金福源 朱國良（江蘇省蘇州市吳江區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所盛澤分所 215200）

姚小兵 陳永中 李明觀 徐國東（江蘇省蘇州市吳江區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所黎里分所 215200）

夏曉潮（廣東省茂名市林業(yè)有害生物防治檢疫管理辦公室 525000）

雞源大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性分析

金福源 朱國良（江蘇省蘇州市吳江區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所盛澤分所 215200）

姚小兵 陳永中 李明觀 徐國東（江蘇省蘇州市吳江區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所黎里分所 215200）

夏曉潮（廣東省茂名市林業(yè)有害生物防治檢疫管理辦公室 525000）

雞大腸桿菌病是雞感染致病性大腸桿菌后所引發(fā)的局部或者全身性敗血癥癥狀的疾病，臨床菌株易對抗生素藥物產(chǎn)生耐藥性，實驗數(shù)據(jù)表明，除頭孢喹肟和硫酸粘菌素外，大多數(shù)臨床分離株都對所選藥物產(chǎn)生一定耐藥；藥敏試驗表明，復方類抗生素相比單方抗生素對大腸桿菌病的治療效果要明顯；臨床上遇到本病時建議在成本可控的范圍內(nèi)采用復方類抗生素或聯(lián)合用藥的方案進行治療。

雞；大腸桿菌；藥敏試驗；耐藥性；分析

大腸桿菌為革蘭氏染色呈陰性、中等大小的桿菌，需氧或微厭氧，在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上可長成紅色菌落，在伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基上形成黑色帶金屬光澤的菌落。目前針對大腸桿菌病的防治措施是使用抗菌藥物。由于抗生素大量使用以及耐藥菌株的不斷增加，大腸桿菌感染的趨勢不但沒有下降反而有所上升，給廣大養(yǎng)殖戶帶來較大損失。筆者通過對全國規(guī)?；B(yǎng)殖場的疑似大腸桿菌病的發(fā)病雞進行菌株分離鑒定，經(jīng)藥敏試驗篩選出對大腸桿菌敏感的藥物供大家選擇，并就雞源大腸桿菌的耐藥情況給大家作一下交流。

1 本病流行特點及防治現(xiàn)狀

雞大腸桿菌病是臨床嚴重危害養(yǎng)雞業(yè)的細菌病之一，可導致雞急性敗血癥、氣囊炎、關(guān)節(jié)滑膜炎、全眼球炎、輸卵管炎、腹膜炎、臍炎和腫頭腫臉綜合征等病癥，尤其以蛋雞和雛雞發(fā)病更為嚴重。雞感染后，一般不單獨發(fā)病，往往繼發(fā)于新城疫、馬立克氏病、傳染性支氣管炎等病毒性疾病。本病發(fā)病率較高。在雞群中可達11～69%，死亡率為3.2～72.9%，給養(yǎng)殖戶帶來較大的經(jīng)濟損失。

上世紀50年代禽致病性大腸桿菌幾乎沒有耐藥性，60年代的分離株對鏈霉素、四環(huán)素產(chǎn)生耐藥性，70年代對氨芐西林，氯霉素，磺胺甲基異惡唑等產(chǎn)生耐藥性，80年代至90年代對阿莫西林、慶大霉素、卡那霉素、萘啶酸、頭孢噻吩等產(chǎn)生耐藥性。隨著時間推移，大腸桿菌的耐藥率大幅度上升，多重耐藥菌株劇增，耐藥譜增寬。

2 臨床菌株的分離以及藥敏試驗

對來自全國各地區(qū)的疑似雞大腸桿菌病的病例進行臨床診斷，并無菌采集典型患雞的心、肝、脾、十二指腸等病料進行分離鑒定和藥敏試驗，具體過程如下。

2.1 分離培養(yǎng)

取病料無菌操作，分別畫線接種于血平板、伊紅美藍和麥康凱培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～24h，觀察單個菌落的生長情況。

2.2 進一步分離純化

挑取單個菌落接種至伊紅美藍和麥康凱培養(yǎng)基上進一步分離純化，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～24h后觀察結(jié)果。

2.3 涂片染色鏡檢

取分離純化后的單個菌落進行涂片，革蘭氏染色，在油鏡下觀察細菌的形態(tài)及染色特性。

2.4 菌液配置

取分離純化后的單個菌落，無菌接種于2ml的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中37℃震蕩培養(yǎng)16h得到菌液。

2.5 藥敏試驗

按K2B紙片擴散法將被檢細菌無菌接種于普通瓊脂平板上，間隔一定距離，然后用無菌鑷子將藥敏紙片放于固體培養(yǎng)基表面并輕壓，使紙片與培養(yǎng)基表面完全緊貼。避免出現(xiàn)抑制圈重疊。一般各紙片中心相距應(yīng)大于24mm，可在平皿中央貼一片，外周等距離貼4片。貼完紙片的平皿靜置15min后再置于37℃溫箱中培養(yǎng)24h，觀察并記錄抑菌圈的直徑，結(jié)果判斷依據(jù)《紙片法抗菌藥物敏感試驗操作標準（第4版）》進行。

