劉克明，佟繼銘，祝晴晴，聶佳，劉永平

（承德醫(yī)學院中藥研究所/河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，河北承德 067000）

滿藥赤雹根總皂苷對Ⅱ型膠原性關節(jié)炎大鼠脾組織中CD3+、CD4+和CD8+表達的影響Δ

劉克明＊，佟繼銘，祝晴晴，聶佳，劉永平#

（承德醫(yī)學院中藥研究所/河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，河北承德 067000）

目的：研究滿藥赤雹根總皂苷（TSTR）對Ⅱ型膠原性關節(jié)炎（CIA）大鼠脾組織中T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+和CD8+表達的影響，探討TSTR治療類風濕性關節(jié)炎（RA）的機制。方法：隨機取8只大鼠作為正常對照組（NC組），其余72只大鼠尾根部及背部多點注射牛Ⅱ型膠原蛋白與弗氏完全佐劑的混合劑復制CIA模型。將成模的50只大鼠隨機分為模型組（MC組）、雷公藤多苷片（TG）組（12 mg/kg，陽性對照）和TSTR低、中、高劑量組（20、40、80 mg/kg），每組10只。給藥組大鼠連續(xù)ig給藥35 d，每天1次；NC組和MC組大鼠ig等體積蒸餾水。測定大鼠踝關節(jié)腫脹度，計算大鼠關節(jié)炎指數，蘇木精-伊紅染色后觀察大鼠滑膜組織病變，免疫組化法檢測大鼠脾組織中CD3+、CD4+和CD8+表達。結果：給藥35 d后，MC組大鼠的踝關節(jié)腫脹度、關節(jié)炎指數和脾組織中CD4+表達及CD4+/CD8+比值均顯著高于NC組（P＜0.05或P＜0.01），CD3+、CD8+表達顯著低于NC組（P＜0.05）；滑膜組織出現充血及大量炎癥細胞浸潤。各給藥組大鼠的踝關節(jié)腫脹度、關節(jié)炎指數、脾組織中CD4+表達及CD4+/CD8+比值均顯著低于MC組（P＜0.05），脾組織中CD3+、CD8+表達均顯著高于MC組（P＜0.05）；TG組和TSTR中、高劑量組大鼠滑膜組織出現輕度充血及少量炎癥細胞浸潤，TSTR低劑量組大鼠滑膜組織未見明顯充血或炎癥細胞浸潤。結論：上調脾組織中CD3+、CD8+的表達和下調脾組織中CD4+的表達可能是TSTR治療RA的作用機制之一；TSTR劑量為20 mg/kg時效果最好。

滿藥；赤雹根總皂苷；Ⅱ型膠原性關節(jié)炎；T淋巴細胞亞群；大鼠

ABSTRACTOBJECTIVE：To investigate the effect of total saponins of Man medicine Thladiantha dubia root（TSTR）on the expressions of CD3+，CD4+and CD8+in spleen tissue of rats with typeⅡ collagen-induced arthritis（CIA），and explore its mechanism in the treatment of rheumatoid arthritis（RA）.METHODS：8 rats were taken as normal control group（NC group），the others 72 rats were injected mixture of bovine type Ⅱ collagen and Freund’s complete adjuvant in tail and back to induce CIA model.The 50 modeled rats were randomly divided into model group（MC group），tripterygium polyglycoside（TG）group（12 mg/kg，positive control），TSTR low-dose，medium-dose，high-dose groups（20，40，80 mg/kg），10 in each group.Rats in medicine groups were intragastrically administrated for 35 d，once a day；rats in NC group and MC group were intragastrically administrated equal volume of distilled water.Ankle swelling degree of rats was determined，arthritis indexes were calculated，HE staining was used to observe the lesions in synovial tissue，and immunohistochemistry was used to detect the expressions of CD3+，CD4+，CD8+in spleen tissue of rats.RESULTS：After 35 d of administration，ankle swelling degree，arthritis indexes，CD4+expression in spleen tissue，and CD4+/CD8+ratio in MC group were significantly higher than NC group（P＜0.05 or P＜0.01），expressions of CD3+，CD8+were significantly lower than NC group（P＜0.05）；and there was congestion and massive inflammatory cell infiltration in synovial tissue.The ankle swelling degree，arthritis indexes，expression of CD4+in spleen tissue，and CD4+/CD8+ratio in administration groups were significantly lower than MC group（P＜0.05）；the expressions of CD3+，CD8+in spleen tissue in administration groups were significantly higher than MC group（P＜0.05）；TG group，TSTR medium-dose and high-dose groups showed mild congestion and a small amount of inflammatory cell infiltration in synovial tissue of rats，and TSTR low-dose group showed no obvious congestion or inflammatory cell infiltration.CONCLUSIONS：Up-regulating the expressions of CD3+，CD8+and down-regulating the expression of CD4+may be one of the mechanisms of TSTR in the treatment of RA；and with best efficacy when the TSTR dose of 20 mg/kg.

