羅蘭，李明麗，康家珍，2，3，王淑美，2，3，梁生旺，2，3#（.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣州50006；2.廣東藥科大學(xué)國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)重點(diǎn)研究室，廣州 50006；3.廣東藥科大學(xué)廣東高校中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，廣州 50006）

腦得生固體分散體膠囊的HPLC指紋圖譜研究Δ

羅蘭1，2，3＊，李明麗1，康家珍1，2，3，王淑美1，2，3，梁生旺1，2，3#（1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣州510006；2.廣東藥科大學(xué)國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)重點(diǎn)研究室，廣州 510006；3.廣東藥科大學(xué)廣東高校中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，廣州 510006）

目的：建立腦得生固體分散體膠囊的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜。方法：采用HPLC法。色譜柱為Hyspersil ODS2，流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm（葛根素）、345 nm（羥基紅花黃色素A），柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μL。以葛根素、羥基紅花黃色素A為參照，測(cè)定10批樣品的HPLC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，共有峰指認(rèn)及其化學(xué)成分確認(rèn)。結(jié)果：在210、345 nm波長(zhǎng)處，10批樣品的HPLC圖譜分別有29、23個(gè)共有峰；相似度均＞0.90；各共有峰藥材歸屬分別為三七、川芎、紅花、葛根、山楂；在210、345 nm波長(zhǎng)處各確認(rèn)了7種化學(xué)成分。結(jié)論：該研究所建HPLC指紋圖譜可為腦得生固體分散體膠囊的鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

腦得生固體分散體膠囊；高效液相色譜法；指紋圖譜

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish HPLC fingerprints of Naodesheng solid dispersion capsules.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Hyspersil ODS2 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.05%phosphoric acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelengths were 210 nm（puerarin），345 nm（hydroxfsafflor yellow A）.The column temperature was 30 ℃，and sample size was 10 μL.Using puerarin and hydroxysafflor yellow A as reference，HPLC fingerprints of 10 batches of sample were determined.Similarity evaluation，common peak identification and chemical components confirmation were performed by using Similarity Evaluation System of TCM Chromatographic Fingerprints（2012 edition）.RESULTS：There were 29 and 23 common peaks in HPLC fingerprints of 10 batches of samples at 210 nm and 345 nm，respectively.The similarity was higher than 0.90.The medicinal material attribute of common peaks were Panax notoginseng，Ligusticum chuanxiong，Carthamus tinctorius，Pueraia lobata and Crataegus pinnatifida.Moreover，7 chemical components were identified at 210，345 nm，respectively.CONCLUSIONS：Established HPLC fingerprints can provide reference for identification and quality evaluation of Naodesheng solid dispersion capsules.

KEYWORDSNaodesheng solid dispersion capsules；HPLC；Fingerprint

腦得生固體分散體膠囊是由三七、川芎、紅花、葛根、山楂（去核）組合而成的中成藥，具有活血化瘀、疏風(fēng)通經(jīng)、醒腦開(kāi)竅的功效，臨床上用于治療腦動(dòng)脈硬化、缺血性腦中風(fēng)及腦出血后遺癥等，療效顯著[1-2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，腦得生固體分散體膠囊所含藥材的有效成分具有抗模型大鼠腦缺血自由基損傷和改善腦血管循環(huán)障礙、降低腦缺血模型大鼠全血黏度水平的作用[3-4]。此外，腦得生固體分散體膠囊能降低腦缺血模型大鼠的腦含水量，對(duì)腦局部缺血具有保護(hù)作用[5]。

本課題組前期優(yōu)化了固體分散體制備工藝，采用熔融法，以PEG6000為載體，藥載比為1∶2（m/m），對(duì)所制的腦得生固體分散體膠囊進(jìn)行質(zhì)量考察，經(jīng)檢測(cè)符合2015年版《中國(guó)藥典》（二部）項(xiàng)下膠囊和固體分散體的各項(xiàng)檢查。腦得生固體分散體膠囊較普通膠囊提高了體外溶出度，溶出效果好。本試驗(yàn)采用高效液相色譜法（HPLC）[6-10]，分別在210、345 nm波長(zhǎng)處建立10批腦得生固體分散體膠囊HPLC指紋圖譜，并對(duì)14個(gè)化學(xué)成分進(jìn)行了鑒定，以期為該制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

2695型HPLC儀，包括2996型二極管激光陣列檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；BSZZ4S型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；KQ-100型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

