趙瑞，崔進(jìn)，梅連瑞，許曉菁，金鑰，閆師杰，3，*，劉祥

（1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津300384；2.天津市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)技術(shù)研究院，天津300308；3.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津300384；4.天津市食品安全檢測(cè)技術(shù)研究院，天津300308）

超高效液相色譜-質(zhì)譜測(cè)定牛乳中游離氨基酸

趙瑞1，崔進(jìn)2，梅連瑞2，許曉菁2，金鑰2，閆師杰1，3，*，劉祥4，*

（1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津300384；2.天津市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)技術(shù)研究院，天津300308；3.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津300384；4.天津市食品安全檢測(cè)技術(shù)研究院，天津300308）

建立牛乳中未衍生游離氨基酸的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的測(cè)定方法。樣品采用酸化乙腈沉淀蛋白，正己烷脫脂，氮吹至近干后初始流動(dòng)相復(fù)溶，超聲溶解離心過膜后檢測(cè)。結(jié)果顯示：在14 min內(nèi)所分析目標(biāo)物得到較好的分離，濃度與峰面積的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.991 2～0.999 8之間，回收率在76%～124%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.0%～12.9%。

牛乳；未衍生游離氨基酸；超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；親水作用

Abstract：A method for determining of underivatized free amino acids in milk was developed with ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）.The protein of sample was precipitated with acid acetonitrile，the supematant was purified by n-hexane，then the purified solution was concentrated by nitrogen，dissolved with the initial mobile phase by ultrasonic assistance，centrifuged and filtered for ultra-high performance liquid chromatographic analysis.The results indicated that good separation of amino acids was obtained within 14 min.The linearity of the investigated compounds between concentrations and their peak areas within the test ranges was good，and the correlation coefficient was from 0.991 2 to 0.999 8.The average recoveries and relative standard deviations of 14 amino acids at three spiked levels were in the range of 76%-124%and 1.0%-12.9%respectively.

Key words：milk；underivatized free amino acids；ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）；hydrophilic interaction

鮮牛乳中含有一定量人體所必需的游離氨基酸，它可以提高人體免疫功能從而起到預(yù)防作用，谷氨酸和甘氨酸是其主要形式，其含量是一定的。但是近年來部分商家受利益的驅(qū)使，會(huì)在牛奶中添加非蛋白含氮化合物或者是單一的氨基酸[1]，以期提高牛奶中蛋白含氮量。因此，為解決牛乳中額外添加氨基酸的問題，對(duì)牛乳中游離氨基酸的定量檢測(cè)非常必要。

大多數(shù)氨基酸本身不具有紫外吸收和熒光檢測(cè)的發(fā)色基團(tuán)，所以當(dāng)使用氨基酸分析儀[2]傳統(tǒng)的液相色譜法[3-5]、薄層色譜法[6]及毛細(xì)管電泳法[7]等，首先需要對(duì)氨基酸進(jìn)行衍生處理，其方法操作繁瑣、衍生試劑不穩(wěn)定、有副產(chǎn)物干擾及延長(zhǎng)分析時(shí)間，給氨基酸的測(cè)定帶來了諸多的不便。隨著質(zhì)譜的發(fā)展，有些學(xué)者研究了不需衍生的高效液相-蒸發(fā)光散射檢測(cè)[8]（High Performance Liquid Chromatography-Evaporative Light scattering Detector，HPLC-ELSD）及高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用[9]（High Performance Liquid Chromatography Mass Spectrometry，HPLC-MS）等，但是這些方法往往在流動(dòng)相中添加了三氟乙酸、全氟酸七氟丁酸、等離子對(duì)試劑，這些試劑容易對(duì)色譜柱及儀器造成污染。鑒于此，本試驗(yàn)應(yīng)用親水作用色譜模式下的超高效液質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定氨基酸，實(shí)現(xiàn)了不衍生、高分辨率、高靈敏、高速分析牛奶中的游離氨基酸。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

