陳利青，王雄，郭展，魏東，禾璐，候蕊，韓淵懷,5*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 玉米研究所，山西 忻州 034000；4.山西省晉城市城區(qū)農(nóng)業(yè)委員會(huì)，山西 晉城 048400;5.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物工程研究所，山西 太谷 030801)

硝酸鹽誘導(dǎo)蛋白與谷子抗旱性的關(guān)系研究

陳利青1，王雄2，郭展2，魏東2，禾璐3，候蕊4，韓淵懷2,5*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 玉米研究所，山西 忻州 034000；4.山西省晉城市城區(qū)農(nóng)業(yè)委員會(huì)，山西 晉城 048400;5.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物工程研究所，山西 太谷 030801)

[目的]硝酸鹽誘導(dǎo)蛋白(NOI)是一類重要的抗逆蛋白，在多種植物中發(fā)揮作用。谷子作為重要的旱作植物，在農(nóng)作物生產(chǎn)中占有重要地位，探究谷子中NOI與抗旱性的關(guān)系，對(duì)發(fā)掘谷子抗旱相關(guān)基因具有重要意義。[方法]運(yùn)用生物信息學(xué)方法，對(duì)谷子中編碼NOI的基因進(jìn)行分析，并在PEG干旱脅迫下，探究抗旱品種勾勾母雞咀(GG)和干旱敏感品種晉汾16(JF16)中編碼硝酸鹽誘導(dǎo)蛋白(NOI)的基因的相對(duì)表達(dá)情況。[結(jié)果]編碼NOI的基因的啟動(dòng)子中存在與干旱相關(guān)的響應(yīng)元件。在PEG干旱脅迫處理與非脅迫處理?xiàng)l件下，勾勾母雞咀(GG)和晉汾16(JF16)中編碼NOI的基因的表達(dá)模式差異顯著。[結(jié)論]基于上述分析，推測(cè)硝酸鹽誘導(dǎo)蛋白(NOI)可能參與谷子的抗旱調(diào)節(jié)，為深入研究谷子抗旱機(jī)理提供了理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

谷子；NOI；抗旱性

Abstract:[Objective]Nitrate-induced protein(NOI)is an important protein related to stress and works in variety of plants. As an important drought-tolerance crop, foxtail millet plays a significant role in crop production, so it is important sense to explore the connection between NOI and drought tolerance and the unique genetic resources.[Methods]Using bioinformatics,we analysed the genes coding NOI and studied the relative expression level in the drought-tolerant variety Go Go Mu Ji Ju (GG) and the drought sensitive variety Jin Fen 16 (JF16).[Results]The results showed that there were response elements associated with drought response in the gene’s protein promoter. Under PEG stress, Go Go Mu Ji Ju (GG) and Jin Fen 16 (JF16),showed a strikingly different expression pattern.[Conclusion]Based on the analysis above, we speculate that NOI could be involved in the regulation of drought tolerance in foxtail millet and have a different expression in varieties of foxtail millet. The study could provide a theoretical basis and foundation for further study of drought tolerance in foxtail millet.

Keywords:Foxtail millet, NOI, Drought tolerance

谷子(Setariaitalica)，禾本科狗尾草屬，一年生草本植物，原產(chǎn)于中國(guó)，是喜溫、短日照耐旱作物，常種植于我國(guó)北方地區(qū)[1]。隨著全球氣候逐漸變暖，干旱問題日趨凸顯，對(duì)糧食生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅。谷子作為一種耐旱作物，在可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展中地位日益突出。

硝酸鹽誘導(dǎo)蛋白(Nitrate-induced protein，NOI)廣泛存在于植物中，現(xiàn)已證明NOI參與多種植物抗逆性免疫機(jī)制。例如，RIN4的C末端和N末端的NOI域，包含兩個(gè)保守序列(PXFGXW and Y/FTXXF)，位于C末端PXFGXW含有AvrRpt2可識(shí)別切割位點(diǎn)(RCS)[2]，而AvrRpt2裂解RCS2與RPS2活化誘導(dǎo)及囊泡運(yùn)輸相關(guān)[3,4]，AvrRpt2還誘導(dǎo)激活ETI，從而增強(qiáng)PTI(PAMP-triggered immunity)反應(yīng)[5]。當(dāng)RPM1介導(dǎo)ETI時(shí)，需要C末端NOI域參與[6]。除此之外，NOI還參與氣孔調(diào)節(jié)，通過控制細(xì)胞膜上H+-ATPases 活性控制氣孔開合大小[7]。當(dāng)H+-ATP酶活性降低時(shí)，氣孔關(guān)閉，PTI應(yīng)答增強(qiáng)，從而提高植物防御。

