趙瑞，崔進，梅連瑞，許曉菁，金鑰，閆師杰，3，*，劉祥

（1.天津農(nóng)學院食品科學與生物工程學院，天津300384；2.天津市產(chǎn)品質量監(jiān)督檢測技術研究院，天津300308；3.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術工程中心，天津300384；4.天津市食品安全檢測技術研究院，天津300308）

超高效液相色譜-質譜測定牛乳中游離氨基酸

趙瑞1，崔進2，梅連瑞2，許曉菁2，金鑰2，閆師杰1，3，*，劉祥4，*

（1.天津農(nóng)學院食品科學與生物工程學院，天津300384；2.天津市產(chǎn)品質量監(jiān)督檢測技術研究院，天津300308；3.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術工程中心，天津300384；4.天津市食品安全檢測技術研究院，天津300308）

建立牛乳中未衍生游離氨基酸的超高效液相色譜串聯(lián)質譜的測定方法。樣品采用酸化乙腈沉淀蛋白，正己烷脫脂，氮吹至近干后初始流動相復溶，超聲溶解離心過膜后檢測。結果顯示：在14 min內所分析目標物得到較好的分離，濃度與峰面積的線性關系良好，相關系數(shù)在0.991 2～0.999 8之間，回收率在76%～124%，相對標準偏差1.0%～12.9%。

牛乳；未衍生游離氨基酸；超高效液相色譜串聯(lián)質譜；親水作用

Abstract：A method for determining of underivatized free amino acids in milk was developed with ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）.The protein of sample was precipitated with acid acetonitrile，the supematant was purified by n-hexane，then the purified solution was concentrated by nitrogen，dissolved with the initial mobile phase by ultrasonic assistance，centrifuged and filtered for ultra-high performance liquid chromatographic analysis.The results indicated that good separation of amino acids was obtained within 14 min.The linearity of the investigated compounds between concentrations and their peak areas within the test ranges was good，and the correlation coefficient was from 0.991 2 to 0.999 8.The average recoveries and relative standard deviations of 14 amino acids at three spiked levels were in the range of 76%-124%and 1.0%-12.9%respectively.

Key words：milk；underivatized free amino acids；ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）；hydrophilic interaction

鮮牛乳中含有一定量人體所必需的游離氨基酸，它可以提高人體免疫功能從而起到預防作用，谷氨酸和甘氨酸是其主要形式，其含量是一定的。但是近年來部分商家受利益的驅使，會在牛奶中添加非蛋白含氮化合物或者是單一的氨基酸[1]，以期提高牛奶中蛋白含氮量。因此，為解決牛乳中額外添加氨基酸的問題，對牛乳中游離氨基酸的定量檢測非常必要。

大多數(shù)氨基酸本身不具有紫外吸收和熒光檢測的發(fā)色基團，所以當使用氨基酸分析儀[2]傳統(tǒng)的液相色譜法[3-5]、薄層色譜法[6]及毛細管電泳法[7]等，首先需要對氨基酸進行衍生處理，其方法操作繁瑣、衍生試劑不穩(wěn)定、有副產(chǎn)物干擾及延長分析時間，給氨基酸的測定帶來了諸多的不便。隨著質譜的發(fā)展，有些學者研究了不需衍生的高效液相-蒸發(fā)光散射檢測[8]（High Performance Liquid Chromatography-Evaporative Light scattering Detector，HPLC-ELSD）及高效液相色譜質譜聯(lián)用[9]（High Performance Liquid Chromatography Mass Spectrometry，HPLC-MS）等，但是這些方法往往在流動相中添加了三氟乙酸、全氟酸七氟丁酸、等離子對試劑，這些試劑容易對色譜柱及儀器造成污染。鑒于此，本試驗應用親水作用色譜模式下的超高效液質質譜技術測定氨基酸，實現(xiàn)了不衍生、高分辨率、高靈敏、高速分析牛奶中的游離氨基酸。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

AB Triple Quad 6500型串聯(lián)四級桿質譜聯(lián)用儀：美國AB公司，配Agilent 1290型超高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；ML204/02型天平：Mettler-Toledo公司；PICOZ1型低溫高速離心機：美國Thermo公司；OA-SYS型氮吹濃縮儀：美國Organomation公司；IKA MS3 DIGITAL渦旋儀：上海研域儀器設備有限公司；Waters Symmetry 色譜柱（C18 4.6×150 mm，5 μm）：美國 Waters公司；Kinetex HILIC 100A HPLC Column（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）：美國菲羅門Phenomenex公司；ZIC-HILIC 柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm，100A）：德國Merck公司。

超純水（屈臣氏蒸餾水）：廣州屈臣氏食品飲料有限公司北京飲料分公司；乙腈（色譜純）：德國MERCK公司；甲酸（ACS純）、甲酸銨：美國Sigma公司。

氨基酸混標：丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）、亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Ile）、組氨酸（His）、精氨酸（Arg）、甲硫氨酸（Met）、絲氨酸（Ser）、苯丙氨酸（Phe）、蘇氨酸（Thr）、纈氨酸（Val）、酪氨酸（Tyr）、谷氨酸（Glu）、賴氨酸（Lys）、甘氨酸（Gly），濃度均為 2.5 μmol/mL，溶劑為0.1 mol/L鹽酸：美國Sigma-Aldrich公司。