AB Triple Quad 6500型串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國AB公司，配Agilent 1290型超高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；ML204/02型天平：Mettler-Toledo公司；PICOZ1型低溫高速離心機(jī)：美國Thermo公司；OA-SYS型氮吹濃縮儀：美國Organomation公司；IKA MS3 DIGITAL渦旋儀：上海研域儀器設(shè)備有限公司；Waters Symmetry 色譜柱（C18 4.6×150 mm，5 μm）：美國 Waters公司；Kinetex HILIC 100A HPLC Column（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）：美國菲羅門Phenomenex公司；ZIC-HILIC 柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm，100A）：德國Merck公司。

超純水（屈臣氏蒸餾水）：廣州屈臣氏食品飲料有限公司北京飲料分公司；乙腈（色譜純）：德國MERCK公司；甲酸（ACS純）、甲酸銨：美國Sigma公司。

氨基酸混標(biāo)：丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）、亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Ile）、組氨酸（His）、精氨酸（Arg）、甲硫氨酸（Met）、絲氨酸（Ser）、苯丙氨酸（Phe）、蘇氨酸（Thr）、纈氨酸（Val）、酪氨酸（Tyr）、谷氨酸（Glu）、賴氨酸（Lys）、甘氨酸（Gly），濃度均為 2.5 μmol/mL，溶劑為0.1 mol/L鹽酸：美國Sigma-Aldrich公司。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：取0.1 mL氨基酸混標(biāo)于10 mL棕色容量瓶中，以0.1 mol/L鹽酸溶解和定容，得到25 μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；再配制成2.5 μmol/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液；用時(shí)根據(jù)需要，用初始流動(dòng)相將中間液進(jìn)行稀釋，稀釋成適當(dāng)濃度作為標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2 色譜條件

色譜柱：Kinetex HILIC 100A色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）。

條件：流動(dòng)相：A相為10 mmol/L甲酸銨-水，B相為2 mmol/L甲酸銨-3%水-乙腈（均含有0.15%甲酸）；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量2 μL；柱溫35℃。梯度洗脫見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 The program of gradient elution

1.3 質(zhì)譜條件

三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；電噴霧正離子（ESI+）模式掃描；電噴霧電壓（IS）：5 500 V；離子源溫度：550℃；霧化氣壓力（GS1）：60 psi；輔助氣壓力（GS2）：60 psi；氣簾氣壓力（CUR）：30 psi。經(jīng)優(yōu)化后的各類化合物的質(zhì)譜參數(shù)如表2。

表2 氨基酸的主要質(zhì)譜采集參數(shù)Table 2 Mass spectrometric and acquisition parameters of amino acids

1.4 樣品前處理

稱取1.0 g樣品（精確至0.000 1 g）于15 mL離心管中，用2%甲酸乙腈定容到10 mL，渦旋振蕩1 min，超聲提取10 min，4℃下9 500 r/min離心10 min。全部轉(zhuǎn)移上清液于離心管中，加5 mL正己烷，渦旋2 min，靜置分層后棄上層液體。下層溶液于30℃水浴氮吹至近干。添加初始流動(dòng)相復(fù)溶，超聲1 min后9 500 r/min離心5 min，上清液經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過濾后上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜與色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

氨基酸為極性化合物，故試驗(yàn)選擇ESI離子源[10]。將濃度為0.25 μmol/L氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液采用直接針泵進(jìn)樣方式注入質(zhì)譜儀中，在正離子模式下進(jìn)行母離子質(zhì)譜掃描，得到各個(gè)氨基酸豐度較高的[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰。以母離子為基礎(chǔ)進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析選擇出兩個(gè)子離子，最后對(duì)各自的碰撞能量、去簇電壓等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使其離子豐度和方法的靈敏度達(dá)到最佳。正離子模式下測(cè)定的氨基酸質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化