目前，在水稻，擬南芥[8]和大豆[9,10]等植物中，均發(fā)現(xiàn)存在NOI，并在抗逆性方面發(fā)揮重要作用，而關(guān)于NOI在谷子抗逆中的作用還缺乏研究。本文通過在PEG模擬干旱脅迫下，NOI在勾勾母雞咀(GG，干旱品種)和晉汾16(JF16，干旱敏感品種)2個(gè)谷子品種的表達(dá)情況，探究該蛋白在谷子抗旱中的作用，為深入探索谷子抗旱機(jī)制奠定一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

本文研究材料勾勾母雞咀(GG，干旱品種)及晉汾16(JF16，干旱敏感品種)均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究所提供。

1.2 研究方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析方法

利用Phytozomev12.0獲取谷子參考基因組豫谷1號(hào)中編碼NOI的基因序列信息。

利用plantCARE對(duì)編碼NOI的基因起始密碼子上游1 500 bp核苷酸序列進(jìn)行啟動(dòng)子元件分析。

利用DNAMAN 6.0預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)等理化性質(zhì)。

利用軟件MEGA 7.0構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.2 試驗(yàn)材料

在人工氣候室中，將勾勾母雞咀和晉汾16放置在營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石=3∶1混合的基質(zhì)中培植，出苗前，進(jìn)行光培養(yǎng)(14 h光照/28 ℃)和暗培養(yǎng)(10 h黑暗/23 ℃)。出苗后每周澆3次蒸餾水，3周后，釆用20% PEG-6000模擬干旱脅迫，處理材料0.5 h，對(duì)照用蒸餾水處理，每個(gè)處理取3株用于RNA的提取，進(jìn)行表達(dá)譜測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子中編碼NOI的基因的序列分析

利用水稻中NOI的氨基酸序列在豫谷1號(hào)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行blast比對(duì)，找到谷子中同源性較高的編碼NOI的基因序列。如表1所示，Seita.8G049900.1，Seita.8G049900.2和Seita.8G049900.3來(lái)自于同一基因，由于mRNA剪切位點(diǎn)不同，出現(xiàn)3種轉(zhuǎn)錄本和核心編碼序列，其差異出現(xiàn)在基因序列的起始端，而Seita.9G012000.1 和Seita.9G012000.2序列差異出現(xiàn)在末端。編碼硝酸鹽誘導(dǎo)蛋白(NOI)的基因的分布存在差異，位于第6，第8，第9號(hào)染色體上，且位于8號(hào)染色體的居多。5個(gè)基因中，基因組長(zhǎng)度不一，介于2 739～15 523 bp間，最長(zhǎng)的為Seita.8G039500.1，長(zhǎng)度為15 523 bp，最短的為Seita.6G219800.1和Seita.6G219800.2，長(zhǎng)度為2 739 bp。核心編碼區(qū)長(zhǎng)度在702～6 633 bp之間。其中，核心編碼區(qū)長(zhǎng)度最長(zhǎng)的是Seita.8G039500.1，為6 633 bp，核心編碼區(qū)最短長(zhǎng)度為702 bp，是Seita.6G219800.2。從表1中可看出，除Seita.8G049900.3外，其他基因組長(zhǎng)度與編碼蛋白長(zhǎng)度呈正相關(guān)性。除此之外，外顯子數(shù)目也存在差異，在7～10個(gè)之間。

2.2 谷子中編碼NOI的基因理化性質(zhì)分析

從表2可以看出，5個(gè)基因的氨基酸序列長(zhǎng)度存在明顯的差異，在233～2 210 aa之間，其中Seita.8G039500.1的氨基酸序列最長(zhǎng)，為2 210 aa，Seita.6G219800.2氨基酸序列最短，為233 aa。NOI分子量介于0.245 981～2.500 000 kDa間，其中分子量最大的是Seita.8G039500.1，為2.488 738 kDa，分子量最小的是Seita.6G219800.2，為0.245 981 kDa。編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列長(zhǎng)度與分子量呈正相關(guān)。理論等電點(diǎn)(PI)跨度較大，介于6.50～9.74之間，最大的是Seita.6G219800.1和Seita.6G219800.2，為9.74，最小的為Seita.8G089100.1，為6.50。

