王旭波，徐利麗，鄭潔，李楠，沈玉萍，王智，韋波，楊歡#（1.常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院制藥與生物工程技術(shù)系，江蘇常州 1164；.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 101；.鎮(zhèn)江市藥品檢驗(yàn)所，江蘇鎮(zhèn)江 1050）

·藥物分析與檢定·

柱前衍生化-HPLC法測定市售3種膠類藥材中L-羥脯氨酸和膠原蛋白的含量Δ

王旭波1，2＊，徐利麗2，鄭潔2，李楠3，沈玉萍2，王智2，韋波2，楊歡2#（1.常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院制藥與生物工程技術(shù)系，江蘇常州 213164；2.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；3.鎮(zhèn)江市藥品檢驗(yàn)所，江蘇鎮(zhèn)江 212050）

目的：建立測定膠類藥材中L-羥脯氨酸（L-Hyp）和膠原蛋白含量的方法，并比較對照藥材與市售藥材中兩種成分的含量。方法：采用柱前衍生化法進(jìn)行前處理，并采用高效液相色譜法測定樣品中L-Hyp的含量：色譜柱為Kromasil C18，流動相為[乙腈-0.1 mol/L醋酸鈉緩沖液（pH 6.5，7∶93，V/V）]-[乙腈-水（4∶1，V/V）]（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為254 nm，柱溫為43℃，進(jìn)樣量為20 μL；再通過折算系數(shù)計(jì)算樣品中膠原蛋白的含量。結(jié)果：L-Hyp檢測質(zhì)量濃度線性范圍為2.5～40 μg/mL（r＝0.999 9）；定量限為0.20 μg/mL，檢測限為0.05 μg/mL；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜4.0%；加樣回收率為96.03%～102.07%（RSD＝2.20%，n＝9）。28批市售藥材中L-Hyp和膠原蛋白的含量有一定差異，其中13批市售阿膠藥材與阿膠對照藥材中兩種成分的含量較為接近，而5批龜甲膠和7批鹿角膠藥材中兩種成分的含量高于其對照藥材。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、可靠，適用于測定膠類藥材中L-Hyp和膠原蛋白的含量。

膠類藥材；L-羥脯氨酸；膠原蛋白；含量測定；柱前衍生化；高效液相色譜法

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish the method for the content determination of L-Hyp and collagen in gelatinous medicinal material，and to compare the contents of two components in reference medicinal material and commercially available medicinal material.METHODS：Pre-column derivatization was adopted for pretreatment.The content of L-Hyp was determined by HPLC.The determination was performed on Kromasil C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1 mol/L sodium acetate buffer（pH 6.5，7∶93，V/V）-acetonitrile-water（4∶1，V/V）（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 254 nm，and column temperature was set at 43℃.The sample size was 20μL.The content of collagen was calculated by using convert coefficient.RESULTS：The linear range of L-Hyp were 2.5-40 μg/mL（r＝0.999 9）.LOQ was 0.20 μg/mL，and LOD was 0.05 μg/mL.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 4.0%.The recoveries were 96.03%-102.07%（RSD＝2.20%，n＝9）.There was difference in the contents of L-Hyp and collagen among 28 batches of commercially available medicinal material.The contents of two components in 13 batches of commercially available Colla Corii Asini were relative close to reference medicinal material；5 batches of Colla Carapacis et Plastri Testudinis and 7 batches of Cervi Cornus Colla were much higher than those of reference medicinal material.CONCLUSIONS：The method is accurate，reliable and suitable for the content determination of L-Hyp and collagen in gelatinous medicinal material.

KEYWORDSGelatinous medicinal material；L-hydroxy proline；Collagen；Content determination；Pre-column derivation；HPLC

膠類藥材應(yīng)用歷史悠久，據(jù)《周禮·考工記》記載，先秦時(shí)期已有“鹿膠青白、馬膠赤白、牛膠火赤、鼠膠黑、魚膠餌、犀膠黃”等描述，表明我國古代在膠類藥材的應(yīng)用上已具有多樣化[1]。該類藥材富含多種氨基酸和膠原蛋白[2-4]，具有補(bǔ)血止血、滋陰潤燥等功效，并以滋補(bǔ)強(qiáng)壯作用突出而聞名于世[5]。2015年版《中國藥典》（一部）[6]收載了阿膠、龜甲膠和鹿角膠3味膠類藥材，并對其外觀性狀、鑒別方法、檢測項(xiàng)目和含量限度等作了明確的規(guī)定。L-羥脯氨酸（L-Hyp）和膠原蛋白是膠類藥材的指標(biāo)性有效化學(xué)成分，近年來測定L-Hyp的方法主要包括分光光度法、氨基酸分析儀法、氣相色譜/質(zhì)譜法、柱前衍生化-高效液相色譜法（HPLC）和電泳法等[7-8]，而膠原蛋白的含量主要根據(jù)L-Hyp的含量乘以相應(yīng)的折算系數(shù)而得到。然而目前尚未有同時(shí)測定阿膠、龜甲膠和鹿角膠3味膠類藥材中上述兩種成分含量的報(bào)道。鑒于此，本課題組綜合考慮膠類藥材的特性以及試驗(yàn)的簡便性，采用柱前衍生化-HPLC法測定市售膠類藥材中L-Hyp和膠原蛋白的含量，以期為完善膠類中藥的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-10AVP型HPLC儀，包括SPD-10A紫外/可見光檢測器（日本Shimadzu公司）；N2000 SP1工作站（浙江大學(xué)智達(dá)信息工程有限公司）；Milli-Q Advantage A10型超純水儀（美國Millipore公司）；AE240型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑

L-Hyp對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111578-201602，純度：＞95%）；乙腈為色譜純，醋酸鈉、鹽酸、三乙胺、異硫氰酸苯酯均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

收集28批市售膠類藥材及4批對照藥材，置于干燥陰暗處保存，樣品信息見表1。

表1 樣品信息Tab 1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：[乙腈-0.1 mol/L醋酸鈉緩沖液（pH 6.5，7∶93，V/V），（A）]-[乙腈-水（4∶1，V/V），（B）]，梯度洗脫（洗脫程序見表2）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：43 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取L-Hyp對照品8.00 mg，置于100 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為80.0 μg/mL的L-Hyp對照品貯備液。取上述對照品貯備液適量，置于10 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液定容，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 取藥材樣品粉末0.25 g，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液20 mL，超聲（功率：500 W，頻率：40 kHz，下同）處理30 min，放冷至室溫，加0.1 mol/L鹽酸溶液定容，搖勻，即得供試品貯備液。精密量取上述供試品貯備液2.0 mL，置于5 mL安瓿中，加濃鹽酸2 mL，于150℃下水解1 h，放冷至室溫；水解液轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，用10 mL雙蒸水分次洗滌安瓿，洗液并入蒸發(fā)皿中，蒸干；殘?jiān)?.1 mol/L鹽酸溶液溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，再加0.1 mol/L鹽酸溶液定容，搖勻，即得。

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution process

2.2.3 柱前衍生化 精密量取上述對照品溶液和供試品溶液各5 mL，分別置于25 mL量瓶中，各加含0.1 mol/L異硫氰酸苯酯的乙腈溶液2.5 mL、含1 mol/L三乙胺的乙腈溶液2.5 mL，搖勻，于室溫下放置1 h；加50%乙腈溶液定容，搖勻；各取10 mL，加正已烷10 mL，搖勻，于室溫下放置10 min，取下層溶液，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下對照品溶液、供試品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)以L-Hyp峰計(jì)為8 500，保留時(shí)間為7.5 min。結(jié)果表明，其他成分對測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 線性關(guān)系考察

取“2.2.1”項(xiàng)下對照品貯備液適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法柱前衍生化后逐級稀釋，制成L-Hyp質(zhì)量濃度分別為40、20、10、5、2.5 μg/mL的系列對照品溶液。取上述系列對照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以L-Hyp質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得L-Hyp回歸方程為y＝3 502.5x－2 168.3（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，L-Hyp檢測質(zhì)量濃度線性范圍為2.5～40 μg/mL。

2.5 定量限（LOQ）與檢測限（LOD）考察

取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法柱前衍生化后倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得LOQ為0.20 μg/mL；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得LOD為0.05 μg/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法柱前衍生化后，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，L-Hyp峰面積的RSD＝1.13%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號：20120506）適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法柱前衍生化后，分別于室溫下放置0、2、4、8、16、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，L-Hyp峰面積的RSD＝1.30%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取阿膠（批號：20120506）、龜甲膠（批號：20100529）和鹿角膠（批號：20121201）藥材樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液1～3，按“2.2.3”項(xiàng)下方法柱前衍生化后，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，3個(gè)供試品溶液中L-Hyp峰面積的RSD分別為3.06%、1.98%、2.95%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的藥材樣品（批號：20120506）粉末適量，每份約125 mg，精密稱定，分別加入低、中、高質(zhì)量的L-Hyp對照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法柱前衍生化后，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 3 Results of recovery tests（n＝9）

2.10 樣品含量測定

取32批藥材樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法柱前衍生化后，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算L-Hyp含量。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[9-10]，L-Hyp一般占膠原蛋白干重的14%左右，但隨著組織來源、部位的不同而有所差異，如軟骨中約占10%左右。目前，陸生動物常用7.1作為折算系數(shù)，水生和兩棲動物則多采用11.1為折算系數(shù)[10]。據(jù)此，本研究中阿膠、鹿角膠藥材以7.1為折算系數(shù)，而龜甲膠藥材以11.1為折算系數(shù)，結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 對結(jié)果的分析

根據(jù)2015年版《中國藥典》（一部）規(guī)定[6]，按干燥品計(jì)算，阿膠中L-Hyp含量不得少于8.0%；龜甲膠中LHyp含量不得少于5.4%；鹿角膠中L-Hyp含量不得少于6.6%。在被檢測的4批膠類對照藥材以及28批市售膠類藥材中，除阿膠藥材3、4兩個(gè)批次樣品中L-Hyp含量未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)外，其余均符合藥典中的含量測定要求。