2.1.2.1 色譜柱的選擇

氨基酸是一類極性較大的小分子量化合物，在傳統(tǒng)的C18柱上幾乎無保留。本試驗(yàn)嘗試選擇Waters Symmetry C18（5 μm，4.6×150 mm）進(jìn)行分離檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)部分生物胺的峰形較好且響應(yīng)也較高，但是均集中在1min出峰，隨后調(diào)節(jié)流動(dòng)相組成和改變梯度洗脫，保留時(shí)間也沒有出現(xiàn)明顯改善。W A Huub Waterval[11]和湯新星[12]均使用C18在流動(dòng)相中添加全氟庚酸實(shí)現(xiàn)了氨基酸的未衍生檢測(cè)。但全氟庚酸屬于離子對(duì)試劑，雖然可以改善極性化合物在反相色譜柱中的分離效果，但這些試劑不易揮發(fā)且對(duì)檢測(cè)的離子抑制效應(yīng)非常明顯，不適用液質(zhì)聯(lián)用。

親水作用色譜（HILIC）于1990年由Andrew Alpert提出，是一種針對(duì)強(qiáng)極性化合物的新型液相色譜技術(shù)，其保留機(jī)制較為復(fù)雜，包括氫鍵作用、靜電作用和偶極作用等，常使用硅膠、氰基、氨基等填料[13]。根據(jù)氨基酸的特點(diǎn)，同時(shí)氨基酸中既有堿性氨基酸、中性氨基酸，又有酸性氨基酸，試驗(yàn)首先選擇固定相為兩性離子甜菜堿的Merck ZIC-Hilic色譜柱對(duì)化合物進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氨基酸有較好的保留和分離效果，且峰形較好。但在進(jìn)一步的加標(biāo)試驗(yàn)和實(shí)際樣品檢測(cè)過程中，發(fā)現(xiàn)該色譜柱的耐受性較差，隨著試驗(yàn)樣品量的增加，色譜峰拖尾現(xiàn)象明顯，結(jié)果重復(fù)性下降。隨后嘗試采用耐用性相對(duì)較好的[14]Kinetex HILIC（2.6 μm，100×2.1 mm）色譜柱，試驗(yàn)結(jié)果表明該色譜柱可以在小比例水相流動(dòng)相的情況下很好地將目標(biāo)物保留和分離。

2.1.2.2 流動(dòng)相的選擇

采用流動(dòng)相中均添加甲酸銨，不僅可以使待測(cè)物質(zhì)容易質(zhì)子化而提供足夠的帶電離子，而且整個(gè)分離系統(tǒng)維持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的酸性環(huán)境中，有利于增加目標(biāo)物色譜峰形尖銳，提高靈敏度。為提高氨基酸的分離度，同時(shí)減少樣品的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)合色譜柱的分離特性，選擇在流動(dòng)相中添加甲酸。試驗(yàn)還考察了流動(dòng)相中甲酸銨的濃度和pH值、梯度洗脫的設(shè)置等條件對(duì)分離效果的影響，最終確定了最佳的流動(dòng)相條件，使得HILIC柱顯示出較好的分離效果，并且具有較好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，其色譜圖如圖1。

圖1 氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的典型MRM色譜圖Fig.1 Representative MRM chromatograms of amino acids mixed standard

2.2 樣品前處理方法的優(yōu)化

牛奶中含有大量的蛋白質(zhì)，若不除去將嚴(yán)重干擾目標(biāo)物的測(cè)定，參考文獻(xiàn)報(bào)道其方法主要[15]分為兩種思路：蛋白質(zhì)沉淀法和固相萃取法。固相萃取法的凈化效率較高，但是對(duì)目標(biāo)物氨基酸損失較大，并且氨基酸有是一大類包含至少一個(gè)羧基、一個(gè)氨基官能團(tuán)的極性化合物，很難靠單純的陰陽離子固相萃取法同步實(shí)現(xiàn)十多種物質(zhì)的凈化，不適用于大量樣品的檢測(cè)。沉淀蛋白的方法主要有沉淀劑沉淀、酸沉淀、有機(jī)溶劑沉淀等。氨基酸在純有機(jī)溶劑中的溶解度較水溶性溶液中的溶解度小，液態(tài)奶中本身為水溶液，同時(shí)考慮到ESI+檢測(cè)模式，本試驗(yàn)采取酸化乙腈方式進(jìn)行沉淀蛋白。參考文獻(xiàn)[16]使用三氯乙酸，但發(fā)現(xiàn)三氯乙酸的沉淀效果較差，離心后上層液仍較為渾濁，試驗(yàn)選擇甲酸。為兼顧回收率和降低基質(zhì)效應(yīng)兩個(gè)方面，試驗(yàn)比較了0.5%、1%、2%的甲酸比例，結(jié)果表明當(dāng)使用0.5%甲酸時(shí)，只有部分氨基酸有信號(hào)響應(yīng)。甲酸比例為1%、2%時(shí)所有氨基酸均有信號(hào)響應(yīng)，但2%甲酸處理后的信號(hào)強(qiáng)度較強(qiáng)，同時(shí)很大程度地降低了基質(zhì)效應(yīng)，故選擇2%甲酸。因牛奶中油脂含量也相對(duì)較多，導(dǎo)致氮吹干加流動(dòng)相復(fù)溶后溶液渾濁，預(yù)先用正己烷萃取去除脂質(zhì)可有效消除這種現(xiàn)象。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