表1 谷子中編碼NOI的基因基本信息Table 1 Basic information of the genes coding NOI in foxtail millet

表2谷子中編碼NOI的基因基本結(jié)構(gòu)分析
Table2 Primary structure analysis of the genes coding NOI in foxtail millet

基因名稱Genename氨基酸個(gè)數(shù)Aminoacidnumber分子量/kDaMolecularweight理論等電點(diǎn)/PIIsoelectricpointSeita.8G049900.113991.5661616.85Seita.8G049900.212421.3904137.07Seita.8G049900.312071.3512946.81Seita.8G089100.113581.5146656.50Seita.8G039500.122102.4887386.99Seita.9G012000.12390.264649.55Seita.9G012000.22390.264649.55Seita.6G219800.12340.2472629.74Seita.6G219800.22330.2459819.74

2.3 不同物種中NOI進(jìn)化樹分析

圖1是不同物種間的NOI的蛋白序列運(yùn)用MEGA7軟件制作的進(jìn)化樹。從圖1可看出，進(jìn)化樹主要有2個(gè)分支，然后又逐漸分成很多小枝:第一分支主要包括谷子(Seita.6G219800.1，Seita.6G219800.2，Seita.9G012000.1，Seita.9G012000.2)，矮牽?；?AAQ10002.1)，玉米(NP_001148391.2)，蓖麻(EEF30175.1)，蠶豆基因(BAJ78239.1)，擬南芥(OAO91965.1)；第二分支由谷子(Seita.8G049900.1，Seita.8G049900.2，Seita.8G049900.3，Seita.8G039500.1，Seita.8G039500.2)和水稻(Os09g0253000)。圖中也可以看出Seita.8G049900基因，Seita.9G012000基因和Seita.6G219800基因由于可變性剪切產(chǎn)生多種不同的基因片段。

圖1 不同物種NOI進(jìn)化樹分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of NOI in different species

2.4 谷子中編碼NOI的基因啟動(dòng)子元件分析

綜合表3、表4可以看出，這些基因中，除大量基本應(yīng)答元件外，還有許多不同類型的抗逆應(yīng)答元件，如干旱相關(guān)的MYB結(jié)合位點(diǎn)MBS，脅迫響應(yīng)相關(guān)的元件TC-rich repeats，以及各種激素響應(yīng)元件ABRE(脫落酸響應(yīng)元件、TGACG-motif(茉莉酸甲酯響應(yīng)元件)，TCA-element(水楊酸響應(yīng)元件)等。其中光應(yīng)答元件最多(10～24個(gè))，其次是逆境脅迫相關(guān)元件。由于基因不同，其含有的與抗旱相關(guān)元件種類與數(shù)目存在差異。5個(gè)基因中，Seita.8G049900中含有的總元件數(shù)目最多，為119個(gè)。Seita.8G039500.1最少，為79個(gè)。Seita.8G049900不含與MeJA，ETH和GA相關(guān)的應(yīng)答元件；Seita.8G089100.1，Seita.8G039500.1中都不含有IAA應(yīng)答元件。在這些基因中，Seita.6G219800含有與脅迫相關(guān)的調(diào)控元件的數(shù)目最多，Seita.9G012000最少。

表3 谷子中編碼NOI的基因啟動(dòng)子元件分析Table 3 The promoter element analysis of the genes coding NOI in foxtail millet

表4 啟動(dòng)子順式元件Table 4 Promoter cis elements

2.5谷子Seita.8G049900.1基因在GG和JF中干旱脅迫后的表達(dá)模式分析

從圖2中可看出，勾勾母雞咀在干旱情況下Seita.8G049900.1基因表達(dá)水平高于正常情況下的表達(dá)水平29倍；而在晉汾16中，干旱情況下Seita.8G049900.1基因的表達(dá)水平較正常情況下低29倍。正常情況下，Seita.8G049900.1在晉汾16中的表達(dá)水平是勾勾母雞咀中表達(dá)水平的30倍；干旱情況下，勾勾母雞咀的基因相對(duì)表達(dá)水平顯著提高，而晉汾16中Seita.8G049900.1基因相對(duì)表達(dá)水平出現(xiàn)明顯的下調(diào)，且此時(shí)Seita.8G049900.1在勾勾母雞咀中的表達(dá)水平是晉汾16中表達(dá)水平的30倍。