本研究中，阿膠、龜甲膠和鹿角膠對照藥材中L-Hyp的平均含量依次為9.11%、6.93%、8.06%，阿膠藥材的L-Hyp含量最高；膠原蛋白的平均含量分別為64.65%、76.92%、57.23%，龜甲膠藥材中膠原蛋白含量最高。28批市售藥材中L-Hyp和膠原蛋白的含量有一定差異，其中有13批市售阿膠藥材與對照品藥材中兩種成分的含量較為接近，而5批龜甲膠和7批鹿角膠藥材中兩種成分的含量高于其對照藥材。

3.2 柱前衍生化-HPLC法適于測定膠類藥材中氨基酸的含量

表4 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，%）Tab 4 Content determination of samples（n＝3，%）

從本文的色譜圖以及精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率等試驗(yàn)結(jié)果可見，本研究所建立方法是準(zhǔn)確、可靠的。此外，值得注意的是，在分析時(shí)間內(nèi)，除了L-Hyp的色譜峰之外，尚有其余17個(gè)氨基酸衍生物的色譜峰，其中6個(gè)色譜峰的分離度欠佳，出現(xiàn)部分重疊。因而，在后續(xù)研究中，可以對流動相體系、梯度洗脫程序、柱溫等條件進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化，利用HPLC法實(shí)現(xiàn)膠類藥材中更多氨基酸含量的準(zhǔn)確測定。

3.3 部分龜甲膠藥材中膠原蛋白含量偏高

龜甲膠是由兩棲類動物烏龜Chinemys reevesii（Gray）的龜甲（Testudinis Carapax ET Plastrum）經(jīng)水煎煮、濃縮制成的固體膠。研究中發(fā)現(xiàn)，龜甲膠對照藥材的膠原蛋白平均含量為76.92%，而有3批龜甲膠藥材中的膠原蛋白含量均＞103%，遠(yuǎn)高于對照藥材，有可能是由于這些產(chǎn)品為了達(dá)到藥典對L-Hyp含量的要求，而人為添加了L-Hyp或者其他來源的膠原蛋白所致，但仍需進(jìn)一步證實(shí)。

3.4 部分阿膠藥材中膠原蛋白含量遠(yuǎn)低于對照藥材

本研究測定了15批市售阿膠藥材中的L-Hyp和膠原蛋白含量，結(jié)果表明這些產(chǎn)品有13批阿膠藥材中LHyp和膠原蛋白的含量與2個(gè)批次的阿膠對照藥材比較接近。然而，研究發(fā)現(xiàn)有2個(gè)批次阿膠藥材中L-Hyp和膠原蛋白的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對照藥材和其他阿膠藥材，這可能是由于生產(chǎn)過程中投料不足、生產(chǎn)工藝不規(guī)范等原因所致。

3.5 膠類藥材的專屬性鑒定研究亟待深入

到目前為止，中國食品藥品檢定研究院僅出品了2批阿膠、1批鹿角膠和1批龜甲膠對照藥材，因而本研究中只分析了這4個(gè)批次的膠類對照藥材中L-Hyp和膠原蛋白的含量。市售膠類藥材的需求量大，市面上偽品和摻偽品較多，如豬皮膠和雜皮膠等，因而成為近年來鑒定研究的熱點(diǎn)。2015年版《中國藥典》（一部）中膠類藥材的質(zhì)量控制體系雖然愈發(fā)完善，但其專屬性鑒定的研究基礎(chǔ)仍然相對薄弱；因此，在后續(xù)研究中擬選擇特異性高的目標(biāo)分子和靈敏度高的分析技術(shù)，開展相應(yīng)的基礎(chǔ)研究并最終實(shí)現(xiàn)對膠類中藥的準(zhǔn)確鑒別。

綜上所述，本方法準(zhǔn)確、可靠，適用于測定膠類藥材中L-Hyp和膠原蛋白的含量。

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Content Determination of L-Hyp and Collagen in 3 kinds of Gelatinous Chinese Medicines by Pre-column Derivation-HPLC

WANG Xubo1，2，XU Lili2，ZHENG Jie2，LI Nan3，SHEN Yuping2，WANG Zhi2，WEI Bo2，YANG Huan2（1.Dept.of Pharmaceutical Technology and Biological Engineering，Changzhou Vocational Institute of Engineering Technology，Jiangsu Changzhou 213164，China；2.School of Pharmacy，Jiangsu University，Jiangsu Zhenjiang 212013，China；3.Zhenjiang Institute for Drug Control，Jiangsu Zhenjiang 212050，China）

R282

A

1001-0408（2017）27-3824-04

2017-01-27

2017-04-20）

（編輯：劉 柳）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81303174）；江蘇省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（No.201713102021H）；常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院院級科研項(xiàng)目（No.11130100116002）

＊講師，碩士研究生。研究方向：藥物分析。電話：0519-886332101。E-mail：8000000617@email.czie.edu.cn

#通信作者：副教授，博士。研究方向：中藥鑒定。電話：0511-88791564。E-mail：yanghuan1980@ujs.edu.cn

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.27.22