孟繼明，唐紅娜，劉曉明，王朝陽,2，任學(xué)群,2,3

1. 河南大學(xué)淮河醫(yī)院 普外科，河南 開封 475000； 2. 河南大學(xué) 循證醫(yī)學(xué)中心，河南 開封 475000； 3. 河南大學(xué)淮河醫(yī)院 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，河南 開封 475000

γ分泌酶抑制劑阻斷Notch信號通路對肝癌細(xì)胞增殖的影響

孟繼明1，唐紅娜1，劉曉明1，王朝陽1,2，任學(xué)群1,2,3

1. 河南大學(xué)淮河醫(yī)院 普外科，河南 開封 475000； 2. 河南大學(xué) 循證醫(yī)學(xué)中心，河南 開封 475000； 3. 河南大學(xué)淮河醫(yī)院 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，河南 開封 475000

〔目的〕 探索γ分泌酶抑制劑 MW167阻斷Notch信號通路對肝癌細(xì)胞增殖的影響?！卜椒ā?通過Western blotting 和RT-PCR方法檢測Notch受體各亞型的表達(dá)。用不同濃度(5、10、20μmol/L)MW167處理肝癌細(xì)胞，48h后用Western blotting法檢測Notch各蛋白的表達(dá)，采用RT-PCR法檢測Notch信號通路下游基因HES1 mRNA表達(dá)，MTT法測定細(xì)胞增殖?！步Y(jié)果〕 HepG2細(xì)胞中可檢測到Notch1～4 蛋白和mRNA的表達(dá)。不管是與培養(yǎng)基對照還是DMSO對照相比，不同濃度MW167對Notch1～4蛋白的表達(dá)沒有顯著影響。與相應(yīng)濃度的對照組相比，MW167處理組HES1 mRNA表達(dá)下降(P<0.05)。隨著MW167處理濃度升高，HES1 mRNA表達(dá)抑制率逐漸升高(P<0.05)。MTT法檢測結(jié)果顯示，MW167處理的細(xì)胞，其吸光度高于對照組(P<0.05)，且隨著MW167濃度的升高，細(xì)胞增殖率相應(yīng)升高?！步Y(jié)論〕HepG2細(xì)胞中可檢測到Notch1～4蛋白和mRNA的表達(dá)，MW167處理可降低HES1 mRNA表達(dá)，MW167處理可促進細(xì)胞的增殖。

γ分泌酶抑制劑；MW167；Notch信號通路；肝細(xì)胞肝癌

Abstract: 〔Objective〕To explore the influence of blocking Notch signaling pathway by γ-secretase inhibitor on proliferation of HepG2 cells. 〔Methods〕The expression of Notch 1～4 was determined with Western blotting and RT-PCR methods. HepG2 cells were treated by 5, 10 and 20μmol/LMW167. 48h after treatment, protein expression of Notch 1～4 was determined. HES1 mRNA expression was measured by RT-PCR technology. Cell proliferation was determined with MTT method.〔Results〕The genetic and protein expressions of Notch 1～4 were observed in HepG2 cells. MW167 showed no influences on the expression of these proteins. Compared with corresponding control, HES1 mRNA expression was decreased (P<0.05).〔Conclusion〕The inhibition rates were increased as the concentration increased. MW167 treatment could improve the cell proliferation of HepG2 cells.

Keywords: γ-secretase inhibitor; MW167; Notch pathway; hepatocellular carcinoma (HCC)

肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，是嚴(yán)重威脅人類生命的重大疾病，是世界癌癥相關(guān)死亡的第二大病因。目前，對肝癌相關(guān)信號傳導(dǎo)通路的研究尚不明了，肝癌信號通路的深入研究對于肝癌的早期預(yù)防和治療具有關(guān)鍵作用。Notch信號通路，是進化中高度保守的信號傳導(dǎo)通路，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖凋亡和腫瘤形成等過程中發(fā)揮重要作用[1-2]。近年來研究[3-4]顯示，Notch信號通路與肝癌的發(fā)生有密切關(guān)系。本文應(yīng)用γ分泌酶抑制劑MW167阻斷Notch信號通路，進而研究對肝癌細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與藥物

HepG2細(xì)胞株，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物所。γ分泌酶抑制劑MW167(Merck公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司)；RT-PCR試劑盒(TaKaRa公司)；引物(上海生工生物工程有限公司合成)；TRIzol(Invitrogen公司)；Notch1～4單克隆抗體(Cell signaling technology公司)；GAPDH單克隆抗體(上?？党缮锕こ坦?；HRP標(biāo)記的羊抗大鼠二抗、羊抗兔二抗及羊抗小鼠二抗(上海威奧生物科技公司)；細(xì)胞裂解液(碧云天生物公司)；PVDF膜和ECL發(fā)光試劑盒(碧云天生物公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將細(xì)胞密度為1×105/mL的HepG2細(xì)胞接種到含有體積分?jǐn)?shù)為10%FBS的高糖型DMEM培養(yǎng)基中(5 mL)，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、完全飽和濕度條件下培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況。取對數(shù)生長期細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