圖2 GG和JF16中Seita.8G049900.1的表達(dá)水平分析Fig.2 Expression level analysis of Seita.8G049900.1 gene in GG and JF16

3 討論與結(jié)論

NOI是植物中重要的抗逆蛋白。通過分析谷子中編碼NOI的基因序列，發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子序列中含有與抗逆相關(guān)的元件TC-rich repeats、干旱脅迫響應(yīng)相關(guān)的MYB結(jié)合位點(diǎn)MBS、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件、水楊酸響應(yīng)元件等。谷子具有較強(qiáng)的耐旱性，結(jié)合實(shí)際情況，推測(cè)谷子中存在抗旱調(diào)節(jié)機(jī)制。

通過試驗(yàn)在基因水平上分析谷子的抗旱機(jī)制。干旱情況下，勾勾母雞咀中編碼NOI的基因表達(dá)明顯上調(diào)，且超過正常澆水時(shí)表達(dá)的30倍；而在晉汾16中，正常澆水情況下，Seita.8G049900.1基因表達(dá)量較高，干旱情況下，Seita.8G049900.1基因表達(dá)明顯下調(diào)，說(shuō)明不同環(huán)境下，不同谷子品種中編碼NOI基因的表達(dá)模式不同。Afzal AJ[11]等人在研究NOI的免疫時(shí)發(fā)現(xiàn)不同試驗(yàn)條件下，每個(gè)NOI域具有不同的功能，且功能間表達(dá)情況不同[7]，這與本試驗(yàn)結(jié)果相一致，即在勾勾母雞咀和晉汾16的抗旱性的研究中發(fā)現(xiàn)，Seita.8G049900.1基因在2個(gè)品種中的表達(dá)量存在顯著差異，類比NOI的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，推測(cè)編碼NOI的基因在抗旱調(diào)節(jié)機(jī)制中表達(dá)具有差異，可能是由于末端NOI域作用不同引起的，具體調(diào)節(jié)機(jī)制需進(jìn)一步探究。同時(shí)，在試驗(yàn)中勾勾母雞咀和晉汾16在PEG脅迫和澆水情況下Seita.8G049900.1基因的表達(dá)趨勢(shì)相反，這與Kim MG, da Cunha L等人[7]的研究結(jié)果一致，表明其在作物中的表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制多樣化，為進(jìn)一步研究提供了理論基礎(chǔ)與試驗(yàn)依據(jù)。

綜上所述，通過試驗(yàn)預(yù)測(cè)谷子中編碼NOI的基因可能參與谷子對(duì)逆境的應(yīng)答，響應(yīng)脅迫，且不同NOI域在調(diào)節(jié)抗旱中功能各異，為深入研究谷子抗旱機(jī)理提供了理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

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(編輯：韓志強(qiáng))

Thepreliminarystudyabouttherelationshipbetweennitrate-inducedproteinanddroughttoleranceinfoxtailmillet

Chen Liqing1, Wang Xiong2, Guo Zhan2, Wei Dong2, He Lu3, Hou Rui4, Han Yuanhuai2,5*

(1.CollegeofLifeScience，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China；2.CollegeofAgriculture，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China；3.MaizeResearchInstitutetoShanxiAcademyofAgriculturalSciences，Xinzhou034000，China；4.UrbanAgricultureCommitteeofShanxiJincheng，Jincheng048400，China; 5.InstituteofAgriculturalBioengineering，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China)

S515

A

1671-8151(2017)10-0685-05

2017-05-02

2017-05-31

陳利青(1990-)，女(漢)，山西晉城人，碩士，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)

*通信作者：韓淵懷，教授，博士生導(dǎo)師，Tel：0354-6287239；E-mail：swgctd@163.com

國(guó)家自然科學(xué)基金(31371693)