將15種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)中間液稀釋成0.08、0.25、0.5、0.8、1.0、1.5 μmol/L 6 個(gè)不同濃度，按照優(yōu)化的方法測(cè)定后以氨基酸峰面積（y）對(duì)其濃度（x）進(jìn)行線性回歸分析，得到15種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表3。

表3 氨基酸回歸方程、線性系數(shù)、定量下限、回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Limits of regression equations，correlation coefficients，quantitation（LOQs），recoveries and RSDs of amino acids（n=6）

如表3所示，15種氨基酸在濃度為0.08 μmol/L～1.5μmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，在0.9912～0.9998之間；分別向樣品中添加低中高3個(gè)水平（2、10、20 μmol/L）的氨基酸，重復(fù)6次，計(jì)算回收率和重復(fù)性；以色譜峰面積10倍信噪比（S/N）計(jì)算氨基酸的定量下限。

2.4 方法應(yīng)用

按照本試驗(yàn)中所優(yōu)化的方法，對(duì)新鮮牛奶、巴士殺菌奶和超高溫奶中的游離氨基酸進(jìn)行了檢測(cè)，方法重現(xiàn)性、回收率較好。

3 結(jié)論

建立牛乳中游離氨基酸的超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。樣品前處理使用蛋白質(zhì)沉淀法，親水液相色譜質(zhì)譜檢測(cè)，無需對(duì)氨基酸進(jìn)行衍生處理。該方法的目標(biāo)氨基酸的相關(guān)系數(shù)大于0.99，定量下限范圍為0.008 μmol/L～0.08 μmol/L，平均回收率為 76%～124%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.0%～12.9%。本方法前處理技術(shù)簡(jiǎn)單、試驗(yàn)成本低、分析效率高，檢出限能夠滿足牛乳中游離氨基酸的要求，是快速、全面、準(zhǔn)確測(cè)定牛乳中游離氨基酸的可靠方法，為判定牛乳及其制品的質(zhì)量及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提供了科學(xué)依據(jù)。

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Determination of Free Amino Acids in Milk by Ultra-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHAO Rui1，CUI Jin2，MEI Lian-rui2，XU Xiao-jing2，JIN Yue2，YAN Shi-jie1，3，*，LIU Xiang4，*
（1.College of Food Science and Biological Engineering，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China；2.Tianjin Product Quality Supervision and Testing Technology Research Institute，Tianjin 300308，China；3.Tianjin Engineering and Technology Research Center of Agricultural Products Processing，Tianjin 300384，China；4.Tianjin Food Safety Testing Technology Research Institute，Tianjin 300308，China）

2017-02-06

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.034

趙瑞（1989—），女（漢），碩士研究生，主要從事動(dòng)物源性食品安全與營(yíng)養(yǎng)。

*通信作者：閆師杰（1971—），男（漢），教授，博士，主要從事食品質(zhì)量與安全、食品貯藏與保鮮；劉祥（1976—），男（漢），正高級(jí)工程師，博士，主要從事食品安全檢測(cè)與分析。