林能鋒 鄭晨艷 王侯杰 曾 紅＊

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所 福州 350003；2.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 福州 350108）

中草藥浸出液體外驅(qū)殺兩種水產(chǎn)致病性盾纖蟲(chóng)的研究

林能鋒1鄭晨艷2王侯杰2曾 紅2＊

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所 福州 350003；2.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 福州 350108）

水滴偽康纖蟲(chóng)和海洋尾絲蟲(chóng)是嚴(yán)重危害海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的兼性寄生纖毛蟲(chóng)，中草藥在水產(chǎn)寄生蟲(chóng)病的防治中有著廣泛的應(yīng)用，具有無(wú)藥物殘留，無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用10種常見(jiàn)中草藥浸出液對(duì)兩種盾纖蟲(chóng)的體外驅(qū)殺效果的研究表明，水滴偽康纖蟲(chóng)對(duì)首烏藤、大黃和辣椒的敏感度較高，在藥物濃度為0.5 g/L時(shí)，驅(qū)蟲(chóng)率分別為0.85、0.59和0.59，與空白對(duì)照組對(duì)比差異極顯著（P＜0.01）；而海洋尾絲蟲(chóng)則對(duì)石榴皮、貫眾、首烏藤和辣椒表現(xiàn)出了較高的敏感度，在藥物濃度為0.5 g/L時(shí)，驅(qū)蟲(chóng)率分別為0.55、0.51、0.43和0.37，與空白對(duì)照組相比差異極顯著（P＜0.01）。馬鞭草、檳榔、虎杖、連翹、地榆等幾味藥物對(duì)兩種盾纖蟲(chóng)的驅(qū)殺效果則不明顯。試驗(yàn)結(jié)果提示，首烏藤和辣椒兩種中草藥浸出液在體外均表現(xiàn)出了對(duì)兩種盾纖蟲(chóng)較好的驅(qū)蟲(chóng)效果，同時(shí)不同藥物的驅(qū)殺效果差異也表明兩種盾纖蟲(chóng)對(duì)藥物的反應(yīng)機(jī)制可能存在著一定的差異。

水滴偽康纖蟲(chóng) 海洋尾絲蟲(chóng) 中草藥浸出液 驅(qū)蟲(chóng)率

AbstractPseudocohnilembus persalinus and Uronema marinum could cause severe mortalities in cultured marine fishes.They had been recognized as facultative parasites.Chinese medicinal herb has been widely used in the prevention of aquatic parasitic disease in China.The present study screened 10 candidate chinese herbal medicines for repellent effect to these pathogens in vitro.Leachate of caulis polygoni multiflori,rhubarb and pepper(concentration 0.5 g/L,within a 30 min assay period)had significant repellent effect to P.persalinus compared with the blank control group(P<0.01).The anthelmintic rates were 0.85,0.59 and 0.59,respectively.U.marinum shows high sensitivity to pomegranate peel,Cyrtomium fortunei,caulis polygoni multiflori and pepper compared with the blank control group (P<0.01),the anthelmintic rates were 0.55,0.51,0.43 and 0.37,respectively.But some herbs such as verbena,areca,polygonum,forsythia,Radix sanguisorbae showed less effectiveness to these two kinds of scuticociliates in vitro.Leach liquor of caulis polygoni multiflori and pepper had direct influence to the scuticociliates in vitro,while other candidate herbs also had repellent effect to the parasites and had other indirect effect to the fish.In view of these findings,we discuss the potential utility of chinese medicinal herbs as a strategy for the control of scuticociliatosis in marine fish farms.

Key wordsPseudocohnilembus persalinus Uronema marinum Chinese medicinal herb Anthelmintic rate

規(guī)?；W(wǎng)箱和工廠化養(yǎng)殖方式已逐漸成為我國(guó)海洋魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖的主要模式，但由于養(yǎng)殖技術(shù)和管理水平還不夠成熟，也帶來(lái)很多病害問(wèn)題。其中纖毛類(lèi)寄生蟲(chóng)是造成海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)損失的一類(lèi)重要寄生性病害生物。在牙鲆、大菱鲆、紅鰭東方鲀等海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)中，盾纖類(lèi)纖毛蟲(chóng)病帶來(lái)的危害越來(lái)越嚴(yán)重[1-2]。