KEYWORDSMan medicine；Total saponins from Thladiantha dubia roots；TypeⅡ collagen-induced arthritis；T lymphocyte subsets；Rats

類風濕性關節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）是以慢性炎癥為主要表現的自身免疫性疾病。RA的全身性表現除了關節(jié)腫脹、變形、疼痛之外，還有發(fā)熱、皮下結節(jié)、心包炎、動脈炎和周圍神經病變等，其發(fā)病機制一直是國內外專家研究的重點。研究表明，RA的發(fā)生發(fā)展與細胞亞群失衡和免疫功能紊亂有著密切聯系[1]，T淋巴細胞亞群和B淋巴細胞亞群在RA的發(fā)病機制中起關鍵作用。關節(jié)組織中有大量T淋巴細胞浸潤，細胞免疫調節(jié)功能紊亂以致免疫應答失衡，是導致患者各組織病理損傷的重要因素[2]，其中T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+和CD8+的表達，能夠反映多種免疫細胞與RA間促炎/抗炎的平衡關系。

赤雹（Thladiantha dubia）屬葫蘆科多年蔓生草本植物，藥用部位為根，為滿族民間常用藥材。其具有抗炎、鎮(zhèn)痛的作用，多用于治療跌打損傷、腰腿痛、風濕痛等[3-4]，且無明顯的毒副作用。前期研究表明，赤雹根總皂苷（TSTR）對RA具有一定的改善作用[5]。在本研究中，筆者通過觀察TSTR對Ⅱ型膠原性關節(jié)炎（CIA）大鼠脾組織中T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+和CD8+表達的影響，進一步探討TSTR治療RA的相關機制。

1 材料

1.1 儀器

Nikon80i顯微鏡及攝像裝置（日本Olympus公司）；TDL-40B離心機（上海安亭科學儀器制造廠）；DNP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

TSTR（承德醫(yī)學院中藥研究所，批號：20150618，純度：55.2%）；雷公藤多苷片（TG，遠大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司，批號：110301，規(guī)格：0.2 mg/片）；牛Ⅱ型膠原蛋白（美國Chondrex公司，批號：150230）；弗氏完全佐劑（FCA，美國Sigma公司，批號：124K8942）；多聚甲醛（天津市風船化學試劑科技有限公司）；二甲苯、切片石蠟、無水乙醇（天津市福晨化學試劑廠）；大鼠CD4+一抗和小鼠CD3+、CD8+一抗（美國Santa Cruz公司，批號：SC7219、SC20047、SC53063）；兔抗大鼠免疫球蛋白G（IgG）免疫組化試劑盒、兔抗小鼠IgG免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號：201603、201602）；其余試劑均為國產分析純。

1.2 動物

SPF級Wistar大鼠80只，♂，8周齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2012-0001。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

大鼠先適應性飼養(yǎng)1周后，隨機取8只作為正常對照組（NC組），其余大鼠均ip 5%水合氯醛（1 mL/100 g）麻醉，剪去背部及尾根部的鼠毛，多點注射牛Ⅱ型膠原蛋白與FCA的混合制劑，以注射點周圍顯現白泡為佳，1周后再加強注射1次復制CIA模型。從造模后第21天開始，計算大鼠關節(jié)炎指數（AI）值，若AI≥6則表示造模成功。將造模成功的50只大鼠隨機分為模型組（MC組）、TG組（12 mg/kg）[5]和TSTR 低、中、高劑量組（20、40、80 mg/kg），每組10只。給藥組大鼠每天ig給藥1次，NC組和MC組大鼠ig等體積蒸餾水，連續(xù)給藥35 d。