1.3 Western blotting檢測Notch各受體蛋白表達(dá)

收集HepG2細(xì)胞，提取總蛋白，進行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，分別接Notch1～4單克隆一抗進行孵育、洗膜，接相應(yīng)二抗進行孵育。實驗中，一抗按1∶1 000比例稀釋，二抗按1∶2 000比例稀釋。加ECL發(fā)光，凝膠成像儀(Bio-Rad)拍照。

1.4 RT-PCR檢測Notch1～4的表達(dá)

取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞約1×106個，提取總RNA，分光光度計檢測基因濃度與純度。引物序列見表1。反轉(zhuǎn)錄條件：30 ℃，10 min；42 ℃，30 min；99 ℃，5 min。RT-PCR操作按說明書進行。Notch1、Notch3的退火溫度設(shè)定為60 ℃，Notch2退火溫度設(shè)定為56 ℃，Notch4退火溫度設(shè)定為58 ℃。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂糖凝膠電泳對產(chǎn)物進行檢驗。凝膠成像系統(tǒng)對結(jié)果進行分析。

1.5 Western blotting 檢測MW167對Notch1～4蛋白表達(dá)的影響

取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞接種6孔板，每個孔內(nèi)15×104個。70%的細(xì)胞融合后，用無血清培養(yǎng)基，饑餓培養(yǎng)24 h，加含不同濃度MW167(5、10、20μmol/L)的無血清培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，二甲基亞砜(DMSO)處理設(shè)定為對照組。48 h后提取蛋白，進行SDS-PAGE凝膠電泳，操作同1.3。Quantity-One軟件分析條帶吸光度。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.6 RT-PCR檢測MW167對Notch下游基因HES1表達(dá)的影響

取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞接種6孔板，每個孔內(nèi)15×104個。70%的細(xì)胞融合后，用無血清培養(yǎng)基，饑餓培養(yǎng)24 h，加含不同濃度MW167(5、10、20 μmol/L)的無血清培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。48 h后提取總RNA，然后進行RT-PCR操作。HES1引物序列(表1)：5’-CCCTCCTCCTAAACTCCC-3’(上游引物)和5’-AATACAAAGGCGCAATCC-3’(下游引物)。擴增條件為94 ℃，30 s；58 ℃，30 s；72 ℃，1 min。28個循環(huán)。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂糖凝膠電泳對產(chǎn)物進行檢測，凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。實驗重復(fù)3次，取平均值進行分析。

1.7 MTT測定細(xì)胞增殖

取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，細(xì)胞密度調(diào)整為1×104個/mL，接種于96孔板。每孔中加入200 μL細(xì)胞懸液。細(xì)胞貼壁后，換無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h，加含不同濃度MW167(5、10、20 μmol/L)的無血清培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。每個濃度設(shè)對照組(DMSO處理)，空白調(diào)零組(只加培養(yǎng)基)，每組設(shè)3個復(fù)孔。在MW167處理培養(yǎng)48 h后，每孔分別加20 μL MTT溶液(5g/L)，繼續(xù)孵育4 h，每孔加入150 μL DMSO，震蕩溶解甲瓚后，設(shè)置酶標(biāo)儀波長為490 nm，測定吸光度。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。t檢驗進行各組間均值比較，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 Notch受體蛋白各亞型在HepG2細(xì)胞的表達(dá)

Western blotting 實驗顯示，HepG2細(xì)胞中可檢測到Notch受體蛋白各亞型的表達(dá),見圖1。RT-PCR實驗證明，HepG2細(xì)胞中可檢測到Notch1～4 mRNA的表達(dá)，見圖2。

表1 引物序列

圖1 HepG2細(xì)胞中Notch1～4蛋白的表達(dá)

1.Marker;2.GAPDH;3.Notch1;4.Noth2;5.Notch3;6.Notch4圖2 RT-PCR法測定HepG2細(xì)胞Notch1～4 mRNA的表達(dá)量

2.2 γ分泌酶抑制劑MW167對Notch1～4 表達(dá)的影響

從圖3可看出，不管是與培養(yǎng)基還是DMSO對照相比，不同濃度MW167對Notch1～4蛋白的表達(dá)沒有顯著影響。

2.3 MW167對Notch下游基因HES1表達(dá)的影響

MW167處理HepG2細(xì)胞后，RT-PCR法測定HES1 mRNA 的表達(dá)，與相應(yīng)濃度的對照組相比，MW167處理組HES1 mRNA表達(dá)下降(P<0.05)。隨著MW167處理濃度升高，HES1 mRNA表達(dá)抑制率逐漸升高(P<0.05)。見圖4。

