的方法，以期為完善該制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

e2695型HPLC儀，包括四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器以及Empower色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；KQ-250DA型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；IKA RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)IKA公司）；AB135-S型及AL204型萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞典Mettler-Toledo公司）；Milli-Q AdvntageA10型超純水儀（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

五味沙棘顆粒（內(nèi)蒙古宇航人藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：20110102、20110201、20110401、20110701、20130 201、20131101，規(guī)格：6 g/袋）；甘草苷對(duì)照品（批號(hào)：120522，純度：≥98%）、甘草酸對(duì)照品（批號(hào)：120512，純度：≥98%）均購(gòu)自成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司；乙腈為色譜純，甲醇和磷酸為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo scientific ODS-2 Hypersil（250 mm×4.6 mm ，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.5%磷酸溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：237 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution procedure

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 取甘草苷和甘草酸對(duì)照品適量，精密稱定，加90%甲醇溶液制成每1 mL含甘草苷0.12 mg、甘草酸0.28 mg的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品1.3 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加90%甲醇溶液100 mL，密塞，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz，下同）處理15 min，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，分別用90%甲醇溶液洗滌藥渣及濾器3次，每次10 mL，合并濾液及洗液，蒸干，殘?jiān)?0%甲醇溶液使溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，并加90%甲醇溶液定容，搖勻，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按樣品的處方比例和制備工藝制備缺甘草的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性與專屬性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)以甘草苷峰計(jì)為6 400，保留時(shí)間為17.9 min；供試品色譜圖在與對(duì)照品相應(yīng)的保留時(shí)間處有相同的色譜峰，陰性對(duì)照溶液在此處無(wú)色譜峰，表明其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，專屬性良好。

2.4 線性關(guān)系考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，加90%甲醇溶液稀釋成甘草苷和甘草酸質(zhì)量濃度分別為0.024、0.045 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，精密吸取上述溶液各2、4、8、12、16、20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以甘草苷和甘草酸進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得甘草苷回歸方程為y＝2.0×106x+903.66（r＝0.999 9），甘草酸回歸方程為y＝5.2×105x+1 175.3（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，甘草苷和甘草酸檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍分別為48～480、90～900μg。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.5 定量限（LOQ）與檢測(cè)限（LOD）考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得LOQ；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得LOD。結(jié)果，甘草苷和甘草酸的LOQ分別為0.55、2.10 μg/mL；LOD分別為0.16、0.62 μg/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，甘草苷和甘草酸峰面積的RSD分別為0.39%、0.18%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20110701）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，甘草苷和甘草酸峰面積的RSD分別為0.25%、0.25%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：20110701）適量，共6份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果，甘草苷和甘草酸含量的平均值分別為0.244 2、0.409 3 mg/g，RSD分別為1.01%、0.93%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：20110701）適量，共6份，精密稱定，分別加入一定質(zhì)量的甘草苷和甘草酸對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 2 Results of recovery tests（n＝6）

2.10 樣品含量測(cè)定

取5批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算甘草苷和甘草酸的含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab 3 Results of content determination of samples（n＝3）

3 討論

3.1 提取工藝的確定

3.1.1 提取方法的選擇 本試驗(yàn)分別考察了超聲提取和回流提取兩種方法，結(jié)果超聲和回流兩種提取方法對(duì)樣品的提取率差異不大，綜合考慮超聲提取法簡(jiǎn)單易行，因此選擇超聲為本試驗(yàn)的提取方法。

3.1.2 提取溶劑的選擇 本試驗(yàn)對(duì)提取溶劑甲醇和乙醇進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種溶劑提取甘草苷時(shí)提取率無(wú)明顯差異，而甲醇提取甘草酸時(shí)提取率比乙醇高，故選擇甲醇為提取溶劑。

3.1.3 提取工藝的確定 本試驗(yàn)以甲醇濃度（%）、甲醇體積（mL）和提取時(shí)間（min）為考察因素，應(yīng)用L9（34）正交表確定了最優(yōu)提取方法為90%甲醇溶液100 mL，超聲提取15 min。

3.2 流動(dòng)相的選擇

本試驗(yàn)考察了乙腈-水、乙腈-1.0%磷酸溶液、乙腈-0.5%磷酸溶液和甲醇-0.5%磷酸溶液4種不同的流動(dòng)相，其中甲醇-0.5%磷酸溶液和乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)，色譜分離度較差；乙腈-1.0%磷酸溶液為流動(dòng)相時(shí)雜質(zhì)峰較多；乙腈-0.5%磷酸溶液為流動(dòng)相時(shí)，色譜分離度較好且無(wú)雜質(zhì)峰干擾，故選擇乙腈-0.5%磷酸溶液為本試驗(yàn)的流動(dòng)相。

綜上所述，本方法簡(jiǎn)單準(zhǔn)確、重復(fù)性好，適用于五味沙棘顆粒中甘草苷和甘草酸含量的同時(shí)測(cè)定。

[1]白清云.中國(guó)百科全書·蒙醫(yī)學(xué)[M].上海：上海科技出版社，1992：267.

[2]蘇日娜.五味沙棘散研究進(jìn)展[J].北方藥學(xué)，2012，9（5）：103-104.

[3]包桂蘭，于麗君，翟景波，等.五味沙棘散對(duì)慢性支氣管炎模型抗炎和免疫作用的研究[J].中藥藥理與臨床，2012，28（5）：58-59.

[4]布林白拉，斯琴塔娜，奧登塔娜，等.蒙藥沙棘五味散對(duì)慢性阻塞性肺病模型的作用[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2016，12（24）：11-12.

[5]耿婕，薛培鳳，趙子龍，等.高效液相色譜法測(cè)定五味沙棘顆粒中異鼠李素含量[J].中國(guó)藥業(yè)，2013，22（21）：27-28.

[6]薛培鳳，朝克圖，耿婕，等.HPLC法測(cè)定五味沙棘顆粒中梔子苷的含量[C]//中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì).中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)第七次中藥分析學(xué)術(shù)交流會(huì)會(huì)議論文集.北京：中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)，2014：246-249.

[7]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].2015年版.北京.中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：86、535、616-617.

[8]劉敏，周桂華，盧全德.高效液相色譜法測(cè)定五味沙棘散中梔子苷的含量[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2008，28（20）：1803-1804.

[9]拉喜那木吉拉，巴根那.HPLC測(cè)定蒙藥五味沙棘散中梔子苷含量[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2007，9（6）：18-20.

Simultaneous Determination of Liquiritin and GlycyrrhizicAcid in Wuwei Shaji Granules by HPLC

GENG Jie1，Nashunchaoketu1，CONG Lihua2，F(xiàn)AN Jinghui2，ZHAO Chunyu1，XUE Peifeng1（1.School of Pharmacy，Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010110，China；2.Inner Mongolia Yuhangren Pharmaceutical Co.，Ltd.，Hohhot 011517，China）

R927.2

A

1001-0408（2017）27-3836-03

2017-01-12

2017-06-23）

（編輯：劉 柳）

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（No.2011BAI07B02）；內(nèi)蒙古自治區(qū)“草原英才”項(xiàng)目（No.內(nèi)組通字〔2014〕27號(hào)）

＊碩士。研究方向：中蒙藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制。電話：0471-6653178。E-mail：gebi_888@163.com

#通信作者：教授，博士。研究方向：中蒙藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制。電話：0471-6653146。E-mail：xpfdc@vip.sina.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.27.25