標準溶液的配制：取0.1 mL氨基酸混標于10 mL棕色容量瓶中，以0.1 mol/L鹽酸溶解和定容，得到25 μmol/L的標準儲備液；再配制成2.5 μmol/L的混合標準中間液；用時根據(jù)需要，用初始流動相將中間液進行稀釋，稀釋成適當濃度作為標準工作液。

1.2 色譜條件

色譜柱：Kinetex HILIC 100A色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）。

條件：流動相：A相為10 mmol/L甲酸銨-水，B相為2 mmol/L甲酸銨-3%水-乙腈（均含有0.15%甲酸）；流速0.3 mL/min；進樣量2 μL；柱溫35℃。梯度洗脫見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 The program of gradient elution

1.3 質譜條件

三重四極桿串聯(lián)質譜多反應監(jiān)測（MRM）；電噴霧正離子（ESI+）模式掃描；電噴霧電壓（IS）：5 500 V；離子源溫度：550℃；霧化氣壓力（GS1）：60 psi；輔助氣壓力（GS2）：60 psi；氣簾氣壓力（CUR）：30 psi。經(jīng)優(yōu)化后的各類化合物的質譜參數(shù)如表2。

表2 氨基酸的主要質譜采集參數(shù)Table 2 Mass spectrometric and acquisition parameters of amino acids

1.4 樣品前處理

稱取1.0 g樣品（精確至0.000 1 g）于15 mL離心管中，用2%甲酸乙腈定容到10 mL，渦旋振蕩1 min，超聲提取10 min，4℃下9 500 r/min離心10 min。全部轉移上清液于離心管中，加5 mL正己烷，渦旋2 min，靜置分層后棄上層液體。下層溶液于30℃水浴氮吹至近干。添加初始流動相復溶，超聲1 min后9 500 r/min離心5 min，上清液經(jīng)0.22 μm有機微孔濾膜過濾后上機測定。

2 結果與討論

2.1 質譜與色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 質譜條件的優(yōu)化

氨基酸為極性化合物，故試驗選擇ESI離子源[10]。將濃度為0.25 μmol/L氨基酸標準溶液采用直接針泵進樣方式注入質譜儀中，在正離子模式下進行母離子質譜掃描，得到各個氨基酸豐度較高的[M+H]+準分子離子峰。以母離子為基礎進行二級質譜分析選擇出兩個子離子，最后對各自的碰撞能量、去簇電壓等參數(shù)進行優(yōu)化，使其離子豐度和方法的靈敏度達到最佳。正離子模式下測定的氨基酸質譜參數(shù)見表2。

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化

2.1.2.1 色譜柱的選擇

氨基酸是一類極性較大的小分子量化合物，在傳統(tǒng)的C18柱上幾乎無保留。本試驗嘗試選擇Waters Symmetry C18（5 μm，4.6×150 mm）進行分離檢測，發(fā)現(xiàn)部分生物胺的峰形較好且響應也較高，但是均集中在1min出峰，隨后調節(jié)流動相組成和改變梯度洗脫，保留時間也沒有出現(xiàn)明顯改善。W A Huub Waterval[11]和湯新星[12]均使用C18在流動相中添加全氟庚酸實現(xiàn)了氨基酸的未衍生檢測。但全氟庚酸屬于離子對試劑，雖然可以改善極性化合物在反相色譜柱中的分離效果，但這些試劑不易揮發(fā)且對檢測的離子抑制效應非常明顯，不適用液質聯(lián)用。

親水作用色譜（HILIC）于1990年由Andrew Alpert提出，是一種針對強極性化合物的新型液相色譜技術，其保留機制較為復雜，包括氫鍵作用、靜電作用和偶極作用等，常使用硅膠、氰基、氨基等填料[13]。根據(jù)氨基酸的特點，同時氨基酸中既有堿性氨基酸、中性氨基酸，又有酸性氨基酸，試驗首先選擇固定相為兩性離子甜菜堿的Merck ZIC-Hilic色譜柱對化合物進行測試。結果發(fā)現(xiàn)，氨基酸有較好的保留和分離效果，且峰形較好。但在進一步的加標試驗和實際樣品檢測過程中，發(fā)現(xiàn)該色譜柱的耐受性較差，隨著試驗樣品量的增加，色譜峰拖尾現(xiàn)象明顯，結果重復性下降。隨后嘗試采用耐用性相對較好的[14]Kinetex HILIC（2.6 μm，100×2.1 mm）色譜柱，試驗結果表明該色譜柱可以在小比例水相流動相的情況下很好地將目標物保留和分離。