1.培養(yǎng)基對照；2.DMSO對照；3、4、5分別為5、10、20 μmol/L MW167加藥組圖3 不同濃度MW167作用下HepG2細(xì)胞中Notch1～4蛋白的表達(dá)

1、3、5分別為5、10、20 μmol/L M167處理；2、4、6分別為相應(yīng)處理濃度的對照組圖4 不同濃度MW167對Notch下游基因HES1表達(dá)的影響

2.4 MW167對HepG2細(xì)胞增殖的影響

MTT法檢測結(jié)果顯示，MW167處理的細(xì)胞，其吸光度高于對照組(P<0.05)，且隨著MW167濃度的升高，細(xì)胞增殖率相應(yīng)升高,見表2。

3 討論

自1917年Morgan發(fā)現(xiàn)Notch基因以來，對Notch功能與結(jié)構(gòu)的研究不斷深入。從組織自我更新，胚胎發(fā)育到腫瘤的發(fā)生，Notch都發(fā)揮重要作用。在對腫瘤的研究[5]中發(fā)現(xiàn)，血液系統(tǒng)腫瘤及大部分器官的實體腫瘤，Notch基因的作用得到了認(rèn)同。

表2 不同濃度MW167對HepG2細(xì)胞增殖的影響

注：*表示與對照組相比，存在顯著差異(P<0.05)；#表示與5μmol/L相比，存在顯著差異(P<0.05)。

Notch信號通路，通過相鄰細(xì)胞間的相互作用，對細(xì)胞分化潛能可進行精確調(diào)控。相鄰細(xì)胞通過Notch受體與配體的結(jié)合，傳遞Notch信號，從而擴大細(xì)胞間分子差異，對細(xì)胞命運起決定作用，最終影響器官的形成和形態(tài)發(fā)生。Notch信號，是相鄰細(xì)胞之間的通訊，對細(xì)胞發(fā)育進行調(diào)控的重要通路。多種惡性腫瘤中，都可發(fā)現(xiàn)Notch信號通路調(diào)節(jié)異常。通過小RNA或γ分泌酶抑制劑技術(shù)阻斷Notch1的活化，可抑制腫瘤細(xì)胞的生長。多項研究[6-8]表明，在非小細(xì)胞肺癌組織中存在Notch1蛋白高表達(dá)，并認(rèn)為Notch1的高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生及預(yù)后密切相關(guān)。

Notch信號通路可作用于肝內(nèi)外膽管形態(tài)發(fā)育、肝內(nèi)血管生成和肝細(xì)胞發(fā)育、再生等過程，同時可促進肝癌的發(fā)生和演變[9]。Notch1表達(dá)量在肝癌組織中明顯高于正常和癌旁組織，且其與腫瘤的靜脈侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分化密切相關(guān)。同時，研究[10-11]顯示，肝癌組織中Notch 3 和Notch 4表達(dá)量上調(diào)，而肝炎組織和正常肝組織中未檢測到其表達(dá)。本實驗通過γ分泌酶抑制劑MW167處理正常培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞，結(jié)果顯示，MW167可部分阻斷Notch信號通路，并可促進HepG2細(xì)胞的增殖。由此可知，Notch在肝癌中發(fā)揮抑癌作用。這與先前研究結(jié)果一致。還有專家研究[12]表明, Notch信號在體外和體內(nèi)均能抑制腫瘤的生長，并且可能與肝癌細(xì)胞凋亡和周期停滯相關(guān)。

綜上所述，本實驗結(jié)果表明，HepG2細(xì)胞中可檢測到Notch1～4蛋白和mRNA的表達(dá)，MW167處理可降低HES1 mRNA表達(dá)，MW167處理可促進細(xì)胞的增殖。

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[責(zé)任編輯時紅]

TheinfluenceofblockingNotchsignalingpathwaybyγ-secretaseinhibitoronproliferationofHepG2cells

MENG Jiming1, TANG Hongna1, LIU Xiaoming1, WANG Chaoyang1,2, REN Xuequn

1. Department of Surgery, Huaihe Hospital of Henan University, Henan Kaifeng 475000, China; 2. Center for Evidence-Based Medicine, Henan University, Henan Kaifeng 475000, China; 3. Center for Translational Medicine, Huaihe Hospital of Henan University, Henan Kaifeng 475000, China.

R73-3

A

1672-7606(2017)03-0187-04

2016-11-17

孟繼明(1971- )，男，河南睢縣人，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：普外科疾病的診斷與治療。