水滴偽康纖蟲(chóng) （Pseudocohnilemus persalinus）、海洋尾絲蟲(chóng)（Uronema marinum）同屬盾纖目（Scuticociliatida）?？勺杂缮钣诟鞣N養(yǎng)殖和育苗水體中，一旦入侵魚(yú)體就會(huì)快速繁殖，刺激魚(yú)類(lèi)表皮產(chǎn)生黏液，受感染魚(yú)體表顏色變暗，攝食量減少，鰓蓋內(nèi)側(cè)發(fā)紅、潰爛，皮膚和皮下肌肉出現(xiàn)壞死性潰瘍，腸道松弛、擴(kuò)張，病情嚴(yán)重的魚(yú)肝臟還有出血現(xiàn)象[3-5]。盾纖毛蟲(chóng)喜好聚集在細(xì)菌菌群豐富的部位，因此，常常表現(xiàn)出細(xì)菌感染并發(fā)的癥狀[3]。魚(yú)群患病后，死亡率高，危害嚴(yán)重。有報(bào)道稱(chēng)，嚴(yán)重時(shí)，網(wǎng)箱養(yǎng)殖紅鰭東方鲀暴發(fā)海洋尾絲蟲(chóng)病時(shí)，死亡率可高達(dá)60%～80%[5]。

在水產(chǎn)寄生性纖毛蟲(chóng)病防治中，化學(xué)合成藥物和中草藥的使用是最常見(jiàn)的手段?；瘜W(xué)合成藥物作用直接、快速，Iglesias R等[6]篩選了52種抗原蟲(chóng)類(lèi)的化學(xué)藥物，發(fā)現(xiàn)有13種對(duì)離體的盾纖蟲(chóng)Philasterides dicentrarchi有效，但有一些化學(xué)合成藥物在水產(chǎn)中禁止使用，且可能存在藥物殘留和藥物毒害等問(wèn)題卻未加以探討。國(guó)內(nèi)在生產(chǎn)上對(duì)盾纖類(lèi)纖毛蟲(chóng)病主要使用如過(guò)氧化氫、福爾馬林等外用消毒劑進(jìn)行藥浴處理[7]。中草藥具有毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥、無(wú)藥物殘留超標(biāo)、成本低等優(yōu)勢(shì)，在水產(chǎn)病害防治中得到廣泛應(yīng)用。一些研究者發(fā)現(xiàn)，辣椒、生姜、檳榔、苦楝等中草藥對(duì)防治幾種常見(jiàn)的水產(chǎn)病害纖毛蟲(chóng)等有著較好的殺滅效果[8-11]。

本文用10種常見(jiàn)的中草藥浸出液對(duì)水滴偽康纖蟲(chóng)和海洋尾絲蟲(chóng)的體外驅(qū)蟲(chóng)效果進(jìn)行了探討，為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者在臨床防治盾纖蟲(chóng)病提供參考。

1 材料與方法

1.1 水滴偽康纖蟲(chóng)和海洋尾絲蟲(chóng) 兩種盾纖蟲(chóng)由中國(guó)海洋大學(xué)原生動(dòng)物試驗(yàn)室惠贈(zèng)，利用蝦肉發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行保種和傳代培養(yǎng)。進(jìn)行趨化性測(cè)試的蟲(chóng)體培養(yǎng)密度大于5 000 ind/mL。

1.2 中草藥浸出液樣品制備 馬鞭草、地榆、連翹、馬齒莧、石榴皮、貫眾、大黃、檳榔、虎杖、首烏藤、辣椒等中草藥購(gòu)自福州回春藥店。

中草藥測(cè)試液：依據(jù)閆茂倉(cāng)（2010）方法[12]，將藥材稱(chēng)2 g（藥草體積較大的先用研缽研碎）在純水中浸泡2 h，然后進(jìn)行煮沸，沸騰持續(xù)10 min后用四層紗布把藥草渣濾出，藥液保存?zhèn)溆?；在藥草渣中加入純水再進(jìn)行與上一步煮沸相同過(guò)程，混合兩次藥液進(jìn)行濃縮，濃縮至40 mL原液，使生藥含量為50 g/L，4℃保存?zhèn)溆?。使用時(shí)，取中藥原液100 μL用經(jīng)過(guò)濾煮沸海水稀釋至5 mL。

1.3 驅(qū)蟲(chóng)率測(cè)試方法 將10 μL蟲(chóng)體培養(yǎng)液和10 μL中草藥液混合后滴在有計(jì)數(shù)方格的干凈載玻片一端，載玻片另一端滴加20 μL海水液滴，液滴間距2 cm。用干凈的牙簽從海水液滴端向加入蟲(chóng)體的液滴端輕輕劃出一條細(xì)的通道，使兩端液滴連通，趨化反應(yīng)進(jìn)行30 min，重復(fù)試驗(yàn)4次。對(duì)照組以海水替換中草藥測(cè)試液。驅(qū)蟲(chóng)率（Anthelmintic rate）計(jì)算方法如下：A.R.=游向另一端的蟲(chóng)體數(shù)/蟲(chóng)體總數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著性分析 （成對(duì)雙樣本T檢驗(yàn)）處理，分別用 P＞0.05、0.01＜P＜0.05、P＜0.01 來(lái)表示差異不顯著、差異顯著和差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 11種中草藥浸出液對(duì)水滴偽康纖蟲(chóng)的驅(qū)蟲(chóng)效果 測(cè)試結(jié)果表明（見(jiàn)圖1），首烏藤、大黃、辣椒的浸出液（0.5 g/L）對(duì)水滴偽康纖蟲(chóng)具有明顯的驅(qū)蟲(chóng)效果，其驅(qū)蟲(chóng)率分別為0.85、0.59和0.59，且與以海水測(cè)試液的對(duì)照組比較，驅(qū)蟲(chóng)效果差異極顯著 （P＜0.01）。而馬鞭草、地榆、檳榔等對(duì)水滴偽康纖蟲(chóng)的驅(qū)蟲(chóng)效果并不明顯。

