馬吉云 （青海省創(chuàng)業(yè)發(fā)展孵化器有限公司 810003）

一起牦牛病毒性腹瀉病原學(xué)診斷

馬吉云 （青海省創(chuàng)業(yè)發(fā)展孵化器有限公司 810003）

青海省祁連縣某牦牛養(yǎng)殖場發(fā)生以腹瀉為主要特征的疾病，傳播迅速，發(fā)病率為100%，初步懷疑為牦牛病毒性腹瀉，為此采集了2腹瀉樣本，采用Trizol方法提取腹瀉糞便的總RNA，利用我們設(shè)計(jì)合成的引物采用RT-PCR方法進(jìn)行病原檢測，結(jié)果得出這兩腹瀉樣本均擴(kuò)增出病毒性腹瀉病原產(chǎn)物，測序結(jié)果表明該場犢牦牛腹瀉由牦牛病毒性腹瀉病原引起。

病毒性腹瀉；病原；牦牛

牛病毒性腹瀉病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV），又稱牛病毒性腹瀉/黏膜病毒 (Bovine Viral Diarrhea/Mucosal Disease Virus，BVDV/MDV），在分類學(xué)上屬于黃病毒科 (Flaviviridae），瘟病毒屬 (Pestivirus）BVDV感染牛后，能引起牛的多種臨床，如高熱，白細(xì)胞減少，沉郁，厭食，下痢，大量流涎，減奶以至停奶，消化道黏膜糜爛，壞死，胃腸炎，孕牛流產(chǎn)或產(chǎn)出崎形胎兒等[1-3]。目前，犢牛腹瀉已經(jīng)成為危害養(yǎng)牛業(yè)的一種重要疾病，犢牛腹瀉主要癥狀表現(xiàn)為消化道病變，該病一年四季均可發(fā)生，尤以氣候交替的初春和夏秋季節(jié)多發(fā)，引起犢牛腹瀉的因素眾多，既有病毒、細(xì)菌和寄生蟲等病原引起的感染性因素也有由營養(yǎng)和環(huán)境原因造成的非感染性因素[4-5]。其中，病原微生物感染是造成犢牛腹瀉的重要原因，常見的引起犢牛腹瀉的病原主要有輪狀病毒、牛冠狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒而又以BVDV最為常見[6-7]，這幾類病原的臨床癥狀和病理變化及其相似，現(xiàn)場難以確診，需要進(jìn)行試驗(yàn)的檢測來進(jìn)行確認(rèn)。本試驗(yàn)對青海省祁連縣某牦牛養(yǎng)殖場的兩腹瀉樣本進(jìn)行BVDV的RTPCR檢測，從而確診了引起該場犢牛腹瀉的主要病原為BVDV，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 樣本

樣本為兩份發(fā)病犢牦牛腹瀉糞便 (無菌采集），2017年3月采于青海省祁連縣某養(yǎng)殖場的3月齡發(fā)病犢牦牛，臨床表現(xiàn)為腹瀉，脫水，糞便呈灰白色或深綠色糞便，帶有血便。

1.2 試劑

BVDV oregonC24V，YAK毒株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。IPTG、Amp、RT-PCR試劑盒、Trizol均購自寶生物工程有限公司，微量膠回收試劑盒購自北京天根試劑公司，DEPC試劑購自Sigema生物公司。

1.3 參考毒株

BVDV oregonC24V，YAK毒株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

參照NCBI上發(fā)表的BVDV毒株基因組序列比對結(jié)果，采用生物信息學(xué)軟件primer5.0設(shè)計(jì)一對引物，引物命名為F1，F(xiàn)2。引物由寶生物工程有限公司合成。

F15'AGGCTAGCCATGCCCTTAGTAG 3'，F(xiàn)25'TGTGCCATGTACAGCAGAGATT 3'。

1.5 RT-PCR及產(chǎn)物檢測

應(yīng)用Trizol試劑盒稍加改動(dòng)提取方法，提取腹瀉糞便及標(biāo)準(zhǔn)毒株的總RNA，以Random 6 mers為隨機(jī)引物，按照RT-PCR試劑盒書進(jìn)行cDNA合成，產(chǎn)物作為cDNA為模板，以F1、F2作為引物進(jìn)行PCR的擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：10*PCR Buffer Ⅱ5ul， DNTP Mixture 2ul， F11.0ul， F2， 1.0ul，TaRaPa ExTaqTMHS，0.5ul，cDNA模板5ul，滅菌超純水 up to 50ul。擴(kuò)增條件：PCR擴(kuò)增條件為：94℃1min，94℃30s，56℃30s， 72℃30s， 總計(jì) 40 個(gè)循環(huán)， 72℃10min。 取 5μlPCR產(chǎn)物以5V/cm的恒定電壓于10g/L的瓊脂糖凝膠中電泳。