2.2 踝關節(jié)腫脹度檢測

用游標卡尺測定造模后給藥前及給藥后7、14、21、28、35 d大鼠的左、右踝關節(jié)直徑（cm），并計算踝關節(jié)腫脹度：踝關節(jié)腫脹度（%）＝（造模組大鼠左、右踝關節(jié)直徑之和－NC組大鼠左、右踝關節(jié)直徑之和）/NC組大鼠左、右踝關節(jié)直徑之和×100%。

2.3 AI值的計算

[6]方法進行AI值的計算，評分標準為：無紅腫，記為0分；稍腫，記為1分；小趾關節(jié)及足跖關節(jié)可見腫脹，記為2分；踝關節(jié)以下部位足爪腫脹，記為3分；包括踝關節(jié)在內的明顯關節(jié)腫脹，記為4分。AI＝四肢肢體關節(jié)腫脹評分之和，最高得分為16分。

2.4 HE染色觀察大鼠膝關節(jié)滑膜組織病變

取大鼠膝關節(jié)滑膜組織，經梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋，制得5 μm厚切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察各組大鼠膝關節(jié)滑膜組織病變。

2.5 免疫組化法檢測大鼠脾組織中CD3+、CD4+和CD8+表達

取大鼠脾組織，用10%甲醛固定，24 h后組織常規(guī)脫水包埋蠟塊（3μm）；切片脫蠟至水，進行抗原修復、滅活內源性酶，然后按免疫組化試劑盒說明書操作，其中一抗為大鼠CD4+抗體和小鼠CD3+、CD8+抗體（1∶20），二抗為兔抗大鼠IgG抗體和兔抗小鼠IgG抗體。顯微鏡下觀察CD3+、CD4+和CD8+的表達（染色后細胞膜和胞漿中出現淡黃色或黃褐色為陽性表達），每張切片取5個不同視野，對積分光密度（IOD）值進行測定。

2.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數據分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 踝關節(jié)腫脹度的測定結果

與NC組比較，其余各組大鼠給藥前及給藥后不同時間踝關節(jié)腫脹度明顯升高（P＜0.01）；與MC組比較，各給藥組大鼠從給藥后第7天開始踝關節(jié)腫脹度均有不同程度降低；從給藥后第28天開始，各給藥組大鼠踝關節(jié)腫脹度均顯著降低（P＜0.01），結果見表1。

3.2 AI值的測定結果

與NC組比較，其余各組大鼠的AI值均顯著升高（P＜0.01）；與MC組比較，各給藥組大鼠從給藥后第7天開始AI值均有不同程度降低；從給藥后第14天開始，各給藥組大鼠的AI值均顯著降低（P＜0.01），結果見表2。

表1 各組大鼠踝關節(jié)腫脹度的測定結果（x±s，%%）Tab 1Determination results of ankle swelling degree in each group（x±s，%%）

表2 各組大鼠AI值的測定結果（x±s，分）Tab 2Determination results ofAI in each group（x±s，score）

3.3 膝關節(jié)滑膜組織病變的觀察結果

NC組大鼠膝關節(jié)滑膜組織正常，未見炎性病變；MC組大鼠膝關節(jié)滑膜組織細胞排列緊密、紊亂，并出現充血、大量炎癥細胞浸潤；TG組和TSTR各劑量組大鼠膝關節(jié)滑膜組織輕度充血，有少量炎性細胞浸潤，且以TSTR低劑量組改善最為明顯，結果見圖1。

圖1 各組大鼠膝關節(jié)滑膜組織的病理觀察結果（HE，×400）Fig 1 Pathological observation results of knee synovial tissue of rats in each group（HE，×400）

3.4 脾組織中CD3+、CD4+和CD8+表達測定結果

與NC組比較，其余各組大鼠脾組織中CD3+、CD8+表達水平均顯著降低（P＜0.05），CD4+水平和CD4+/CD8+比值均顯著升高（P＜0.05）；與MC組比較，TG組和TSTR各劑量組大鼠脾組織中CD3+、CD8+水平均顯著升高（P＜0.05），CD4+水平和CD4+/CD8+比值均顯著降低（P＜0.05），且以TSTR低劑量組指標變化最為明顯。測定結果見表3，免疫組化圖見圖2。