圖1 11種中草藥對(duì)水滴偽康纖蟲(chóng)的驅(qū)蟲(chóng)效果

2.2 10種中草藥浸出液對(duì)海洋尾絲蟲(chóng)的驅(qū)蟲(chóng)效果試驗(yàn)結(jié)果表明（見(jiàn)圖2），海洋尾絲蟲(chóng)對(duì)所測(cè)試的中草藥浸出液反應(yīng)的敏感性有較大的差異，在10種濃度為0.5 g/L的中草藥測(cè)試液中，石榴皮、貫眾、首烏藤、辣椒測(cè)試液對(duì)海洋尾絲蟲(chóng)有較好的驅(qū)蟲(chóng)效果，而海洋尾絲蟲(chóng)對(duì)馬鞭草、大黃、檳榔等測(cè)試液的敏感性較低。在顯著性分析中，石榴皮、貫眾、辣椒浸出液組的驅(qū)蟲(chóng)效果極顯著（P＜0.01）高于空白對(duì)照組，連翹、馬齒莧、虎杖、首烏藤浸出液組表現(xiàn)為顯著（0.01＜P＜0.05）。

圖2 10種中藥材料對(duì)海洋尾絲蟲(chóng)的驅(qū)蟲(chóng)率

3 討 論

中草藥具有價(jià)格便宜、來(lái)源廣泛、副作用相較化學(xué)試劑小、不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的病害預(yù)防治療中，宿斌等[13]應(yīng)用復(fù)方中草藥蒿芩驅(qū)蟲(chóng)散（由檳榔、青蒿、川楝子等組成）拌料口服防治大菱鲆盾纖蟲(chóng)病取得較好的效果，但對(duì)中草藥體外驅(qū)殺盾纖蟲(chóng)效果的研究并未見(jiàn)報(bào)道。

本研究參考有關(guān)中草藥防治魚(yú)類(lèi)病害及中草藥浸出液制備方法的資料，選擇常見(jiàn)、易得的中草藥物設(shè)計(jì)實(shí)施本試驗(yàn)。

通過(guò)本次試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)大黃、首烏藤、辣椒等對(duì)水滴偽康纖蟲(chóng)的驅(qū)蟲(chóng)效果極顯著高于海水對(duì)照組。而海洋尾絲蟲(chóng)則對(duì)石榴皮、貫眾、首烏藤、辣椒等浸出液表現(xiàn)極為敏感。鄒峰等[14]對(duì)刺激隱核蟲(chóng)幼蟲(chóng)的趨化性研究中發(fā)現(xiàn)，刺激隱核蟲(chóng)幼蟲(chóng)對(duì)五倍子、貫眾、檳榔、大黃、虎杖、苦楝等6種中草藥的趨化率極顯著（P＜0.01）低于海水對(duì)照組。國(guó)內(nèi)研究者在用中草藥浸出液殺滅刺激隱核蟲(chóng)的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，辣椒和檳榔的殺蟲(chóng)效果最好，同時(shí)對(duì)其包囊也有一定的殺滅效果[15-16]。比較發(fā)現(xiàn)，不同種類(lèi)的纖毛蟲(chóng)對(duì)于藥物的敏感性有較大的區(qū)別，但辣椒則顯示出對(duì)幾種病害纖毛蟲(chóng)都有較好的驅(qū)殺效果，可能與辣椒中含有能夠?qū)οx(chóng)體產(chǎn)生強(qiáng)烈刺激的辣椒素這種驅(qū)蟲(chóng)有效成分有關(guān)，其對(duì)纖毛蟲(chóng)的驅(qū)殺機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

在對(duì)兩種盾纖類(lèi)纖毛蟲(chóng)的驅(qū)殺試驗(yàn)結(jié)果中，一些藥物如首烏藤、連翹都富含黃酮類(lèi)的抑菌成分，虎杖富含蒽醌類(lèi)抑菌成分，石榴皮含有鞣質(zhì)、生物堿等驅(qū)蟲(chóng)、抑菌的有效成分，上述這些中草藥也在本試驗(yàn)中得到較顯著的驅(qū)蟲(chóng)效果。而魚(yú)類(lèi)感染盾纖蟲(chóng)病例大多伴隨著細(xì)菌感染，因此，將上述中草藥與其它藥物進(jìn)行配伍，對(duì)抑制繼發(fā)性細(xì)菌感染、防治魚(yú)類(lèi)盾纖蟲(chóng)病有可能獲得更好的效果。

[1]杜佳垠.大菱鲆寄生蟲(chóng)性疾病[J].河北漁業(yè),2005(4):33-42.