腦得生固體分散體膠囊（廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院中藥分析實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)：091102、091109、091116、091123、091123、091129、091206、091213、091220、091227（S1～S10），規(guī)格：0.28 g/粒，相當(dāng)于1.37 g藥材/粒）；三七皂苷R1對(duì)照品（批號(hào)：110745-200415）、人參皂苷Rg1對(duì)照品（批號(hào)：110703-200726）、人參皂苷Rb1對(duì)照品（批號(hào)：110704-200318）、葛根素對(duì)照品（批號(hào)：110752-200108）、阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)：110773-200002）、羥基紅花黃色素A對(duì)照品（批號(hào)：111637-200502）、金絲桃苷對(duì)照品（批號(hào)：111521-200303）、牡荊素對(duì)照品（批號(hào)：111687-200501）、牡荊素鼠李糖苷對(duì)照品（批號(hào)：111668-200401）、蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100080-200306）、槲皮素對(duì)照品（批號(hào)：111632-200506）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；大豆苷對(duì)照品（上海君創(chuàng)生物科技有限公司，批號(hào)：Th0110020）；大豆苷元對(duì)照品（批號(hào)：08-0137）、染料木素對(duì)照品（批號(hào)：08-0118）均購(gòu)自上海順勃生物工程有限公司，以上對(duì)照品純度均＞98%；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hyspersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見(jiàn)表1）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm（葛根素）、345 nm（羥基紅花黃色素A）；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 取各待測(cè)成分對(duì)照品適量，精密稱定，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，制成單一對(duì)照品溶液。精密量取上述單一對(duì)照品溶液各1.0 mL，置于20 mL棕色量瓶中，加甲醇定容，即得混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品10粒，全部?jī)A出內(nèi)容物，混勻，取約1.5 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加70%甲醇溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）提取30 min，室溫冷卻后，再次稱定質(zhì)量，加70%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，既得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，在210 nm波長(zhǎng)處，以葛根素的保留時(shí)間和峰面積為參照，在345 nm波長(zhǎng)處，以羥基紅花黃色素A的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，在210 nm波長(zhǎng)處，29個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD＜3.0%（n＝6）；在345 nm波長(zhǎng)處，23個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD＜3.0%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：091102）適量，分別于室溫下放置0、3、6、9、12、18、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，在210 nm波長(zhǎng)處，以葛根素的保留時(shí)間和峰面積為參照，在345 nm波長(zhǎng)處，以羥基紅花黃色素A的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，在210 nm波長(zhǎng)處，29個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD＜3.0%（n＝7）；在345 nm波長(zhǎng)處，23個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD＜3.0%（n＝7），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品（批號(hào)：091102）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，在210 nm波長(zhǎng)處，以葛根素的保留時(shí)間和峰面積為參照，在345 nm波長(zhǎng)處，以羥基紅花黃色素A的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，在210 nm波長(zhǎng)處，29個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD＜3.0%（n＝6）；在345 nm波長(zhǎng)處，23個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD＜3.0%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成及共有峰相關(guān)分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 取10批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）對(duì)10批樣品的HPLC圖譜進(jìn)行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見(jiàn)圖1、圖2。

2.4.2 共有峰的歸屬和指認(rèn) 比較圖2中各圖譜，并對(duì)HPLC圖譜共有峰進(jìn)行歸屬。結(jié)果顯示，在210 nm波長(zhǎng)處，樣品HPLC圖譜29個(gè)共有峰中9、15、16、20、21、24、25、26、28、29號(hào)色譜峰來(lái)源于三七；8、13號(hào)色譜峰來(lái)源于川芎；1、11、14、19號(hào)色譜峰來(lái)源于紅花；3、4、5、6、7、8、11、12、13、17、18、22、23號(hào)色譜峰來(lái)源于葛根；2、10、11、12、27號(hào)色譜峰來(lái)源于山楂。在345 nm波長(zhǎng)處，樣品HPLC圖譜23個(gè)共有峰中10、18、20、21、23號(hào)色譜峰來(lái)源于三七；9、15、16、20號(hào)色譜峰來(lái)源于川芎；1、3、14、17、19、20號(hào)色譜峰來(lái)源于紅花；4、5、6、7、8、14、16、22號(hào)色譜峰來(lái)源于葛根；2、11、12、13、14、19號(hào)色譜峰來(lái)源于山楂。在210 nm波長(zhǎng)處，共有峰中3、6、17、20、21、23、25號(hào)峰被分別指認(rèn)為葛根素、大豆苷、大豆苷元、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、染料木素、人參皂苷Rb1；在345 nm波長(zhǎng)處，3、9、11、12、13、14、19號(hào)峰被分別指認(rèn)為羥基紅花黃色素A、阿魏酸、牡荊素、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、蘆丁、槲皮素。

圖1 10批樣品HPLC疊加指紋圖譜Fig 1 HPLC superposed fingerprints of 10 batches of samples

圖2 樣品HPLC對(duì)照指紋圖譜Fig 2 HPLC control fingerprints of samples

2.4.3 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）對(duì)10批樣品的HPLC圖譜進(jìn)行比較分析。結(jié)果，在210、345 nm波長(zhǎng)處，10批樣品（S1～S10）相似度均在0.90～0.99范圍內(nèi)，表明10批樣品HPLC圖譜與對(duì)照指紋圖譜具有較好的一致性。