表3 各組大鼠脾組織中CD3+、CD4+和CD8+表達測定結果（x±s）Tab 3 Determination results of the expressions of CD3+，CD4+，CD8+in spleen tissue of rats in each group（x±s）

4 討論

本研究采用牛Ⅱ型膠原蛋白與FCA的混合劑造模，與RA患者的病理特征有許多相似之處[7]。TSTR生藥中總皂苷含量為3%，本研究以人與大鼠的體表面積進行換算，20、40、80 mg/kg分別相當于人臨床用0.5、1、2倍劑量。TG具有較強的抗炎及免疫抑制作用，臨床上主要用于治療RA等自身免疫性疾病，療效明顯，但其會對腎和生殖系統(tǒng)產生不可逆的損傷[8]，具體原因不詳。

圖2 各組大鼠脾組織中CD3+、CD4+和CD8+表達的免疫組化圖（×400）Fig 2 Immunohistochemistry figures of the expressions of CD3+，CD4+，CD8+in spleen tissue of rats in each group（×400）

RA的病理特征主要為各種炎癥細胞浸潤滑膜組織，隨后出現骨組織破壞，最終導致關節(jié)功能喪失。本研究發(fā)現，造模大鼠膝關節(jié)滑膜組織出現細胞排列紊亂、充血、炎癥細胞浸潤等炎癥病變，各劑量TSTR對CIA大鼠滑膜炎癥有顯著的緩解作用，且以低劑量TSTR作用效果最好。

脾作為人體最大的免疫器官，內含大量的淋巴細胞和巨噬細胞，是機體細胞免疫和體液免疫的中心。CD3+、CD4+和CD8+分子是存在于T淋巴細胞中具有顯著免疫作用的標志[9]。CD3+代表成熟的T淋巴細胞，其細胞水平可反映總的T淋巴細胞水平[10]。T淋巴細胞依據其作用的不同可分為輔助性T細胞和抑制性T淋巴細胞。CD4+為輔助性T淋巴細胞，源于胸腺，其高表達能使破骨細胞分化從而促進RA的發(fā)病[11]。CD8+發(fā)揮著抑制細胞及體液免疫的功能，具有細胞毒效應，能夠殺傷被感染的細胞[12]。本研究結果顯示，造模后大鼠脾組織中CD3+、CD8+水平顯著降低，CD4+水平和CD4+/CD8+比值顯著升高；給予不同劑量TSTR后，大鼠脾組織中上述指標均顯著改善，且以低劑量TSTR作用效果最好。

綜上所述，TSTR治療RA的機制可能與其下調脾組織中T淋巴細胞亞群CD4+表達、上調CD3+和CD8+表達、降低CD4+/CD8+比值有關。但實驗結果各指標均顯示，以TSTR給藥劑量為20 mg/kg時作用效果最為明顯，筆者推測這可能與以下因素有關：TSTR為本課題組自制，該批次樣品可能純度更高；TSTR成分復雜，其可能對不同指標的影響程度不同，但其具體原因有待進一步分析證實。

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Effects of Total Saponins of Man Medicine Thladiantha dubia Root on the Expressions of CD3+，CD4+and CD8+in Spleen Tissue of Rats with TypeⅡCollagen-induced Arthritis

LIU Keming，TONG Jiming，ZHU Qingqing，NIE Jia，LIU Yongping
（Institute of Chinese Materia Medica of Chengde Medical University/Key Laboratory of Research and Development for TCM in Hebei Province，Hebei Chengde 067000，China）

R285

A

1001-0408（2017）25-3541-04

2017-04-24

2017-06-15）

（編輯：林 靜）

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.25.23

河北省高等學校科學技術研究項目（No.ZD2016013）；河北省科技計劃項目（No.14272502D）

＊碩士研究生。研究方向：中藥學。E-mail：m18003244992@163.com

#通信作者：教授，博士生導師。研究方向：中藥藥理學。電話：0314-2291888。E-mail：lyp@cdmc.edu.cn