1.6 PCR產(chǎn)物的純化及測序

采用天根公司微量膠回收試劑盒純化PCR預(yù)期產(chǎn)物，純化產(chǎn)物送至生物工程 (上海）股份有限公司測序。

2 結(jié)果

電泳結(jié)果顯示，在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳中標(biāo)準(zhǔn)毒株及糞便提取總RNA均擴(kuò)增出約280bp的條帶，結(jié)果見圖。將擴(kuò)增出的陽性產(chǎn)物送至生物工程 (上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果表明，發(fā)病犢牛的病原為BVDV，其與NCBI上所登錄的BVDV序列同源性最高為98%，參見附圖。

附圖 BVDVPCR擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

(1）實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果結(jié)合臨床癥狀分析，本次祁連縣養(yǎng)殖場的犢牦牛腹瀉病是由牦牛BVDV和ETEC所致。

(2）2016年陳新諾等[8]對青藏高原地區(qū)4個(gè)省的牦牛腹瀉樣本進(jìn)行BVDV病原流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)BVDV感染在青藏高原地區(qū)的牦牛中普遍存在。格松[9]對2014～2015年青海玉樹地區(qū)的血清學(xué)調(diào)查資料顯示，目前牛群存在BVDV較高的抗體陽性率，且已相當(dāng)嚴(yán)重，并且有日益嚴(yán)重的趨勢。

(3）BVDV在牛群中的潛伏感染常常導(dǎo)致該病很難凈化。該病可以通過母牛垂直傳播，感染BVDV的母牛會(huì)出現(xiàn)產(chǎn)死胎及弱仔現(xiàn)象，嚴(yán)重影響規(guī)模養(yǎng)牛場的發(fā)展。首先加強(qiáng)對新購牛的檢疫，最好堅(jiān)持自繁自養(yǎng)，對引進(jìn)的犢牛一定要做好BVDV抗體檢測工作，及時(shí)淘汰BVDV陽性感染牛成為該病綜合防控的重要方法。血清抗體檢測呈陰性方可飼養(yǎng)。防治BVDV最有效的手段就是牛群凈化，將BVDV陽性牛逐步淘汰。同時(shí)，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，經(jīng)常消毒，保持良好的環(huán)境衛(wèi)生，經(jīng)常清理養(yǎng)牛場的糞便，保持牛舍通風(fēng)良好。該病重在預(yù)防，發(fā)病后目前主要采取對癥治療措施，及時(shí)補(bǔ)液防止脫水。

[1]劉亞剛,殷中瓊,劉世貴,等.牦牛病毒性腹瀉/粘膜病的防制研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2003,25(6):487-490.

[2]Heinz F X,Collet M Sprucely R H,et al.Family Flavored.In“Virus Taxonomy”.Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Virus”[M].Academic press.San Diego,2000:859-878.

[3]Collet M S,Wiskerchen M,Welniak E,et al.Bovine viral diarrhea virus genomic organization[J].Arch virol Suppl,1991,3:19-27.

[4]Bartels C J,Holzhauer M,Jorritsma R,et al.Prevalence,prediction and risk factors of en-teropathogens in normal and non-normal faeces of young Dutch dairy calves[J].Preventive Veterinary Medicine,2010,93(2/3):162-169.

[5]Izzo M M,Kirkland P D,Mohler V L,et al.Prevalence of major enteric pathogens in Australian dairy calves with diarrhea[J].Australian Veterinary Journal,2011,89(5):167-173.

[6]Soltan M A,Wilkes R P,Elsheery M N,et al.Circulation of bovine viral diarrhea virus-1 （BVDV-1）in dairy cattle and buffalo farms in Ismailia province,Egypt[J].Journal of Infection in Developing Countries,2015,9(12):1331-1337.

[7]Yong-Il Cho,Won-Il Kim,Siyuan Liu,et al.De-velopment of a panel of multiplex real-time polymerase chain reaction assays for simultaneous detection of major agents causing calf diarrhea in feces[J].J.Vet.Diagn.Invest,2010,22(7):509-517.

[8]陳新諾,張朝輝,徐林,等.青藏高原牦牛感染BVDV和BEV的分子流行病學(xué)調(diào)查[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2016,37(9):35-38.

[9]格松.青海省玉樹地區(qū)牛病毒性腹瀉病的血清學(xué)調(diào)查[J].中國動(dòng)物保健,2016,18(7):10-11.

馬吉云 （1982-）男，青海省西寧市人，碩士研究生，研究方向：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)。