2.4.4 共有峰相關(guān)數(shù)據(jù)分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）對(duì)10批樣品的HPLC圖譜進(jìn)行比較分析。在210、345 nm波長(zhǎng)處，10批樣品分別共有29、23個(gè)特征峰，通過(guò)對(duì)照品HPLC色譜確定3號(hào)峰為葛根素（210 nm）、羥基紅花黃色素A（345 nm）。以3號(hào)峰為參照峰，計(jì)算其他特征峰相對(duì)于3號(hào)峰的相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果，在210 nm波長(zhǎng)處，各共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均＜0.96%；在345 nm波長(zhǎng)處，各共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均＜1.23%，詳見(jiàn)表2、表3。

表2 10批樣品HPLC圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間（210 nm）Tab 2 Relative retention time of common peaks for HPLC chromatograms of 10 batches of samples（210 nm）

3 討論

本試驗(yàn)根據(jù)腦得生固體分散體膠囊有效部位中黃酮類、皂苷類、有機(jī)酸三大類成分的性質(zhì)，反復(fù)優(yōu)化以選取最佳色譜條件。考慮到乙腈具有末端吸收和黏度較小的優(yōu)勢(shì)，筆者只對(duì)乙腈-酸系統(tǒng)進(jìn)行考察，主要考察了乙腈-磷酸溶液和乙腈-醋酸溶液作為供試品分離的流動(dòng)相。由于醋酸的揮發(fā)性較大，易導(dǎo)致流動(dòng)相系統(tǒng)不穩(wěn)定，故圖譜存在重復(fù)性差的問(wèn)題，而乙腈-磷酸溶液流動(dòng)相系統(tǒng)檢測(cè)出的圖譜分離度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均較好，可以作為本試驗(yàn)的流動(dòng)相。由于本制劑化學(xué)成分復(fù)雜，且極性相差較大，等度洗脫難以實(shí)現(xiàn)成分分離，故采用梯度洗脫以兼顧偏強(qiáng)極性和弱極性成分的分析，得到的信息量較為豐富，各成分峰形尖銳且分離度較好。故確定乙腈-0.05%磷酸溶液作為流動(dòng)相，方式為梯度洗脫。

表3 10批樣品HPLC圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間（345 nm）Tab 3 Relative retention time of common peaks for HPLC chromatograms of 10 batches of samples（345 nm）

本試驗(yàn)考察了同一色譜條件下，4個(gè)不同柱溫（20、25、30、35℃）對(duì)腦得生固體分散體膠囊有效部位分離效果的影響。結(jié)果表明，柱溫越高，分離效果越好，但考慮到色譜柱的使用壽命，在分離度良好的前提下，選擇30℃為色譜柱的柱溫。

本試驗(yàn)對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了篩選。將供試品溶液于190～500 nm波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)在210、250、345和400 nm波長(zhǎng)處均有較強(qiáng)吸收。比較這4個(gè)波長(zhǎng)下的HPLC圖譜，由于各成分最大吸收波長(zhǎng)差異較大，故確定210 nm和345 nm為測(cè)定檢測(cè)波長(zhǎng)。本試驗(yàn)建立的色譜方法可在140 min內(nèi)展開(kāi)本制劑主要有效成分，并使大部分色譜峰達(dá)到基線分離，但由于流動(dòng)相梯度變化較大，使得基線有些漂移。

本試驗(yàn)采用同一批藥材自制了10批樣品，對(duì)其指紋色譜進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果，在210、345 nm波長(zhǎng)處，各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均符合指紋圖譜要求。同時(shí)，本試驗(yàn)闡明了腦得生固體分散體膠囊指紋圖譜中共有峰的藥材來(lái)源，并對(duì)其中14個(gè)共有峰進(jìn)行了化學(xué)成分確定。由于對(duì)照品的有限，對(duì)有效部位的化學(xué)成分歸屬和確定還需進(jìn)一步研究。

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Study on HPLC Fingerprints of Naodesheng Solid Dispersion Capsules

LUO Lan1，2，3，LI Mingli1，KANG Jiazhen1，2，3，WANG Shumei1，2，3，LIANG Shengwang1，2，3（1.College of TCM，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；2.State Key Laboratory of TCM Digital Quality Evaluation Technology，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；3.Engineering Technology Research Center for TCM Quality of the Universities of Guangdong，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

R917

A

1001-0408（2017）27-3828-04

2016-10-20

2016-12-14）

（編輯：張 靜）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81274059）

＊高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，博士。研究方向：中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制。電話：020-39352672

#通信作者：教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制。E-mail：swliang371@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.27.23