[2]崔曼青,袁春營(yíng),李春嶺,等.主要海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)白點(diǎn)病和盾纖毛蟲(chóng)病防治技術(shù)[J].水利漁業(yè),2007,27(6):85-87.

[3]麻麗丹,王殿夫,于曉婕,等.養(yǎng)殖河豚魚(yú)的海洋尾絲蟲(chóng)病病例[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2012,48(3):69-70.

[4]宮春光,于清海,陳福杰,等.工廠化養(yǎng)殖海水魚(yú)盾纖毛蟲(chóng)病的防治[J].科學(xué)養(yǎng)魚(yú),2009(10):48-49.

[5]王會(huì)芳.紅鰭東方鲀海洋尾絲蟲(chóng)病研究[J].中國(guó)水產(chǎn),2012(3):54-56.

[6]Iglesias R,Paramá A,Alvarez M F,et al.Antiprotozoals effective in vitro against the scuticociliate fish pathogen Philasterides dicentrarchi[J].Dis Aquat Org,2002,49:191-197.

[7]宮春光,李鳳晨.牙鲆盾纖毛蟲(chóng)病的藥物防治試驗(yàn)[J].水產(chǎn)科學(xué),2007,26（9）:509-511.

[8]姚志剛.大菱鲆纖毛蟲(chóng)病發(fā)病機(jī)理及中藥治療技術(shù)研究[J].河北漁業(yè),2008(8):34-36.

[9]石宏武,汪彥愔,吳靜.6種中草藥對(duì)鯉斜管蟲(chóng)和指狀擬舟蟲(chóng)的體外殺滅試驗(yàn)[J].齊魯漁業(yè),2008,25(10):4-7.

[10]牟洪生,李小梅,齊振雄,等.中草藥在寄生性魚(yú)病防治中的應(yīng)用[J].水產(chǎn)科學(xué),2008,27（11）:606-608.

[11]林啟存,許寶青,蔡麗娟.生姜、辣椒治療小瓜蟲(chóng)病的效用試驗(yàn)[J].水產(chǎn)科學(xué),2005,26（2）:40-41.

[12]閆茂倉(cāng),陳少波,單樂(lè)洲,等.22味中草藥對(duì)創(chuàng)傷弧菌和燦爛弧菌體外抑菌作用篩選[J].水生態(tài)學(xué)雜志,2010,3（2）:95-97.

[13]宿斌,李恒偉,陳炳見(jiàn),等.復(fù)方中草藥蒿芩驅(qū)蟲(chóng)散對(duì)大菱鲆盾纖毛蟲(chóng)病防治效果研究[J].齊魯漁業(yè),2015,32(8):28-29.

[14]鄒峰,蘇永全,覃映雪,等.海水魚(yú)類(lèi)寄生蟲(chóng)刺激隱核蟲(chóng)（Cryptocaryon irritans）趨化性研究 [J].海洋與湖沼,2013,44（4）:1003-1007.

[15]組超,張其中,羅芬.20種中草藥殺滅離體小瓜蟲(chóng)的藥效研究[J].淡水漁業(yè),2010,40(1):55-60．

[16]馬寧,黎銘,李昊,等.中草藥浸出液體外殺滅刺激隱核蟲(chóng)的效果[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2015,27(11):95-98.

Repellent effect of chinese herbal leachate to two species of scuticociliate in vitro

Lin Nengfeng1Zheng Chenyan2Wang Houjie2Zeng Hong2*
(1.Institute of Biotechnology,Fujian Academy of Agriculture Science,Fuzhou 350003;2.College of Life Science,Fujian Normal University,Fuzhou 350108)

A

1003-4331（2017）05-0013-03

國(guó)家青年自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31201698)、福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2013J01120)、福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目-省屬公益類(lèi)科研院所基本科研專(zhuān)項(xiàng)（2015R1019-11）資助。

林能鋒（1972-），男，博士，副研究員。主要從事海洋動(dòng)物遺傳育種與水產(chǎn)動(dòng)物病害防治研究，E-mail:lnfeng@hotmail.com。

＊通信作者：曾紅（1972-），女，博士，副教授。主要從事動(dòng)物細(xì)胞分子生物學(xué)研究，E-mail:zhbio@fjnu.edu.cn。