2.1.2.2 流動相的選擇

采用流動相中均添加甲酸銨，不僅可以使待測物質容易質子化而提供足夠的帶電離子，而且整個分離系統(tǒng)維持在一個相對穩(wěn)定的酸性環(huán)境中，有利于增加目標物色譜峰形尖銳，提高靈敏度。為提高氨基酸的分離度，同時減少樣品的基質效應，結合色譜柱的分離特性，選擇在流動相中添加甲酸。試驗還考察了流動相中甲酸銨的濃度和pH值、梯度洗脫的設置等條件對分離效果的影響，最終確定了最佳的流動相條件，使得HILIC柱顯示出較好的分離效果，并且具有較好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，其色譜圖如圖1。

圖1 氨基酸混合標準溶液的典型MRM色譜圖Fig.1 Representative MRM chromatograms of amino acids mixed standard

2.2 樣品前處理方法的優(yōu)化

牛奶中含有大量的蛋白質，若不除去將嚴重干擾目標物的測定，參考文獻報道其方法主要[15]分為兩種思路：蛋白質沉淀法和固相萃取法。固相萃取法的凈化效率較高，但是對目標物氨基酸損失較大，并且氨基酸有是一大類包含至少一個羧基、一個氨基官能團的極性化合物，很難靠單純的陰陽離子固相萃取法同步實現(xiàn)十多種物質的凈化，不適用于大量樣品的檢測。沉淀蛋白的方法主要有沉淀劑沉淀、酸沉淀、有機溶劑沉淀等。氨基酸在純有機溶劑中的溶解度較水溶性溶液中的溶解度小，液態(tài)奶中本身為水溶液，同時考慮到ESI+檢測模式，本試驗采取酸化乙腈方式進行沉淀蛋白。參考文獻[16]使用三氯乙酸，但發(fā)現(xiàn)三氯乙酸的沉淀效果較差，離心后上層液仍較為渾濁，試驗選擇甲酸。為兼顧回收率和降低基質效應兩個方面，試驗比較了0.5%、1%、2%的甲酸比例，結果表明當使用0.5%甲酸時，只有部分氨基酸有信號響應。甲酸比例為1%、2%時所有氨基酸均有信號響應，但2%甲酸處理后的信號強度較強，同時很大程度地降低了基質效應，故選擇2%甲酸。因牛奶中油脂含量也相對較多，導致氮吹干加流動相復溶后溶液渾濁，預先用正己烷萃取去除脂質可有效消除這種現(xiàn)象。

2.3 方法學驗證

將15種氨基酸混合標準中間液稀釋成0.08、0.25、0.5、0.8、1.0、1.5 μmol/L 6 個不同濃度，按照優(yōu)化的方法測定后以氨基酸峰面積（y）對其濃度（x）進行線性回歸分析，得到15種氨基酸的標準曲線，結果見表3。

表3 氨基酸回歸方程、線性系數(shù)、定量下限、回收率及相對標準偏差Table 3 Limits of regression equations，correlation coefficients，quantitation（LOQs），recoveries and RSDs of amino acids（n=6）

如表3所示，15種氨基酸在濃度為0.08 μmol/L～1.5μmol/L范圍內線性關系良好，在0.9912～0.9998之間；分別向樣品中添加低中高3個水平（2、10、20 μmol/L）的氨基酸，重復6次，計算回收率和重復性；以色譜峰面積10倍信噪比（S/N）計算氨基酸的定量下限。

2.4 方法應用

按照本試驗中所優(yōu)化的方法，對新鮮牛奶、巴士殺菌奶和超高溫奶中的游離氨基酸進行了檢測，方法重現(xiàn)性、回收率較好。

3 結論

建立牛乳中游離氨基酸的超高效液相串聯(lián)質譜測定方法。樣品前處理使用蛋白質沉淀法，親水液相色譜質譜檢測，無需對氨基酸進行衍生處理。該方法的目標氨基酸的相關系數(shù)大于0.99，定量下限范圍為0.008 μmol/L～0.08 μmol/L，平均回收率為 76%～124%，相對標準偏差1.0%～12.9%。本方法前處理技術簡單、試驗成本低、分析效率高，檢出限能夠滿足牛乳中游離氨基酸的要求，是快速、全面、準確測定牛乳中游離氨基酸的可靠方法，為判定牛乳及其制品的質量及營養(yǎng)價值提供了科學依據(jù)。

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Determination of Free Amino Acids in Milk by Ultra-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHAO Rui1，CUI Jin2，MEI Lian-rui2，XU Xiao-jing2，JIN Yue2，YAN Shi-jie1，3，*，LIU Xiang4，*
（1.College of Food Science and Biological Engineering，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China；2.Tianjin Product Quality Supervision and Testing Technology Research Institute，Tianjin 300308，China；3.Tianjin Engineering and Technology Research Center of Agricultural Products Processing，Tianjin 300384，China；4.Tianjin Food Safety Testing Technology Research Institute，Tianjin 300308，China）

2017-02-06

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.034

趙瑞（1989—），女（漢），碩士研究生，主要從事動物源性食品安全與營養(yǎng)。

*通信作者：閆師杰（1971—），男（漢），教授，博士，主要從事食品質量與安全、食品貯藏與保鮮；劉祥（1976—），男（漢），正高級工程師，博士，主要從事食品安全檢測與分析。