3 臨床菌株的鑒定及耐藥判定

3.1 菌落的形態(tài)及培養(yǎng)特征

在麥康凱和伊紅美藍培養(yǎng)基上在分離出呈圓形、邊緣整齊、隆起、呈紫黑色并帶有金屬光澤的菌落，在麥康凱培養(yǎng)基上形成中等大小、表面光滑濕潤的紅色菌落，符合大腸桿菌的菌落特征。

3.2 鏡檢特征

取單個菌落，涂片，經(jīng)革蘭氏法染色，普通光學顯微鏡下觀察，可見視野中的菌落均為兩端鈍圓，多數(shù)散在排列的革蘭氏陰性桿菌。

3.3 藥敏判定標準

將符合上述特征的菌株收集并進行藥敏試驗，依據(jù)抑菌圈直徑的大小來判定藥敏結(jié)果，敏感度根據(jù)表1來進行判斷。

表1 藥敏試驗敏感性判定標準

4 結(jié)果及分析

4.1 單方藥物的藥敏結(jié)果及分析

本次試驗分別對江蘇、廣東、北京、河南、河北等17個省市地區(qū)的130株大腸桿菌陽性菌株，選取市場上常見的治療大腸桿菌的抗生素進行藥敏試驗，結(jié)果如表2所示。其中，臨床分離的130株大腸桿菌，對阿莫西林、氨芐西林、林可霉素和氟苯尼考的耐藥率都達到了100%，頭孢喹肟對大腸桿菌最敏感，高敏菌株比例達100%，這可能與頭孢喹肟為四代頭孢類藥物，上市時間短且價格昂貴造成普及率不高有關(guān)；其次為硫酸粘菌素，硫酸黏菌素對敏感菌的細胞膜具有較強的吸附作用，使細胞膜的表面張力降低，通透性增加，細胞膜破裂，菌體內(nèi)物質(zhì)外漏，導致細菌死亡；大觀霉素不具有高敏作用，中敏率為63.8%，耐藥率為36.2%。因此，從價格和藥物敏感性來講，單方藥物治療大腸桿菌病時，可優(yōu)先選用硫酸粘菌素。

表2 單方藥物藥敏試驗結(jié)果

4.2 復方藥物的藥敏結(jié)果及分析

復方藥物通常指含有本身無抗菌活性但可增加主藥敏感性的活性成分，如舒巴坦本身無抗菌活性，但與內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)用后藥效增強幾倍甚至幾十倍。復方藥物的藥敏試驗結(jié)果如表3所示，可以看出，阿莫西林與克拉維酸合用后可使大腸桿菌對阿莫西林的耐受性從100%降低到6.9%，頭孢噻呋與舒巴坦合用可使大腸桿菌對藥物的耐受性從83.3%降低到30%，頭孢哌酮與他唑巴坦合用可使大腸桿菌對藥物的耐受性從63.3%降低到15%，氨芐西林與舒巴坦合用可使大腸桿菌對藥物的耐受性從100%降低到26.9%。阿莫西林西林克拉維酸合用對大腸桿菌的效果最好，頭孢噻呋舒巴坦合用，以及頭孢哌酮他唑巴坦合用效果也理想，但考慮到頭孢類產(chǎn)品價格較貴，宜首選阿莫西林克拉維酸。氨芐西林與舒巴坦與合用后效果不如其他3種方案，原因可能是有些大腸桿菌臨床菌株對其敏感性并未完全恢復，同時也表明雞大腸桿菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥機制可能不止一種。

表3 復方藥物藥敏試驗結(jié)果

4.3 聯(lián)合用藥對大腸桿菌臨床菌株的敏感性分析

兩種或兩種以上藥物同時使用，不僅可以增加抗生素對大腸桿菌的敏感性，還可以降低抗生素的用藥量。本試驗將阿莫西林與硫酸粘菌素、林可霉素與大觀霉素，氟苯尼考與多西環(huán)素，硫酸粘菌素與恩諾沙星等幾種抗生素兩兩聯(lián)合用藥后，對大腸桿菌臨床菌株產(chǎn)生明顯的抑制作用，結(jié)果如表4所示，可以看出阿莫西林與硫酸粘菌素、林可霉素和大觀霉素、氟苯尼考與多西環(huán)素、硫酸粘菌素與恩諾沙星合用以后，比各個藥物單用效果要好，聯(lián)用以后呈協(xié)同作用，尤其以硫酸粘菌素和恩諾沙星合用效果最佳，比各個藥物單用效果增強20多倍，雖然硫酸粘菌素單用時效果也很好，但是其對腎臟和神經(jīng)系統(tǒng)有一定副作用，因此，將硫酸粘菌素和其他抗生素聯(lián)合用藥，不僅可以增強療效，還可以減輕副作用，降低用藥成本。

表4 聯(lián)合用藥藥敏試驗結(jié)果

5 討論

從全國分離的菌株藥敏試驗結(jié)果來看，雞源大腸桿菌都易產(chǎn)生不同程度的耐藥性，許多抗生素逐漸低效或無效，臨